TAK1对大鼠海马神经元细胞缺氧复氧后JNK信号通路和细胞凋亡的影响

目的：探讨TAK1对大鼠海马神经元缺氧复氧后JNK信号通路和细胞凋亡的影响。方法新生（出生＜24 h） SD大鼠,雌雄不拘,体质量5～6 g,原代培养海马神经元,接种于培养孔或培养皿中。采用随机数字表法,将其随机分为4组,每组48孔和12皿,正常对照组（ C组）：不予任何处理;缺氧复氧组（ HR组）：缺氧4 h复氧24 h;TAK1抑制剂组（ T组）、DMSO组：分别于缺氧处理前给予TAK1特异性抑制剂5Z－7－oxozeaenol 1μg／mL和等量DMSO溶液后行缺氧复氧。各组缺氧复氧处理结束后1 h,测定神经元活力、凋亡率、cleaved Caspase －3和Bax蛋白的表达水平,测定JNK磷酸化水平。结果与C组比较,HR组和DMSO组的海马神经元活力降低,细胞凋亡率升高,cleaved Caspase－3和Bax蛋白表达上调,JNK磷酸化水平明显升高（ P＜0．05）;与HR组比较,T组海马神经元活力增强,细胞凋亡率降低,cleaved Caspase －3和Bax蛋白表达下调,JNK磷酸化水平降低（P＜0．05）。结论 TAK1可能通过激活JNK信号通路介导的细胞凋亡参与大鼠海马神经元缺氧复氧后的损伤机制。     

二氮嗪后处理对缺氧复氧成年大鼠心肌细胞保护作用的体外研究

目的研究线粒体ATP-敏感性钾通道（mitoKTP）开放剂二氮嗪（diazoxide,DZ）后处理对缺氧复氧成年大鼠心肌细胞的影响。方法体外培养原代成年大鼠心肌细胞建立缺氧复氧损伤模型,随机分为5组：Normal组（在CO2培养箱中持续培养6h）;H／R组（缺氧3h复氧3h）;DZ组（缺氧3h复氧3h,在复氧5min时给予100mol／LDZ）;DZ＋5-羟葵酸盐（5-hydmxydecanoate,5-HD）组（缺氧3h复氧3h,在缺氧末给予100mol／L选择性mitoK。通道阻断剂5-HD,然后在复氧5min时给予100mol／LDZ）;5-HD组（缺氧3h复氧3h,在缺氧末给予100mol／L5-HD）。复氧3h末检测各组培养基中乳酸脱氢酶（LDH）漏出量和丙二醛（MDA）含量,TUNEL法测定心肌细胞凋亡指数、测定心肌细胞收缩幅度。结果与Normal组相比,其他4组培养基中LDH漏出量和MDA含量明显升高,心肌细胞凋亡指数也显著增高,心肌细胞收缩幅度降低（P〈0．05）;与H／R组比较,DZ后处理使培养基中LDH漏出量及MDA含量减少、心肌细胞凋亡指数降低,复氧后心肌细胞收缩幅度明显增高（P〈0．05）,但是缺氧末即刻给予5-HD可以逆转DZ的作用（P〈0．05）;5-HD组与H／R组相比各指标差异无统计学意义（P〉0．05）。结论Dz后处理可以通过开放mitoK。通道对缺氧复氧成年大鼠心肌细胞发挥保护作用。     

