牙龈卟啉单胞菌对脐静脉血管内皮细胞产生sICAM-1的影响

目的：观察牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)对人类脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)产生可溶性细胞间粘附分子－1（soluble intercellular adhesion molecule-1,sICAM-1)的影响。方法：应用厌氧袋法培养P.gingivalis，并用其感染HUVECs，采和酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定培养上清中sICAM-1的含量，结果：HUVECs基础表达少量的sICAM-1;P.gingivalis剂量依赖性增强HUVECs产生sICAM-1蛋白的水平；紫外线、超声波和65℃的热处理都不能抑制P.gingivalis的作用；sICAM-1蛋白水平在P.gingivalis刺激后的4h未见改变，增高的作用从刺激后的8h开始，在12h,16h和20h继续增加。结论：活的和灭活的P.gingivalis都剂量依赖性和时间依赖性地增强HUVECs产生sICAM-1,P.gingivalis可能同样诱导牙龈血管内皮细胞表达sICAM-1，升高的sICAM-1可能参与调节牙周病炎症反应和免疫反应过程。     

牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉血管内皮细胞cGMP生成的影响

目的:体外研究牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)cGMP水平的影响。方法:用Pg ATCC 33277分别以感染复数(multiplicity of infection,MOI)1∶10、1∶50、1∶250干预HUVEC,并以未受Pg ATCC 33277干预的HUVEC作为阴性对照,分别培养4、12、36 h,在倒置显微镜下观察各组细胞形态;125I cGMP放射免疫试剂盒检测各组HUVECcGMP的水平。结果:与对照组相比,Pg ATCC 33277分别以MOI 1∶10、1∶50、1∶250干预HUVEC 4、12、36 h后,实验各组HUVEC的细胞形态未见明显改变,仍呈典型的铺路石状单层贴壁生长;Pg ATCC 33277 MOI1∶250时可呈时间依赖性地降低HUVEC cGMP水平,而同一时间点内,各浓度组的cGMP水平并无明显差异。结论:短时间内,Pg ATCC 33277对HUVEC的细胞形态无明显影响,但可降低HUVEC cGMP的生成,HUVECNO生物利用度下降。     

牙龈卟啉单胞菌GroEL对人脐静脉内皮细胞影响的研究

目的:探究牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)的代谢产物GroEL对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖活性、凋亡及炎症反应的影响,以期为探讨P.g致心血管疾病的发病机制提供理论依据。方法:用不同浓度的P.g GroEL(2、4、6、8、10μg/mL)处理HUVEC 24 h,观察处理前后细胞形态的变化。通过CCK-8法检测HUVEC的增殖活性,流式细胞学检测细胞凋亡,RT-qPCR和ELISA法分别检测白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、血管细胞粘附因子-1(VCAM-1)、E-选择素(E-selectin)的表达。结果:P.g GroEL处理HUVEC 24 h后,显著降低了细胞活力并增加了细胞凋亡率(P<0.05),且随着P.g GroEL浓度的增加,对细胞活性的抑制作用和细胞凋亡数量也逐渐增加。P.g GroEL还显著刺激了HUVEC分泌IL-6、IL-8、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin(P<0.05)。结论:P.g GroEL以浓度依赖性方式抑...     

牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉血管内皮细胞生物学活性的影响

目的:观察牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖和凋亡的影响,并探讨Pg对人脐静脉内皮细胞的毒性作用.方法:厌氧培养饴,原代培养HUVECs,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)观察HUVECs的增殖情况;用凋亡试剂盒检测HUVECs凋亡状态.结果:Pg可以明显地抑制HUVEC的增殖,并可以引起HUVEC的凋亡.结论:Pg可以通过损伤人脐静脉内皮细胞而加重局部的炎性反应,可能是牙周炎诱发心血管疾病的病理机制之一.     

