碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子对角膜中期保存液保存人角膜内皮细胞的影响

目的探讨碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)对中期保存角膜内皮细胞活性的影响。方法角膜中期保存液保存人角膜环,对照组为角膜中期保存液,实验组分为A、B、C、D组,分别为角膜中期保存液中加入bFGF(5ng/ml)、bFGF(20ng/ml)、EGF及bFGF+EGF,在保存角膜第3、7、14天后分别取保存角膜环复温观察,锥虫蓝茜素红联合染色检测角膜内皮活细胞率,电镜检测细胞超微结构的改变。结果保存角膜环第14天角膜内皮活细胞率,对照组为(10.35±1.32)%,A组为(62.18±1.56)%,B组为(92.57±0.90)%,C组为(71.01±2.67)%,D组(82.59±1.45)%,与对照组比较,各保存时间各实验组活细胞率均高,差异有统计学意义(P<0.01)。保存第14天,对照组保存的角膜环明显水肿、混浊不透明、内皮细胞形态结构不完整,超微结构显示角膜内皮细胞Y型连接断裂;而实验B、D组,保存的角膜环轻度水肿、后弹力层皱褶少、角膜透明度高、内皮细胞形态结构完整,超微结构显示保存角膜内皮细胞连接紧密,Y型连接无明显断裂,细胞表面可见较丰富的微绒毛,胞体大,核突起明显。结论bFGF和EGF在角膜中期保存液中均有促进细胞增殖、保持角膜细胞活性的作用,以bFGF作用更明显。     

bFGF对中期保存角膜细胞凋亡的抑制作用研究

目的探讨bFGF在中期保存角膜过程中对角膜细胞凋亡的影响,以期减少中期保存角膜细胞凋亡,为改良角膜中期保存液提供实验依据。方法配制中期保存液保存新西兰大白兔角膜,设对照组为保存液保存,实验组为保存液加入bFGF(10ng/ml),两组在30～34℃恒温条件下保存16～18h后,转入4℃低温保存,在保存3、5、7d分别取保存角膜片行30～34℃2h复温,固定、切片、TUNEL原位标记免疫荧光和电镜检测保存角膜细胞凋亡。结果加入bFGF组保存角膜水肿较轻,皱褶较少,透明度较高,角膜细胞形态和结构较好;bFGF组保存角膜与对照组比较细胞凋亡较少,差异有显著性(p<0.05)。结论中期保存角膜细胞会发生不同程度的细胞凋亡,导致细胞活性丧失;bFGF在中期角膜保存中有抑制和减轻角膜细胞凋亡发生,保持角膜细胞结构和功能的作用;bFGF可以应用于角膜中期保存。     

透明质酸钠联合抗氧化剂中期保存兔角膜

目的 研究透明质酸钠联合抗氧化剂(还原型谷胱甘肽和维生素C)在角膜中期保存中的作用,以探讨一种简便有效的角膜中期保存液,为临床应用提供动物实验依据.方法 以自制MK液为对照组,以添加透明质酸钠和抗氧化剂的改良MK液为实验组,分别对保存3d、7d、10d、14d的兔角膜行大体形态观察、角膜中央厚度测量、台盼蓝-茜素红联合染色及电镜观察.结果 应用透明质酸钠和抗氧化剂的各实验组保存的角膜均较对照组透明度好,水肿轻,电镜观察角膜内皮细胞连接紧密,活细胞百分率高,2组差异比较有显著性(P＜0.001).结论 透明质酸钠及抗氧化剂有减轻角膜组织损伤,保持细胞活性的作用,将2者联合应用于角膜中期保存液中,可显著提高保存效果.     

角膜中期保存液添加bFGF的质量浓度分析

目的研究角膜中期保存液中bFGF的不同质量浓度对保存角膜细胞活性的影响。方法配制角膜中期保存液，将其按所添加的bFGF的质量浓度分为0．1、1、10、20、50、100．g／ml 6个组；每组中期保存液随机保存6片新西兰大白兔角膜（4℃）；在保存3、5、7d分别取角膜片行30～34℃2h复温，台盼蓝-茜素红联合染色检测角膜内皮细胞活性；原位末端标记TUNEL法免疫荧光检测保存角膜细胞凋亡。结果保存角膜各组角膜内皮细胞活性率随保存时间延长而明显下降，TUNEL阳性细胞数明显增加（P〈0．01）；bFGF质量浓度为10、20、50ng／ml组角膜内皮细胞活性率较高，TUNEL阳性细胞数较少，3个组比较差异无统计学意义（P〉0．05），而与0．1、1、100ng／ml 3个组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论免角膜中期保存液中添加bFGF的质量浓度以20～50ng／ml为宜。     