Akt信号途径参与二氮嗪预处理抑制缺氧复氧损伤大鼠海马神经元的凋亡

目的 探讨二氮嗪(DZ)预处理能否通过上调Akt信号增强Bcl-2表达、抑制Bax表达发挥抗凋亡作用.方法 离体培养9～10 d SD大鼠海马神经元分为正常对照组(A组)、缺氧组(B组)、缺氧+DZ 100 μmol/L组(c组)、缺氧+DZ 100 μmol/L+5-羟癸酸100 μmol/L组(D组)、缺氧+DZ 100 μmol/L+LY294002 50 μmol/L组(E组),自缺氧前2 d开始,神经元接受DZ预处理,每天1次,每次1 h.每次实验,每组16孔或2皿细胞,实验重复3次.比较缺氧4 h复氧48 h各组海马神经元的活力、凋亡率、Akt、Bcl-2和Bax蛋白的表达程度.结果 缺氧复氧后C组吸光度值较B、D、E组显著增高(P＜0.05);其他缺氧各组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).C组凋亡率较B、D、E组显著减低(P＜0.05).C组Akt、Bcl-2表达较B、D、E组强烈(P＜0.05),Bax表达则减弱(P＜0.05).B、D、E组问比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 DZ可经Akt信号通路上调Bcl-2/Bax蛋白比值而抑制缺氧复氧损伤大鼠海马神经元的凋亡.     

二氮嗪预处理对缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞HIF-1α mRNA表达及增殖的影响

目的:观察二氮嗪(DZ)预处理对缺氧复氧大鼠心肌微血管内皮细胞(MMECs)增殖和HIF-1α mRNA表达的影响.方法:培养SD大鼠MMECs,随机分为4组(n=24):正常对照组(N组)、缺氧/复氧组(H/R组)、二氮嗪组(DZ组)、DZ+Mito KATP特异性阻断剂5-羟葵酸(5-HD)预处理组(DZ+5-HD组).DZ组加入100 μmol/L DZ,DZ+5-HD组加入100 μmol/L DZ前2 h加入100 μmol/L 5-HD预处理2 h,然后和缺氧复氧组同样进行缺氧2 h复氧2 h.Hoechst染色观察凋亡细胞形态,MTT法测定细胞活力,RT-PCR检测HIF-1α mRNA转录水平.结果与N 组比较,细胞增殖率H/R组显著降低(P<0.01),HIF-1α显著升高(P<0.01);与H/R组比较,DZ组细胞增殖率显著升高(P<0.05),HIF-1α显著升高(P<0.01);DZ+5-HD组与H/R组比较差异无统计学意义.结论:DZ可上调HIF-1α mRNA的表达,促使细胞增殖,从而实现促进心肌微血管的新生.     

吡格列酮保护乳鼠心肌细胞与ATP敏感性钾通道表达的关系

目的探讨吡格列酮对缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡和心肌细胞ATP敏感性钾通道亚单位表达的影响。方法原代培养的sD乳鼠心肌细胞随机分为6组：溶媒组、缺氧复氧组、0．1μmol／L吡格列酮组、1．0μmol／L吡格列酮组、2．0μmol／L吡格列酮组、2．0μmol／L吡格列酮＋GW9662组（GW9662组）,药物预处理24h后建立缺氧复氧模型,利用膜联蛋白-v与溴化丙啶双染法检测心肌细胞凋亡,利用RT—PCR及Western—blot技术检测心肌细胞ATP敏感性钾通道亚单位的表达。结果0．1、1．0、2．0μmol／L吡格列酮组心肌细胞凋亡率与缺氧复氧组及GW9662组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;0．1、1．0、2．0μmol／L吡格列酮组心肌细胞线粒体ATP敏感性钾通道（mitoKATP）亚单位Kir6．1mRNA及蛋白的表达与缺氧复氧组及GW9662组比较差异有统计学意义（P〈0．05）,各组细胞膜ATP敏感性钾通道（sarcKATP）亚单位Kir6．2mRNA表达间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论吡格列酮抑制缺氧复氧诱导的乳鼠心肌细胞凋亡,此保护作用可能与激活PPARγ及上调mitoKATP通道亚单位表达有关,sarcKATP未参与这种保护过程。     