牙龈卟啉单胞菌对脐静脉血管内皮细胞表达IL-8和MCP-1 mRNA的影响

目的：在转录水平上观察牙龈卟啉单胞菌对脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）表达白细胞介素-8（IL-8）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的影响。方法：厌氧培养Pg，原代培养HUVECs，RNA抽提，逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和mRNA比色定量法检测IL-8和MCP-1基因表达。结果：HUVECs基础表达IL-8和MCP-1mRNA,Pg以剂量依赖的方式增强IL-8和MCP-1mRNA的表达，Pg感染后1hIL-8mRNA开始增高，3h达到高峰，并持续到5h。而MCP-1的mRNA从Pg感染后1h开始增高，3h达到高峰，5h出现下降趋势。结论：Pg在转录水平上增强UHUVECs表达IL-8和MCP-1，这种上调作用可能是牙周病早期基因水平调控炎症细胞募集的重要因素，可能是牙周疾病的炎症反应和免疫反应中主要调控机制之一。     

牙龈卟啉单胞菌感染对人脐静脉内皮细胞表达IL-8影响的研究

目的 研究牙龈卟啉单胞菌(porphyrmonas gingivalis,P.g)感染时人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelialcell,HUVEC)表达趋化因子白介素-8(interleukin-8,IL-8)的变化,了解P.g对其趋化功能的影响。方法 建立P.g侵入HUVEC的体外模型,采用酶联免疫吸附法(ELISA)研究P.g381和P.g33277菌株感染HUVEC 6、24 h后的培养上清液中IL-8的浓度。结果 ELISA结果显示当P.g381感染HUVEC 6、24 h和P.g33277感染HUVEC 6、24 h时,HUVEC分泌IL-8的水平明显升高(P<0.01);感染24 h时P.g381促进HUVEC表达IL-8的水平高于P.g33277(P<0.01)。结论 P.g侵入HUVEC后可促进其表达IL-8,从而上调其趋化功能,可能与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生发展相关。     

不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌对人脐静脉内皮细胞产生血管细胞黏附分子1和细胞间黏附分子1的影响

目的 观察不同fimA基因型牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)产生血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的影响,探讨Pg在动脉粥样硬化发生、发展中的可能作用.方法 实验分别以PgATCC33277 (Ⅰ fimA ) 、WCSP115 (Ⅱ fimA)、W83 (Ⅳ fimA)和大肠杆菌脂多糖刺激HUVEC作为T1、T2、T3组(3个实验组)和阳性对照组,未受刺激的HUVEC作为阴性对照组;标准条件下厌氧培养上述3型Pg,将其以及大肠杆菌脂多糖分别与 HUVEC共同孵育2、6、24 h,采用流式细胞术检测HUVEC表面ICAM-1和VCAM-1的蛋白表达量,并通过激光共聚焦显微镜观察ICAM-1和VCAM-1的表达分布情况.结果 Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ fimA型Pg刺激HUVEC后,细胞表面ICAM-1表达均增强(P<0.05),2、6、24 h表达量分别为Ⅰ fimA:60.27±5.43、80.81±1.44、85.94±2.56;Ⅱ fimA:86.69±8.81、90.19±0.00、96.18±0.48,Ⅳ fimA:59.66±0.40、85.79±4.86、96.04±2.07.除2 h时ⅠfimA与Ⅳ fimA型Pg刺激的HUVEC表面ICAM-1表达量差异无统计学意义外,其他各时间点Ⅱ、Ⅳ fimA型Pg的刺激作用均强于Ⅰ fimA型Pg(P<0.05).本研究条件下,Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ fimA型Pg刺激HUVEC后2、6、24 h表达VCAM-1的水平均较低,各实验组与对照组间相比差异均无统计学意义(P>0.05).激光共聚焦显微镜观察显示,Pg刺激下HUVEC表达ICAM-1和VCAM-1增加,在Ⅱ、Ⅳ fimA型Pg刺激下,HUVEC中ICAM-1和VCAM-1荧光点相对较多且分布范围广.结论 牙周主要致病菌Pg毒力和致病性与其fimA基因型相关,Ⅱ fimA和Ⅳ fimA型Pg 有较强的上调HUVEC表达细胞黏附分子的能力,可能导致血管内皮功能紊乱.