硫酸软骨素在甘油冷冻液中对角膜内皮保护作用的实验研究

目的:探讨硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)在甘油冷冻保存角膜中对角膜内皮细胞(corneal epithelial cells,CEC)的保护作用。方法:Wistar大鼠角膜片40只随机分为实验组和对照组,对照组角膜片直接放入纯甘油中,实验组则在内皮面均匀黏附10g/L CS后再放入甘油中。-20℃保存2mo后行CEC台盼蓝-茜素红活性染色及电镜检查。取30只SD大鼠与保存后角膜片建立Wistar-SD同种异体穿透性角膜移植模型,测定术后不同时间点植片内TNF-α和IFN-γ的表达水平,检验保存效果。结果:台盼蓝-茜素红活性染色结果及术后植片内TNF-α和IFN-γ的表达结果显示,两组差异有显著性(P<0.05),实验组保存效果和角膜移植术后效果均优于对照组。电镜检查示,实验组CEC胞质内可见个别空泡,线粒体及内质网轻度肿胀;对照组CEC线粒体及内质网明显肿胀。结论:甘油冷冻能够保持CEC的活性,且CS能进一步增进保存效果。     

远程投送对中期保存兔角膜内皮细胞的影响

目的:探讨模拟运输状态下机械振动对中期保存角膜内皮细胞(CEC)活性的影响.方法:DX中期保存液保存兔角膜片7d,实验室用摇床模拟远程运输环境,按作用不同时间、不同振动强度进行分组,分别进行CEC活性染色和CEC酶组织化学染色,对比不同组间模拟运输对角膜内皮的影响.结果:实验条件下观察指标并不随振动强度和时间变化,组间各项指标差异无显著性.结论:实验室模拟远程投送对中期保存兔CEC无明显影响.     

甘油冷冻长期保存兔角膜内皮细胞的活性

目的:研究影响甘油低温冷冻长期保存角膜内皮细胞(CEC)效果的因素,探索甘油保存角膜的最佳模式。方法:根据不同甘油浓度、脱水速度和程度、降温速度、复温复水速度等随机将兔眼球或角膜片分为6组进行保存,每组又根据保存时间长短(0.5,2,6mo)不同分为3小组,每小组3只眼球或角膜片,直接浸入甘油保存液中按相应方法在-25℃冰箱冷冻室进行保存,保存到期后进行复温复水,行CEC锥蓝—茜素红活性染色以及扫描电镜和透射电镜检查以检验保存效果。结果:保存时间对保存效果有影响,保存6moCEC死亡率及异形细胞率高于0.5和2mo,保存0.5和2mo之间差异无显著性。高甘油浓度组、早期降温组以及快速复温复水组保存后有更低的CEC死亡率和异形细胞率;角膜片保存组与效果最好的眼球保存组在CEC死亡率、异形细胞率方面差异没有显著性,但其所受机械性损害小于各眼球组;在角膜片内皮面添加透明质酸钠可以减少甘油对CEC的不良影响,使CEC存活率在保存6mo后仍超过90%,细胞形态基本正常。结论:甘油冷冻法可以长期保存CEC的活性;高甘油浓度、早期的冷冻降温、快速复温复水以及采取保存角膜片的方法均有利于保存CEC的活性;透明质酸钠可以进一步减少甘油保存过程中对CEC的不良影响,明显提高保存效果。     

人胚胎视网膜短期、中期及长期保存的实验研究

目的 观察全层人胚胎视网膜的短期、中期及长期保存后的活性和结构。 方法12~24周全层人胚胎视网膜22例分为88片，明胶包被后分别行Ames液、中期保存液(DX角膜保存液)、-80 ℃、程序深低温4种方法保存不同时间后，台盼蓝染色观察视网膜神经上皮层活细胞百分率，光学显微镜和透射电子显微镜观察视网膜组织结构。 结果 人胚胎视网膜在新鲜取材时活细胞占(94.79±2.85)%；短期保存在Ames液4 h内活细胞百分率大于80%，中期保存在DX液1~2 d时活细胞百分率大于77%，均与新鲜取材时活细胞百分率无显著差异。-80 ℃保存7 d时活细胞百分率为(65.83±5.06)%，1个月时降至(57.54±16.18)％；深低温长期保存1个月时活细胞百分率为(69.46±9.31)%。全层人胚胎视网膜保存在Ames液2 h时光学显微镜和电子显微镜检查均未见明显异常；在DX液中2 d、-80 ℃7d和深低温1个月时光学显微镜检查见其层次清楚，但细胞间隙加大，组织排列疏松。 结论 全层人胚胎视网膜在Ames液和DX角膜保存液中可于一定时间内保持较好的活性和组织结构。     