低浓度溶血磷脂酸诱导海马神经元凋亡及其对 c－jun 磷酸化的影响

目的：分析低浓度溶血磷脂酸（ LPA）诱导海马神经元凋亡的作用是否可被拮抗剂苏拉明阻断;探讨溶血磷脂酸对c－jun 磷酸化的影响。方法 MAP2－DAPI 双染免疫荧光鉴定海马神经元及测定纯度;流式细胞仪测海马神经元凋亡率：6孔板内培养第6天的海马神经元随机分为对照C 组（加入等体积的去离子水）、L组（加入0.1μmol／L溶血磷脂酸）和L＋S组（加入10μmol／L苏拉明＋1μmol／L 溶血磷脂酸）;Western blot 检测JNK、c－jun磷酸化水平及c－jun 表达,6 cm培养皿里培养第6天的海马神经元随机分为L组（加入1μmol／L溶血磷脂酸）和正常对照C组（加入等体积的去离子水）。结果体外海马神经元培养成功,且海马神经元纯度检测为97％。 L 组凋亡率明显高于C 组（P＜0.05）,而L＋S 组凋亡率与C组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。L组磷酸化JNK、磷酸化c－jun水平均较C组高,差异有统计学意义（P＜0.05）,c－jun的表达亦较C组显著增高（P＜0.05）。结论 LPA通过与海马神经元表面的受体结合介导其诱导凋亡作用;凋亡浓度的LPA 可以诱导JNK／c－jun激活,促进c－jun表达。     

血红素氧合酶-1对体外氧糖剥夺海马神经元Caspase-12表达抑制作用的研究

目的研究HO-1对氧糖剥夺海马神经元Caspase-12的影响及其机制.方法将培养7d的大鼠海马神经元随机分为4组：正常培养组（C组）、正常培养＋血晶素组（C＋H组）、氧糖剥夺组（D组）、氧糖剥夺＋血晶素组（D＋H组）.C组正常培养方法培养.C＋H组在正常培养的神经元培养液中加入血晶素使其终浓度为10μmol/L后按正常培养24h.D组神经元进行缺糖、缺氧后复糖、复氧处理.D＋H组神经元用10μmol/L血晶素处理24h后进行缺糖、缺氧后复糖、复氧处理.进行神经元纯度鉴定,细胞存活率的检测,HO-1、Caspase-12、Caspase-3蛋白表达和神经元凋亡的检测.结果C＋H组神经元HO-1表达高于C组（P〈0.01）,Caspase-12、Caspase-3、神经元存活率和神经元凋亡率变化无统计学意义（P〉0.05）;D组神经元HO-1表达高于C组（P〈0.01）,Caspase-12、Caspase-3高于C组（P〈0.01）,神经元存活率低于C组（P〈0.01）,神经元凋亡率高于C组（P〈0.01）;D＋H组神经元HO-1表达高于D组（P〈0.01）,Caspase-12、Caspase-3低于D组（P〈0.01）,神经元存活率高于D组（P〈0.01）,神经元凋亡率低于D组（P〈0.01）.结论HO-1可抑制氧糖剥夺海马神经元Caspase-12的表达,从而抑制神经元的凋亡.     

丁苯酞对缺氧/复氧诱导大鼠皮层神经元损伤的保护作用

目的观察丁苯酞对缺氧／复氧诱导的大鼠原代培养皮层神经元损伤的干预作用。方法原代培养Wistar大鼠皮层神经元,建立缺影复氧损伤的皮层神经元模型。实验分为5组：正常对照组、缺氧／复氧模型组、0．01μmol／L丁苯酞组、0．1μmol／L丁苯酞组、1．0μmol／L丁苯酞组。各组细胞进行相应的干预并孵育后,用CCK-8比色法观察神经元细胞活力,用激光共聚焦显微镜观察标记有荧光染料Fluo-3／AM的神经元细胞内游离钙离子浓度的变化。结果丁苯酞可抑制缺氧／复氧诱导引起的神经元细胞活力下降,且呈一定的浓度依赖;丁苯酞还可抑制细胞内游离钙离子浓度的升高,丁苯酞0．01,0．1,1．0μmol／L组与模型组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。结论丁苯酞可部分拮抗缺氧／复氧诱导的大鼠原代培养皮层神经元的钙超载,可能是丁苯酞对神经毒作用发挥保护作用的重要机制。     