Abstract：

Objective To investigate the effect of Porphyromonas gingivalis(Pg) with different fimA genotypes on vascular cell adhesion molecule-1(VCAM-1) and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) production by human umbilical vein endothelial cells(HUVEC). Methods In the present study, PgATCC33277(type Ⅰ fimA genotype), WCSP 115(type Ⅱ fimA genotype), W83(type Ⅳ fimA genotype), and Escherichia coli-lipopolysaccharide (Ec-LPS) were designed as experimental group 1, 2, 3, and positive control group, respectively, to stimulate HUVEC, and the un-stimulated HUVEC were analyzed as negative control group. The three strains of Pg were cultured anaerobically in standard condition, and then the Pg cells and Ec-LPS were co-cultured with HUVEC for 2, 6, and 24 h, respectively. The amount of ICAM-1 and VCAM-1 produced by HUVEC was detected with flow cytometry(FCM). The expression of ICAM-1 and VCAM-1 by HUVEC were assayed with confocal laser scanning microscope(CLSM). ResultsThe expression of ICAM-1 on the surface of HUVEC were intensified after infected by Pg with Ⅰ, Ⅱ, and Ⅳ fimA genotypes (P<0.05). The amounts of ICAM-1 were 60.27±5.43, 80.81±1.44, and 85.94±2.56 for Pg with type Ⅰ fimA genotype, 86.69±8.81, 90.19±0.00, and 96.18±0.48 for Pg with type Ⅱ fimA genotype, 59.66±0.40, 85.79±4.86, and 96.04±2.07 for Pg with type Ⅳ fimA genotype at 2, 6 and 24 h after infection, respectively. The up-regulation effects caused by Pg with type Ⅱ and Ⅳ fimA genotypes were stronger than those caused by Pg with type Ⅰ fimA genotype at different time points except at 2 h(P<0.05). Under the present experimental condition, infected by Pg with type Ⅰ, Ⅱ and Ⅳ fimA genotypes stimulated low expression of VCAM-1 by HUVEC, it showed no significant differences among all the groups (P>0.05). Expression of ICAM-1 and VCAM-1 in Pg infected HUVEC were confirmed by CLSM. Infection of HUVEC with Pg resulted in more fluorescence staining of ICAM-1 and VCAM-1 compared with that in uninfected HUVEC cultures. Conclusions The virulence and pathogenicity of Pg is associated with its fimA genotypes, Pg with type Ⅱ and Ⅳ fimA genes possess stronger ability to stimulate HUVEC to up-regulate the expression of cell adhesion molecules, which may lead to disorders in vascular endothelial function.     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人脐静脉内皮细胞MMP-9表达影响的研究

目的采用牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphysomanas gingivalis lipopolysaccharide,P.gingivalis-LPS)感染人脐静脉内皮细胞(HUVECs),观察感染的内皮细胞中金属基质蛋白酶-9(MMP-9)的变化,探讨P.gingivalis与动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的关系。方法体外培养HUVECs,将不同浓度的P.gingivalis-LPS分别加入到单层融合后的HUVECs中,共同培养6、18、24 h,采用酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测HUVECs表达MMP-9的量。MTT法检测P.gingivalis-LPS对HUVECs增殖的影响。结果本研究条件下,应用不同浓度的P.gingivalis-LPS刺激HUVECs6、18、24 h后,细胞表达MMP-9的量升高(P<0.05)。经P.gingivalis-LPS处理后,HUVECs增殖活力较对照组明显下降(P<0.01)。结论 P.gingivalis-LPS能够上调HUVECs表达MMP-9的水平,进而加速AS的发生与发展。     

牙龈卟啉单胞菌影响血管内皮细胞增殖和凋亡的实验研究

目的 观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivatis,Pg)对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响,探讨Pg在动脉粥样硬化发病机制中的作用.方法 建立体外Pg侵入血管内皮细胞模型,甲基噻唑基四唑(MTT)法观察细胞增殖,碘化丙啶染色、流式细胞仪分析细胞周期,Annexin-V-FITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡.结果 PgATCC33277侵入后72 h细胞增殖活性降低12.46%,Pg W83侵入后72 h细胞增殖活性降低10.47%(F=786.68,P<0.01);Pg W83侵入后24 h使G1期细胞增加(F=43.23,P<0.01),ATCC 33277侵入后48 h使G1期细胞增加(F=66.72,P<0.01);Pg侵入后24 h即诱导细胞凋亡(F=1074.56,P<0.01).结论 Pg可能通过细胞毒性及诱导凋亡作用,加重血管内皮细胞的局部炎性反应,在动脉粥样硬化炎性病理反应中有重要意义.     

牙龈卟啉单胞菌不同毒力株基因差异的比较研究

目的比较牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pgingivalis）高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277之间的差异基因。方法采用抑制消减杂交技术（SHH）对比牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与低毒力株标准参考菌ATCC 33277的基因差异。以高毒力株W83为被检菌，低毒力株ATCC 33277为参考菌，将提取的基因组DNA用内切酶Rsa Ⅰ酶切，连接特殊设计的接头进行两次消减杂交和PCR扩增，得到消减混合物，与TA克隆载体连接，转化到JM109中，建立消减文库，经PCR筛选鉴定阳性克隆，进而对部分片段进行测序和同源分析。结果经SSH筛选鉴定得到36个片段大小为88～372bp的阳性克隆基因片段。结论从全基因角度研究牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83与标准株ATCC 33277之间的分子遗传差异，为牙龈卟啉单胞菌致病基因的筛选及今后牙周病预防、诊治的靶标提供依据。     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人脐静脉内皮细胞表达趋化因子RANTES和分形素的影响