羟乙基淀粉130/0.4对器官培养法保存兔角膜的脱水作用

目的：研究羟乙基淀粉的最新剂型HES 130/0.4对器官培养保存角膜的持续脱水效果。

方法：20对配对兔角膜,一半于含10% HES 130/0.4的ACF培养液中保存28d作为实验组,不再单独脱水; 另一半于ACF培养液中保存28d后再葡聚糖T500脱水48h作为对照组。内皮细胞活性和植片质量评估指标包括：内皮细胞计数、角膜厚度和含水量、角膜透明度和后弹力层皱褶程度、内皮层中肌动蛋白微丝(filament actin,F-actin)的表达,及透射电镜下内皮细胞超微结构的变化。

结果：保存结束时,实验组植片明显较薄,角膜透明度和皱褶程度也优于对照组,内皮细胞密度为2371±159个/mm²。对照组继续脱水后,角膜厚度、含水量和透明度与实验组间差别变小,内皮细胞密度却降至2138±182个/mm²。免疫印迹法证实F-actin在两组内皮层都有表达,实验组的F-actin表达水平更高。电镜下实验组的细胞超微结构改变较小。

结论：HES 130/0.4的细胞毒性小,可成为器官保存液中的持续添加组分,不仅避免角膜过度水肿,还简化了保存程序,减轻了感染风险,有希望成为新型角膜脱水剂。     

不同保存方法对角膜内皮细胞活性的影响

目的:探索简易安全的中长期保存供体角膜方法,评价不同保存方法保存后角膜内皮细胞活性,为临床提供优质角膜材料。方法:建立简易中期保存液,深低温保存法保存大鼠角膜。将30只鼠眼随即分为3组。分别为湿房保存,中期保存液和深低温保存。采用活性染色对角膜内皮细胞进行评价。判定3种方法保存的角膜内皮细胞的活性状态。结果:使用中期保存液和深低温保存后复温的角膜植片内皮细胞密度和活性率与湿房保存组比较差异无显著性(湿房组细胞密度个/mm2为2729.5±158.0,ESR%为88.9±3.5;中期保存组分别为2646.8±217.2和86.9±2.7;深低温组分别为2706.2±184和287.3±3.3,P>0.05)。结论:简易中期保存液和深低温保存后角膜具有较好的内皮细胞活性和临床应用价值。     

Optisol中期保存液房水置换对角膜内皮细胞的保护作用

目的:研究Optisol中期保存液房水置换对角膜内皮细胞的保护作用。方法:采用4℃湿房保存方法保存离体兔眼球,设立房水对照组、Optisol中期保存液房水置换组,每组10只眼球。于低温保存开始前、保存后24,48及72h检测角膜厚度、角膜内皮细胞密度及形态,保存后72h取下角膜行胎盘蓝-茜素红染色,检测角膜内皮细胞存活率。结果:4℃湿房保存开始前两组平均角膜厚度、角膜内皮细胞密度及六角形细胞比率差异没有统计学意义(P>0.05)。保存后24h两组平均角膜厚度、角膜内皮细胞密度及六角形细胞比率差异没有统计学意义(P>0.05);保存后48h及72h两组平均角膜厚度、角膜内皮细胞密度及六角形细胞比率差异有统计学意义(P<0.05)。保存后72h房水对照组角膜内皮细胞存活率为(55±5.81)%,Optisol中期保存液房水置换组角膜内皮细胞存活率为(87.16±3.64)%,两组间比较有统计学意义(P<0.05)。结论:Optisol中期保存液房水置换对角膜内皮细胞活性有保护作用,可以提高湿房保存法的效率,延长有效保存时间至72h。     