JNK信号传导通路在星形胶质细胞缺氧/复氧后损伤的作用

目的 建立SD大鼠星形胶质细胞（astrocyte,AC）缺氧/复氧损伤模型,探讨JNK信号转导通路与星形胶质细胞损伤的关系.方法 体外培养新生SD大鼠星形胶质细胞,传至第3代,细胞自然纯化,实验设正常对照组（N）、SP600125组（SP组,10 μmol /L）、缺氧/复氧组（H/R组）和缺氧/复氧＋SP600125组（H/R＋SP组）.分别利用MTT法、AnnexinV/碘化丙啶（propidium iodide,PI）双染法、WB法检测缺氧8 h,复氧4、6、12、24 h时细胞存活率、凋亡率、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）的变化.结果 ①缺氧/复氧后细胞活力出现明显下降,SP600125阻断JNK通路后细胞活力高于H/R组;②缺氧/复氧后细胞凋亡率增加,SP600125阻断JNK通路后能够减轻细胞凋亡.③各组AC的JNK水平无显著变化,缺氧/复氧干预后p-JNK表达上调,用SP600125阻断JNK通路后,H/R＋SP组较H/R组p-JNK水平降低.结论 JNK信号通路参与了星形胶质细胞缺氧/复氧损伤过程.     

异丙酚对缺氧复氧后培养海马神经元nNOS的影响

目的 观察异丙酚对培养海马神经元缺氧复氧后损伤反应的影响.方法 培养12d海马神经元,随机分为正常对照再培养24h组(Nor组)、缺氧4h后复氧24h组(Ano组)、加异丙酚500μmol/L缺氧4h后复氧24h组(Pro组).采用MTT法测定细胞存活率,免疫组化方法 测定nNOS蛋白含量,应用流式细胞仪测定神经元凋亡率.结果 缺氧后Ano组nNOS蛋白表达及细胞凋亡率明显增加(P＜0.01),加入异丙酚后能减少nNOS蛋白含量(P＜0.01)和细胞凋亡率(P＜0.05),Pro组细胞存活率较Ano组增加(P＜0.05),但与Nor组比仍下降(P＜0.05).结论 异丙酚能提高体外海马神经元的抗缺氧能力,减少nNOS蛋白过度表达和细胞的凋亡.     

瑞芬太尼预处理对全脑缺血再灌注大鼠海马神经元的影响及JNK在其中的作用

目的探讨瑞芬太尼预处理对全脑缺血再灌注大鼠海马神经元的影响及JNK（c-Jun氨基末端激酶）在其中的作用。方法采用同时阻断双侧颈总动脉法建立大鼠全脑缺血再灌注模型,采用HE法观察海马神经元形态变化,TUNEL法检测海马神经元,免疫印迹法（Western-blot）检测不同组中p-JNK表达变化。结果瑞芬太尼预处理可以减轻大鼠全脑缺血再灌注损伤（CIRI）过程中海马神经元的凋亡,其机制可能与抑制JNK过度激活有关。     

姜黄素对氧化应激损伤后海马神经元血红素加氧酶-1 的表达影响

目的：探讨姜黄素对氧化应激损伤后的海马神经元血红素加氧酶-1（hemeoxygenase-1,HO-1）的表达影响。方法i将培养的原代海马神经元,分为6组：空白对照组、损伤对照组、姜黄素不同剂量治疗组（2．5μmol／L,5μmol／L,10μmol／L,20μmol／L）。利用1mmol／L的H2O2处理海马神经元1h,制作神经元氧化应激损伤模型。按照以上分组情况加入等浓度的姜黄素培养液,37℃、5％CO2孵箱孵育6h,采用倒置相差显微镜观察细胞的形态变化;免疫荧光、PCR半定量检测细胞内HO-1的表达。结果：①5μmol／L组、10μmol／L组细胞形态变化不明显;损伤对照组和2．5μnol／L组细胞损伤明显;②损伤对照组与空白对照组比较,P〈0．05;损伤对照组与2．5μmol／L组、20μmol／L组两两比较差异无统计学意义（P〉0．05）;5μmol／L组、10μmol／L组与损伤对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;PCR检测结果提示20μmol／L组比2．5μmol／L组HO-1的表达量减少。结论：姜黄素对氧化应激损伤海马神经元的保护机制可能是通过上调HO-1的表达实现的。     