目的 观察牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Pg-LPS）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表达调节活化正常T细胞表达和分泌的趋化因子（RANTES）和分形素的影响。方法 应用不同质量浓度（200、500、1 000 ng·mL^-1）的Pg-LPS分别处理HUVEC 1、6、12、24 h,利用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）及酶联免疫吸附（ELISA）法检测RANTES及分形素mRNA及蛋白质的表达变化。结果 在Pg-LPS与HUVEC共同培养1、6和12 h时,除培养时间为12 h、Pg-LPS质量浓度为200 ng·mL^-1组的RANTES mRNA和1 h、200 ng·mL^-1组RANTES蛋白表达与对照组无明显差异外,其余各实验组RANTES蛋白和mRNA表达量及分形素mRNA表达量均高于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）;6 h时,二者mRNA表达量达到峰值,分别为对照组的4.88倍和6.20倍;刺激6 h后,RANTES蛋白和mRNA表达量及分形素的mRNA表达量均降低,24 h时,仅Pg-LPS质量浓度为500 ng·mL-1组与对照组相比有统计学差异（P<0.05）;分形素蛋白的表达量则仅在Pg-LPS浓度为1 000 ng·mL-1刺激6、12 h时与对照组相比有统计学差异（P<0.05）。结论 Pg-LPS感染具有上调HUVEC表达趋化因子RANTES和分形素的作用,可能在牙周炎促进动脉粥样硬化发生、发展的过程中起一定作用。     

Porphyromonas gingivalis stimulates the release of nitric oxide by inducing expression of inducible nitric oxide synthases and inhibiting endothelial nitric oxide synthases

Sun W, Wu J, Lin L, Huang Y, Chen Q, Ji Y. Porphyromonas gingivalis stimulates the release of nitric oxide by inducing expression of inducible nitric oxide synthases and inhibiting endothelial nitric oxide synthases. J Periodont Res 2010; 45: 381–388. © 2010 The Authors. Journal compilation © 2010 Blackwell Munksgaard Background and Objective: The purpose of this study was to examine the ability of Porphyromonas gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) and to study the effects of P. gingivalis ATCC 33277 on the production of nitric oxide (NO) and on the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in HUVECs. We attempted to throw light on the pathway of damage to endothelial function induced by P. gingivalis ATCC 33277. Material and Methods: P. gingivalis ATCC 33277 was cultured anaerobically, and HUVECs were treated with P. gingivalis ATCC 33277 at multiplicities of infection of 1:10 or 1:100 for 4, 8, 12 and 24 h. HUVECs were observed using an inverted microscope and transmission electron microscopy. NO production was assayed through measuring the accumulation of nitrite in culture supernatants. Expression of both iNOS and eNOS proteins was investigated through western blotting. Results: It was found that P. gingivalis ATCC 33277 can adhere to HUVECs by fimbriae, invade into HUVECs and exist in the cytoplasm and vacuoles. P. gingivalis ATCC 33277 can induce iNOS and inhibit eNOS expression, and stimulate the release of NO without any additional stimulant. Conclusion: Our study provides evidence that P. gingivalis ATCC 33277 can invade HUVECs, and the ability of P. gingivalis ATCC 33277 to promote the production of NO may be important in endothelial dysfunction, suggesting that P. gingivalis ATCC 33277may be one of the pathogens responsible for atherosclerosis.     