bFGF缓释微囊颗粒诱导角膜新生血管形成治疗兔大泡性角膜病变

目的:观察bFGF诱导角膜新生血管形成,对兔大泡性角膜病变的治疗作用。方法:采用0.5g/L苯扎溴铵溶液(BAKB)前房灌注复制兔大泡性角膜病变模型。然后将bFGF缓释微囊颗粒植入病变兔眼的角膜基质层间,诱导角膜新生血管生长,观察随角膜新生血管的形成,病变角膜水肿及大泡的改变。结果:在微囊颗粒植入后4wk病变角膜中央厚度2.61±0.25(CT),角膜水肿度评分0分,角膜新生血管评分0分,病变大泡呈吸收性改变。结论:大泡性角膜病变动物模型角膜基质层间植入bFGF缓释微囊颗粒,能够较为迅速的诱导角膜新生血管形成。同时,伴随CNV的生长,病变角膜的临床症状逐渐缓解。因此,该实验方法可能为大泡性角膜病变的治疗提供了另一种思路和方法。     

人脐带血清器官培养液保存猪角膜的实验研究

目的 观察胎牛血清器官培养液和人脐带血清器官培养液对猪角膜内皮细胞形态学、组织学、超微结构、酶活性及代谢等的影响。方法 器官培养方法：4周以内31℃密闭培养,之后脱水24h。选择猪眼113只,其中100只角膜分为两组进行配对器官培养保存。第1组(50只角膜)：应用培养液Ⅰ(含10％胎牛血清);第2组(50只角膜,第1组的对侧角膜)：应用培养液Ⅱ(含10％人脐带血清)。13只角膜作为正常对照。器官培养每周每组各取出12只角膜进行内皮细胞形态学分析、HE染色、酶组织化学染色。保存2周、4周时行扫描电镜检查。检测保存前后培养液的pH值和葡萄糖、乳酸浓度。器官培养过程中行微生物学检测。结果 器官培养期间角膜内皮细胞单层保持完整,多形性增加,两组之间角膜内皮细胞密度、细胞面积的变异系数和六边形细胞比例在保存4周内差异无显著意义。保存4周的猪角膜与正常猪角膜相比,平均内皮细胞丢失率第1组为10．98％,第2组为10．85％。两组角膜器官培养后的组织学、超微结构、酶活性无明显区别。扫描电镜显示内皮细胞层完整,细胞形态改变。酶组织化学染色显示上皮、内皮细胞酶活性旺盛,基质细胞的酶活性随保存时间的延长而降低。角膜代谢状态良好。器官培养液污染率为6％。结论 两种器官培养液均可以保持角膜内皮活性达4周,推测人脐带血清能够替代胎牛血清作为角膜器官培养液的成分。(中华眼科杂志,2004,40：533-538)     

兔角膜器官培养保存与应用的研究

目的探讨建立角膜器官培养保存的方法、保存后角膜的特性及其用于移植的可行性。方法选用特定的胎牛血清保存液,密闭保存36只成年新西兰兔角膜于32％恒温箱中;在保存后1～4周的不同时间点,将角膜从保存液取出转入高渗透压的脱水液中脱水48h备用;而后对比保存前后角膜内皮细胞密度、角膜厚度变化,并观测角膜内皮组织学特性和保存中污染情况;器官培养保存后的兔角膜做同种异体穿透性角膜移植,观测术后1周内植片情况;使用荧光标记的抗MHC-Ⅱ分子抗体标示保存后的角膜中树突状细胞,观测其分布和保存后变化特点。结果成功建立了角膜器官培养保存方法,保存中角膜的污染率约8．3％;保存4周内的兔角膜脱水后均透明;保存第3周时,角膜后弹力层周边区有细小皱褶;保存第4周时,全角膜有明显皱褶;器官培养保存的兔角膜内皮细胞密度随保存时间延长而下降,保存4周后兔角膜内皮细胞密度平均下降15．7％;兔角膜厚度随保存时间延长而增加,保存第4周时,角膜中央厚度可达0．7mm;组织学观察可见角膜内皮细胞与后弹力层贴附紧密;树突状细胞分布于角巩膜缘上皮层,保存至第3周时全部消失;同种异体角膜移植术后7d内植片透明,无原发失败。结论本研究建立的角膜器官培养保存方法可使保存的角膜在一定时间内维持活性,角膜的免疫原性下降。     