小檗碱通过ERK,JNK信号转导途径对COX-2的抑制作用

目的：研究中药小檗碱是否通过ERK,JNK信号转导途径抑制人外周血单核细胞COX-2mRNA及蛋白表达.方法：取人外周静脉血分离及培养单核细胞,分为对照组、LPS组、LPS＋小檗碱25μmol/L组、LPS＋小檗碱50μmol/L组、LPS＋小檗碱100μmol/L组.分别在培养后30min,6,12,24h提取细胞,行RT-PCR法测定COX-2mRNA水平,行Western Blot法测定ERK,p-ERK,JNK,p-JNK及COX-2蛋白水平.同时加入选择性ERK,JNK抑制剂,分别测定COX-2mRNA及蛋白水平.结果：与LPS组相比,小檗碱组COX-2mRNA及蛋白表达明显抑制（P〈0.05）.与LPS组相比,小檗碱组ERK活性水平有统计学差异（P〈0.05）.但是与LPS组相比,低、中浓度小檗碱组（25,50μmol/L）JNK活性水平无统计学差异,高浓度小檗碱组（100μmol/L）JNK活性水平有明显统计学差异（P〈0.05）.加入ERK,JNK抑制剂之后,COX-2mRNA及蛋白水平降低明显（P〈0.05）.结论：小檗碱能抑制人外周血单核细胞COX-2mRNA及蛋白水平,其作用程度呈浓度依赖性.小檗碱可能通过ERK信号转导途径抑制人外周血单核细胞COX-2mRNA及蛋白表达.高浓度小檗碱可能通过JNK信号转导途径抑制人外周血单核细胞COX-2mRNA及蛋白表达.     

JNK磷酸化Bad在脑缺血神经元凋亡中的作用

目的探讨JNK磷酸化Bad在大鼠缺血性神经元凋亡中的作用。方法 20只大鼠均分为4组：假手术组、缺血复灌组、溶剂对照组和SP600125组。制作大鼠全脑缺血模型,应用免疫沉淀和免疫印迹法检测大鼠脑缺血复灌1 d海马CA1区神经元Bad与14-3-3及Bad与Bcl-Xl的结合、Bad丝氨酸128位磷酸化[p-Bad（S128）]水平、Caspase-3蛋白表达情况。结果与缺血复灌组相比,SP600125组海马CA1区神经元Bad与14-3-3的结合明显增高,Bad与Bcl-Xl的结合、p-Bad（S128）、Caspase-3表达显著减少（均P〈0.05）。结论 JNK介导的Bad（S128）磷酸化在大鼠缺血性脑损伤中发挥了重要作用。     

佛波酯慢性处理对大鼠血管平滑肌细胞各亚型蛋白激酶C表达的影响

目的观察佛波酯（PMA）慢性处理大鼠血管平滑肌细胞各亚型蛋白激酶C（PKCs）表达的影响。方法原代培养大鼠m管平滑肌细胞,①按照PMA处理浓度将细胞随机分为空白组、0．25％eDMSO组和PMAI、5、10μmol／L组,各组细胞均处理4h;②按照PMA处理时间将细胞随机分为空白组、0．25％eDMSO组和PMA1、4和24h组,PMA组的药物浓度均为10μmol／L。采用Western blotting技术榆测各亚型PKCs蛋白的表达。结果PMA浓度〈10μmol／L处理细胞时间〈4h不影响PKC—α的表达（P〉0．05）,10pmlol／LPMA处理24h能抑制PKC—α的表达（P〈0．05）;PMA浓度〉5μmol／L处理细胞时间〉4h可明显抑制PKC-δ的表达（P〈0．01）,PMA浓度〈5μmlol／L处理细胞时间〈4h对PKC-δ的表达无显著影响（P〉0．05）,10μmol／LPMA处理细胞1h即可明显抑制PKC-δ的表达（P〈0．01）;PMA浓度〉5pμmol／L处理细胞时间〉4h可以明显抑制PKC-θ的表达（P〈0．01）;10μmol／L的PMA处理细胞24h对PKC．∈的表达无明显影响（P〉0．05）。结论PMA慢性处理大鼠血管平滑肌细胞可抑制传统型PKC—α和新型PKC-δ、ε、θ的表达,对非典型PKC-ζ的表达没有影响。     

