人脐静脉内皮细胞体外培养、鉴定与形态学特征观察

目的：建立人血管内皮细胞的培养模型，为体外研究动脉硬化发病机制提供重要的实验手段。方法：采用1．25g／L胰蛋白酶(2．5g／L胰蛋白酶：0．2g／LEDTA：1：1V／V)消化、分离和传代人脐静脉内皮细胞，并用光镜、电镜和免疫组化等方法进行内皮细胞的形态观察和鉴定。结果：原代培养的内皮细胞在接种后约2h开始贴壁生长，光镜下内皮细胞呈铺路石状镶嵌排列；免疫组化可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应；电镜下可见胞浆中有W-P小体，证实培养的细胞为内皮细胞。结论：用胰酶灌注消化脐静脉可获得高纯度的内皮细胞，细胞存活率高。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

胰蛋白酶消化法体外培养和鉴定人脐静脉血管内皮细胞

背景:体外建立稳定可靠的人脐静脉血管内皮细胞模型,目前培养方法缺乏统一的标准。目的:探索脐静脉内皮细胞的体外培养的方法。方法:采用2.5g/L胰蛋白酶和0.02%EDTA消化、分离、体外原代培养及消化传代脐静脉内皮细胞,简化完全培养液组分(不添加血管内皮细胞生长因子、肝素等辅助因子),当原代培养细胞80%以上汇合,根据细胞特有的形态学特征和Ⅷ因子进行内皮细胞的鉴定。结果与结论:种植在培养瓶中的内皮细胞2h贴壁生长,24h换液后内皮细胞80%融合,细胞状态好,内皮细胞呈单层铺路石样外观,经过镜下观察和Ⅷ因子相关抗原鉴定证明是脐静脉内皮细胞。证实用胰蛋白酶灌注脐静脉是一种简单、实用的获得人脐静脉血管内皮细胞的方法,可靠性大,成功率高,可以构建体外研究血管内皮细胞的模型。     

人脐静脉内皮细胞分离培养及鉴定技术

目的探讨人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离原代培养的方法,并总结对培养的细胞鉴定方法。方法通过胰酶灌注法从人脐带获取内皮细胞进行分离培养,并采用免疫组化法及光镜和透射电镜观察超微结构鉴定所获得的细胞系。结果分离的HUVEC在体外7-10天左右可长成单层,光镜下胞体为单层铺路石状排列。第VⅢ因子相关抗原的检测为阳性。透射电镜下观察培养的内皮细胞胞浆内可见Weibel-Palade小体。结论用胰酶灌注法是获得脐静脉内皮细胞的有效方法。本方法为血管内皮细胞的研究提供了实验模型。     

血管抑素对人脐静脉内皮细胞及体外微血管模型的作用

目的:观察血管抑素对人脐静脉内皮细胞及体外微血管模型的抑制作用。方法:实验于2005-01/2006-12在中国医科大学基础医学院实验病理研究室(省部级)完成。①采用改进的Jaffe式培养法体外培养人脐静脉内皮细胞。②MTT法检测不同质量浓度(1,2,4,8,16,32mg/L)、不同时间(24,48,72h)血管抑素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。③流式细胞仪检测不同质量浓度(2,4,8,16,32mg/L)的血管抑素对人脐静脉内皮细胞生长周期的影响。④建立肿瘤微血管体外生成模型,培养4,8,12h倒置显微镜观察血管网形成情况;血管网未形成之前加16mg/L血管抑素观察对血管形成的影响;肿瘤微血管体外生成模型经24h培养形成血管网后加16mg/L血管抑素观察对新生血管的影响。结果:①血管抑素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响:8,16,32mg/L血管抑素能明显抑制人脐静脉内皮细胞的生长(P<0.01),血管抑素作用于人脐静脉内皮细胞24,48,72h后细胞明显受抑制(P<0.01),这种作用具有剂量-时间依赖性。②血管抑素对人脐静脉内皮细胞生长周期的影响:血管抑素作用于人脐静脉内皮细胞后能诱导细胞凋亡。③血管抑素对体外血管模型的影响:光镜下血管抑素可抑制新生血管的形成,且能破坏新生的血管网。结论:血管抑素可能抑制人脐静脉内皮细胞增殖,从而破坏新生血管形成,抑制肿瘤的生长和转移。     