眼内麻醉剂对兔角膜内皮细胞影响的实验研究

目的:研究不同眼内麻醉剂对离体兔角膜内皮细胞的作用。方法:将实验用兔角膜取下后,分别用10g/L利多卡因、1g/L塞罗卡因及BSS处理。通过台盼蓝-茜素红联合染色观察兔角膜内皮细胞的形态学改变,并用计算机自动图像分析系统对兔角膜内皮细胞的损伤情况进行定量分析;对处理后的兔角膜内皮细胞进行扫描电镜观察,了解其超微形态学改变。结果:①各实验组中,10g/L利多卡因作用后兔角膜内皮细胞的损伤率分别为(0.91±0.12)%,(1.23±0.27)%,(2.42±0.31)%,(3.61±0.14)%;10g/L塞罗卡因作用后的兔角膜内皮细胞的损伤率分别为(0.68±0.16)%,(0.89±0.17)%,(1.84±0.34)%,(2.58±0.34)%。二者差异均具有显著性。(P<0.05,P<0.01)。②眼内麻醉剂的作用时间与兔角膜内皮细胞的损伤率呈正相关,相关系数分别为0.974、0.976。③眼内麻醉剂作用后,10g/L利多卡因造成的兔角膜内皮细胞的损伤情况较10g/L塞罗卡因更为严重。结论:10g/L利多卡因及10g/L塞罗卡因都会对兔角膜内皮细胞造成损伤。比较而言,不含防腐剂的塞罗卡因更安全。     

Avastin对大鼠角膜新生血管的抑制及超微结构的影响

目的:探讨Avastin对角膜新生血管形成及角膜内血管内皮生长因子(VEGF)的影响及其超微结构的影响。方法:Wistar大鼠96只随机分3组,采用碱烧伤的方法制备大鼠角膜新生血管模型;正常不烧伤组4只。烧伤后隔日球结膜下注射0.1mL生理盐水组32只,烧伤后隔日球结膜下注射Avastin0.1mL组32只,烧伤后隔日球结膜下注射地塞米松0.1mL组32只。碱烧伤术后在裂隙灯显微镜下观察大鼠角膜混浊度;宏观测量新生血管长度;组织病理切片HE染色作微血管计数;透射电镜观察超微结构的改变;免疫组化检测角膜VEGF的蛋白表达情况;CD34标记新生血管,显微镜下微血管计数方法研究角膜新生血管形成及抑制情况。结果:治疗组在3,7,10,14d较对照组角膜混浊程度轻(P<0.05);14d形成的新生血管数量较对照组少(P<0.05)。实验组新生血管微血管数量减少,VEGF蛋白表达下降,具有统计学差异。VEGF主要表达在角膜受损区的感染细胞胞质内,其出现时间与位置与角膜新生血管一致。Avastin和地塞米松均可有效抑制角膜新生血管,减少角膜内VEGF表达,两者无统计学差异,结膜下注射Avastin和地塞米松后,大鼠角膜超微结构无除烧伤后其它显著改变。结论:Avastin和地塞米松可抑制角膜新生血管,减少角膜内VEGF表达,对角膜的超微结构均无显著毒性。     

两种新型无血清培养基器官培养保存兔角膜内皮细胞活性的实验研究

目的研究两种新型培养基-内皮细胞培养基（ECM）和无动物成分培养基（ACF）在无血清器官培养法保存角膜内皮细胞活性方面的效果。方法将64枚兔角膜平均分为4份,分别密闭保存于ECM＋2％胎牛血清（FBS）、ECM和ACF等4种不同的培养基中4周,再以葡聚糖巧oo脱水2d。伊格尔最低基础培养基（MEM）作对照组。检测保存前后角膜内皮细胞密度、角膜厚度、内皮层中肌动蛋白微丝（F-actin）的表达和透射电镜下内皮细胞超微结构的变化。结果保存结束后,ECM＋2％FBS组的兔角膜内皮细胞密度最高（21234-240）个／mm^2,ECM和ACF组结果与其接近,内皮细胞死亡率也较低,对照组内皮细胞密度最低（1732±144）个／mm^2,3个实验组与对照组间差异有统计学意义（F=23．180,P=0．000）。免疫组织化学染色显示F-actin在兔角膜内皮层成功表达。WB半定量检测表明F-actin蛋白在各组角膜内皮层的表达趋势与内皮细胞密度计数结果一致,3个实验组与对照组间差异有统计学意义（F=159．876,P：0．000）。3个实验组内皮细胞的超微结构与正常角膜区别较小。结论在器官培养法保存过程中,无血清的ECM和ACF培养基可以较传统MEM培养基更好地保持角膜内皮细胞的活性和屏障功能,在无血清器官培养保存角膜方面具有应用前景。