谷氧还蛋白在牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导脐静脉内皮细胞氧化应激中的作用

目的 从基因和蛋白水平研究谷氧还蛋白（Grx）在牙龈卟啉单胞菌脂多糖（LPS）诱导脐静脉内皮细胞（EA-hy926细胞）时的表达变化及其对Akt通路的调控作用。方法 采用牙龈卟啉单胞菌的LPS（1 000 ng·mL^-1）对EA-hy926细胞进行不同时间段（4、12、18、24 h）的刺激诱导,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测细胞grx1基因的表达变化;然后加入Grx特异性抑制剂氯化亚硝脲（BCNU）,使用Western blot法检测对照组、LPS组（1 000 ng·mL^-1LPS刺激12 h）和BCNU组（25 μmol·mL^-1BCNU预处理30 min+1 000 ng·mL^-1LPS刺激12 h）的Grx、Akt、磷酸化Akt蛋白的表达情况。结果 LPS诱导下,EA-hy926细胞的grx1基因表达量在各个时间段均上调,12 h时grx1表达量最高。LPS诱导12 h时,LPS组的Grx蛋白表达量较对照组明显升高（P<0.05）,而BCNU可有效抑制Grx蛋白的表达（P<0.05）;Akt蛋白表达量在各组间无明显差异（P>0.05）,而LPS组的磷酸化Akt活性升高,显著高于对照组和BCNU组（P<0.05）,与Grx蛋白的表达趋势一致。结论 LPS可以从基因和蛋白水平诱导Grx的表达;Grx是Akt的潜在调节因子,可能对LPS刺激下Akt的调控具有重要意义。     

多粘菌素B和热处理对牙龈卟啉单胞菌诱导ECHUV产生sICAM-1的影响

目的：观察多粘菌素B和热处理对牙龈卟啉菌诱导人类脐静脉血管内皮细胞（endothelial cells of human umbilical vein,ECHUV）产生可溶性细胞间粘附分子－1（soluble intercellular adhesion molecule-1,sICAM-1）的影响，以探讨P．gingivalis诱导ECHUV产生sICAM-1的有效部位。方法：采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定培养上清中sICAM-1的含量。结果：P.gingivalis、大肠杆菌脂多糖（LPS）和肿瘤坏死因子－α（TNF－α）强烈诱导ECHUV产生sICAM-1，多粘菌素B明显抑制大肠杆菌LPS的诱导作用，热处理完全废除了TNF－α的作用，而这两种方法都不能降低P.gingivalis对ECHUV产生sICAM-1的影响。另外，P.gingivalis毒力株W83的诱导强度明显高于非毒力株ATCC33277。结论：P.gingivalis可能通过LPS以外的耐热的有效位点诱导ECHUV产生sICAM-1，这一位点可能与P.gingivalis的有效毒力因子有关。     

牙龈卟啉单胞菌脂多糖对人主动脉内皮细胞表达ICAM-1影响的研究

目的:分别观察牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)脂多糖(LPS)和大肠杆菌(E.coli)LPS对人主动脉内皮细胞(HAECs)在转录和翻译水平表达细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的影响。方法:在体外分别以P.gingivalisLPS和E.coliLPS刺激HAECs,实时荧光定量PCR技术检测ICAM-1基因表达,蛋白质印迹技术检测ICAM-1膜蛋白表达。采用SPSS18.0软件包中ANOVA对数据进行分析。结果:P.gingivalisLPS作用6 h后开始诱导ICAM-1 mRNA表达,14 h达到高峰,22 h仍有高表达,各时间点与未刺激组相比,差异均有统计学意义(P<0.05);而E.coliLPS作用2 h后即开始诱导ICAM-1 mRNA表达,14 h达到高峰,22 h仍有高表达,各时间点与未刺激组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。两种LPS均能在蛋白水平上调ICAM-1的表达,这种上调作用呈浓度和时间依赖,且P.gingivalisLPS的作用较之E.coliLPS要缓和。结论:P.gingivalisLPS能够在转录和翻译水平上调HAECs表达ICAM-1,提示P.gingivalisLPS在动脉粥样硬化(AS)的发生发展过程中可能发挥了重要作用。E.coliLPS可能与急性炎症性疾病有关而与AS无关。     

Cytotoxicity of Porphyromonas gingivalis toward cultured human gingival fibroblasts

Direct Cytotoxicity of black-pigmented anaerobic rods was studied on the confluent monolayer of human gingival fibroblasts in vitro. Only strains of Porphyromonas gingivalis caused morphological alteration (cell-rounding) and notable depression of viability of fibroblasts. To determine the location of the Cytotoxicity, bacterial surface components, i.e., outer membrane, lipopolysaccharide, fimbriae and outer membrane vesicles were prepared from P. gingivalis and their cytotoxicity was assessed. Among these preparations, only outer membrane vesicles are supposed to have high affinity to human gingival fibroblasts, and the cytotoxicity of outer membrane vesicles was found to be much stronger than that of the other constituents. This cytotoxic factor seemed to consist largely of protein and to be associated with the enzyme activity of outer membrane vesicles. The effects of some protease inhibitors and L-cysteine on the cytotoxicity of outer membrane vesicles suggest that the mechanism of cell-rounding is different from that of cell death.