细胞外基质凝胶支架混合人脐静脉来源内皮细胞构建组织工程化的内皮细胞片层

背景:由于血管内皮细胞是形成血管网络的主要功能细胞,因此通过在支架复合体中复合血管内皮细胞的方式促进再造心肌的血管化是目前研究的热点。目的:以细胞外基质凝胶为支架混合人脐静脉内皮细胞,观察内皮细胞在细胞外基质凝胶中的生长过程及发育情况。设计、时间及地点:观察实验,于2006-11/2008-01在解放军军事医学科学院基础医学研究所组织工程研究室实验室完成。材料:取健康剖腹产孕妇的脐带分离培养人脐静脉内皮细胞。取新生SD大鼠鼠尾制备Ⅰ型液态胶原溶液。方法:将2.4g/L液态Ⅰ型胶原与2×M199培养基等比例混合,用0.1mol/LNaOH调为中性,加入分离培养3d的人脐静脉内皮细胞,使其终浓度为4×109L-1,再加入200g/L的Matrigel基质凝胶。最后加入有静态拉伸力的组织工程化片层所需的模具中,构建组织工程化内皮细胞片层。主要观察指标:体外培养20d后光学显微镜、常规苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色和透射电镜观察。结果:显微镜下观察可见内皮细胞在细胞外基质凝胶中形成明显的管腔样、分支样、类似血管样结构。通过组织学和免疫组织化学的检测,证实其确为来源于人脐静脉中分离培养的内皮细胞。电镜观察可见随着时间的延长,在组织工程化内皮细胞片层中,内皮细胞可形成管腔,细胞间有紧密连接。结论:以细胞外基质凝胶为支架混合人脐静脉内皮细胞构建的组织工程化内皮细胞片层中具有类似血管样结构。     

蜂胶乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的保护作用

目的:观察蜂胶乔松素对脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的影响,探讨其对人脐静脉内皮细胞可能的保护作用。方法:实验于2006-03/10在泰山医学院生命科学研究所(省重点实验室)完成。①实验材料:取出生1h内新生儿脐带,患者知情同意。②实验分组及方法:培养人脐静脉内皮细胞,建立脂多糖损伤模型(以10mg/L的脂多糖培养液培养细胞12h),实验分为空白对照组(加等量D-Hank’s液)、脂多糖组(10mg/L)、乔松素组(加10mg/L脂多糖预孵育12h后,按50,100,200mg/L分别加入乔松素),各组设8个复孔,共同孵育24h。③实验评估:光镜下观察细胞形态,MTT法观察乔松素对人脐静脉内皮细胞活性的影响,ELISA方法检测培养上清中血管假血友病因子的含量,TUNEL检测细胞凋亡率。结果:①细胞形态:空白对照组细胞紧密贴壁,呈铺路石状生长。脂多糖组可见多数细胞呈圆形;乔松素组见上述细胞较脂多糖组明显减少。②乔松素对人脐静脉内皮细胞活性、凋亡及血管假血友病因子含量的影响:与对照组比较,脂多糖组能明显诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡(P<0.01),不同浓度乔松素组可改善内皮细胞形态,组织活性明显升高(P<0.05),同时抑制内皮细胞血管假血友病因子的释放(P<0.05),使脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡细胞数明显减少(P<0.05)。结论:乔松素能增强人脐静脉内皮细胞活性,抑制脂多糖诱导人脐静脉内皮细胞的凋亡,从而发挥可能的内皮细胞保护功能。     

人脐静脉内皮胞细体外培养及鉴定

目的探索人脐静脉内皮细胞体外培养及鉴定的方法。方法采用0.1%Ⅰ型胶原酶分离脐静脉内皮细胞,加入含10%胎牛血清及人AB血清的M1640培养基,在37℃,5%CO2孵箱中培养,以免疫组化方法对内皮细胞进行鉴定。结果原代培养细胞在接种4 h后开始贴壁生长,5～7 d后融合成单层,倒置相差显微镜下观察细胞呈鹅卵石状排列,有接触抑制现象,免疫组化显示细胞胞浆中人Ⅷ因子相关抗原阳性。结论用胶原酶灌注消化脐静脉是获得内皮细胞的一种可靠的方法,有助于体外研究血管内皮细胞模型的构建。     

妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的建立及血管紧张素Ⅱ表达的检测

目的：探索建立妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的优化方法并对该细胞模型中血管紧张素Ⅱ表达量进行分析。方法：取妊高症孕妇脐带（约8cm）,用PBS冲洗和灌注胰蛋白酶（浓度为1%）消化法分离脐静脉内皮细胞,用McCoy＇s 5A培养基进行原代和继代培养;用吖啶橙（AO）细胞荧光染色进行细胞的形态学鉴定;用免疫组织化学分析所分离细胞的来源;用Western blotting检测血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的表达情况。结果：利用1%的胰蛋白酶灌注消化可以获得大量的原代细胞,并且在不添加任何生长因子的情况下,使用McCoy＇s 5A培养基进行原代和继代培养可以实现连续传代6代以上,且细胞状态良好,生长稳定。AO染色鉴定显示细胞边缘平整,细胞核小且形态完整,符合正常细胞的形态。免疫组化鉴定结果表明在所分离的细胞中人VⅡI因子及血管内皮生长因子（VEGF）相关抗原呈强阳性。Western blotting检测发现在所分离的细胞中AngⅡ表达量远远高于普通细胞[（90.20±5.84）%,P=0.0130]。结论：1%浓度的胰蛋白酶灌注消化法与McCoy＇s 5A培养基培养法是体外建立妊娠期高血压病患者胎儿脐静脉内皮细胞模型的高效经济的方法,该模型高表达血管紧张素Ⅱ,推测AngⅡ可能是诱发妊高症的原因之一。     

血管组织工程中单根主动脉培养的内皮细胞和平滑肌细胞形态学和生长增殖

目的：探索体外培养及扩增同一来源内皮细胞和平滑肌细胞的有效方法，为研究内皮细胞和平滑肌细胞相互关系和体外构建组织工程血管提供理论和实践基础。方法：在体外用酶消化法和组织块贴壁法分别建立内皮细胞和平滑肌细胞的原代，并应用胰蛋白酶和乙二胺四乙酸钠传代培养。应用光镜、透身电镜和细胞计数对内皮细胞和平滑肌细胞的形态和增殖进行研究。结果：酶消化法和植块培养法可以有效的建立起内皮细胞和平滑肌细胞的原代。讨论：内皮细胞和平滑肌细胞作为血管构成的基本细胞，对于它们的形态学、体外培养和扩增以及相互关系的研究具有重要的意义。     

人羊膜间充质干细胞分离培养:胰蛋白酶及胶原酶消化时间及浓度的选择简

背景：文献报道人羊膜间充质干细胞提取方法各不一致,得到的细胞数量各不相同。目的：探索人羊膜间充质干细胞在体外分离培养的最适方法。方法：无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的羊膜剪成碎片,分别通过4个实验7种方法体外培养人羊膜间充质干细胞。①实验一：分别采用3种方法：0.05 g/L胰蛋白酶消化10 min后,再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min;0.75 g/L胶原酶Ⅰ直接消化120 min;0.05 g/L胰蛋白酶与0.75 g/L胶原酶Ⅰ同时消化60 min。②实验二：采用0.05 g/L的胰蛋白酶消化30 min后,再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化30 min。③实验三：分别采用2种方法：0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化30 min后,再加入0.75 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60 min;0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化40 min后,再加0.75 g/L胶原酶Ⅰ消化60 min。④实验四：采用0.05 g/L的胰蛋白酶连续2次消化30 min后,再加1 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60 min。显微镜下观察其形态,研究人羊膜间充质干细胞在体外分离培养的最适方法。结果与结论：用0.05 g/L的胰蛋白酶连续消化2次每次消化30 min,然后用1 g/L的胶原酶消化60 min是最合适的体外分离培养条件。细胞成细长梭形或星形,胞质丰富,细胞核呈圆形,1-3个核仁。说明实验四采用的胰酶和胶原酶消化的时间合适,而且胶原酶的浓度合适,得到的细胞数量最多。