盐酸戊乙奎醚对大鼠缺氧缺糖／复氧复糖海马脑片凋亡相关因子表达的影响

目的研究盐酸戊乙奎醚（penehyclidine hydrochloride,PHC）对大鼠缺氧缺糖／复氧复糖海马脑片的保护作用及机制。方法采用大鼠海马脑片缺氧缺糖／复氧复糖模型;分为正常组、缺氧缺糖／复氧复糖（H／R）组、PHC 2μmol／L（PHC2组）、PHC 10μmol／L（PHC10组）、PHC 50μmol／L（PHC 50组）、Sco 50 μmoL／L（Sco50组）,测量各组LDH释放率,免疫组织化学法测定各组海马CA1区Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达。结果PHC各组LDH释放率均较H／R组下降,以PHC50组效果最好（P〈0．01）。PHC50组Bcl-2阳性细胞的表达和Bcl-2／Bax比值均较H／R组升高,Bax和Caspase-3阳性细胞表达均较H／R组降低（P〈0．01）。Sco50组Bcl-2阳性细胞的表达和Bcl-2／Bax比值也较H／R组升高,Bax和Caspase-3阳性细胞表达均较H／R组降低（P〈0．01）。结论PHC可能通过减少LDH释放和Caspase-3、Bax的表达,增加Bcl-2的表达减轻大鼠缺氧缺糖／复氧复糖海马脑片的损伤。     

氯胺酮、咪达唑仑及丙泊酚对发育期神经元细胞内钙的影响

目的：探讨氯胺酮、咪达唑仑及丙泊酚对大鼠发育期海马神经元细胞内钙浓度的影响．方法：将原代培养第5日的大鼠海马神经元用10μmol／L的Ca2＋指示剂Fluo-4共孵育30min洗涤后,分别加入150μmol／L氯胺酮,咪达唑仑3μmol／L,丙泊酚10μmol／L,采用激光共聚焦显微镜选定多个细胞分别测定荧光强度的变化．结果：氯胺酮使体外培养第5日的海马神经元代表钙浓度的荧光强度明显下降[（987±307）vs（766±226）,P〈0．05],咪达唑仑,丙泊酚均使体外培养5d的海马神经元荧光强度明显升高[（1707±514）vs（2663±572）,（1057±353）vs（1749±708）,P〈0．05]．结论：阻滞NMDA受体的氯胺酮降低发育期海马神经元细胞内钙浓度,而兴奋GABA。受体的咪达唑仑,丙泊酚则会升高细胞内钙浓度．     

异丙酚对缺血再灌注损伤神经细胞的保护作用

目的 研究异丙酚对缺血再灌注损伤神经细胞的保护作用.方法 取12h新生Wistar大鼠海马细胞进行体外培养,建立原代海马细胞缺糖缺氧再给氧模型(oxygen glucose deprivation,OGD).观察海马细胞形态,苔盼蓝染色计算细胞存活率.建立SD大鼠脑缺血再灌注损伤模型,分为模型组、异丙酚用药组、正常对照组.观测各组动物术后神经症状评分、TTC染色测定脑梗死体积大小及HE染色.结果 海马细胞缺糖缺氧再给氧显示异丙酚用药组海马细胞存活数量较多,胞体较大突起保持稠密的神经网.异丙酚100μmol/L组细胞存活率为(56.2±3.7)％,较模型组(细胞存活率38.6％±4.3％)明显增高(P＜0.05).大脑中动脉阻断(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型24h神经症状评分,异丙酚用药组评分为(0.8±0.5)较模型组(2.3±0.5)显著降低(P＜0.05).TTC染色脑梗死体积异丙酚用药组为(123.21±11.04)mm3,较模型组(214.95±16.79)mm3显著降低(P＜0.01).HE染色可见异丙酚用药组正常细胞较多.结论 细胞和动物模型均显示异丙酚对缺血再灌注损伤后神经细胞具有保护作用.