大鼠Mlüler细胞的体外培养及免疫组织化学鉴定

Müller细胞是视网膜中一种非常重要的胶质细胞。成熟的Müller细胞发出很多分支包围、分隔神经元的胞体和突起[1]。研究表明Müller细胞在外伤或光损伤后可表达多种生长因子,这些生长因子除对神经元具有保护作用外[2],对细胞外环境也具有调控作用[3]。因此,Müller细胞在视网膜中的作用正日益受到人们的重视。而Müller细胞的培养方法主要有组织块贴壁培养法和酶解法。本实验应用酶解法成功分离了大鼠视网膜的Müller细胞,并进行体外培养、免疫组化鉴定,为进一步研究胶质细胞在中枢神经系统的作用提供实验基础。1材料和方法1.1实验动物…     

高糖抑制体外培养Mnüer细胞生长

Müller细胞作为视网膜的重要组成部分,除了对视网膜神经细胞有支持和营养作用外,还在视网膜神经递质、钾离子、pH值的调节以及神经细胞的信号传递等方面发挥重要的作用,其改变不但可以引起视网膜血管病变,还能导致神经元的功能障碍[1].     

Müller细胞在增殖性糖尿病视网膜病变中的最新研究进展

Müller细胞是脊椎动物视网膜中的主要胶质细胞, 其纵向跨越整个视网膜, 几乎与视网膜中的每一种细胞类型都有接触。因其独特的定位, 可以参与维持视网膜内稳态所需的各种功能。增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy, PDR)是糖尿病的眼部并发症, 在炎症的作用下内皮细胞、神经元和神经胶质细胞之间相互作用造成眼底微血管病变。在PDR中, Müller细胞经历反应性胶质增生, 一方面起到保护视网膜的作用, 另一方面, 由于炎性细胞因子/趋化因子的水平升高, 可导致瘢痕和视网膜新生血管形成, 损害玻璃体。由此可见, Müller细胞胶质化对于视网膜有着双重作用。另外, Müller细胞表达低密度脂蛋白受体相关蛋白-1(low density lipoprotein receptor associated protein 1, LRP1), LRP1对新生血管和炎症有着密切联系。对Müller细胞、PDR玻璃体和LRP1展开研究可能为"趋利避害"提供新思路。     

bFGF对胚胎神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的影响

本研究观察了碱性成纤维生长因子对胚胎神经干细胞生长和分化的影响。从孕 12 d大鼠胚胎神经管分离神经干细胞 ,进行体外培养 ,分为碱性成纤维生长因子组及对照组。培养过程中观察神经干细胞的生长 ,于培养第 3、5、10 d用免疫组化方法检测培养细胞神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达 ,以观察神经干细胞分化为神经元及神经胶质细胞的状况。碱性成纤维生长因子可明显地促进培养细胞的生长和分化。免疫组化细胞计数显示 ,培养第 3 d,特异烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数均明显增加 ;培养第 5 d,特异烯醇化酶阳性细胞数是对照组的 1.9倍 ,胶质纤维酸性蛋白阳性细胞数为对照组的 1.6倍 ,前者表达增加明显 ;培养第 10 d,两者的阳性细胞数仍高于对照组 ,但增加不明显。不同培养时间的胞体最长突起长度也均高于对照组 ;胞体直径及表面积随培养时间延长而增大。说明 ,碱性成纤维生长因子既能促进胚胎神经干细胞的生长 ,也可促使其分化为神经元及神经胶质细胞 ,尤以神经元为明显     

NG2细胞的研究进展

NG2细胞,是在发育和成年中枢神经系统的灰质和白质束中发现的,因表达NG2蛋白多糖而得名.NG2细胞先前被假定代表少突胶质细胞前体细胞,后来使用转基因小鼠的研究表明,NG2细胞在体内不仅能够产生少突胶质细胞,还能产生原浆性星形胶质细胞,以及某些情况下的神经元[1].NG2细胞是中枢神经系统中不同于神经元、成熟少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞的一类细胞亚群.此外,在发育和成年中枢神经系统的多个区域,发现NG2细胞和神经元之间存在独特的突触联系,暗示NG2细胞除了可能作为分化成多种细胞的可塑性前体细胞群,还可能会和神经元联系从而形成一个独特的神经胶质网络[2].进行综述对NG2细胞的近年研究,以及其功能特性和在神经网络中所扮演的角色.     

新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究

研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法,为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。取新生SD大鼠的海马区脑组织,采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞,在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养;Accutase酶消化后传代培养,取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞,在无血清培养液中形成大量的神经球,部分神经球出现融合及贴壁分化现象,细胞呈典型NSCs 形态。经巢蛋白染色鉴定,大部分为阳性细胞。神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后,可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力,在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。     

N-甲基-N-亚硝脲诱导的大鼠视网膜感光细胞损伤模型中Müller细胞增殖和细胞因子分泌的变化

目的:建立N-甲基-N-亚硝脲(N-methyl-N nitrosourea,MNU)损伤视网膜的模型,研究视网膜神经元凋亡对Müller细胞生物学特性的影响及神经营养因子的表达变化。方法:腹腔注射MNU建立视网膜损伤模型,免疫荧光染色方法研究感光细胞缺失对Müller细胞的生物学特性的影响,并检测主要神经营养因子表达的变化。结果:TUNEL法显示,腹腔注射MNU后2 d,视网膜外核层细胞凋亡现象明显。核增殖抗原(PCNA)及细胞周期素CyclinD_1的表达明显增高。与此同时,Müller细胞也开始表达神经干细胞抗原巢蛋白(nestin);RT-PCR显示胰岛素样生长因子(IGF),碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和肝细胞生长因子(HGF)mRNA的表达均升高。结论:在视网膜受到损伤时,Müller细胞增殖、去分化呈现出干细胞的特性。而视网膜中IGF、bFGF和HGF等细胞因子的表达明显增高,提示视网膜损伤后可能通过大量分泌细胞生长因子,促进Müller细胞的增殖。     

神经元来源细胞外囊泡促进神经干细胞的神经生成

背景：已有研究表明，神经干细胞能够分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。间充质干细胞来源细胞外囊泡被证实能够透过血脑屏障到达中枢神经损伤部位，促进神经修复。然而，神经元来源细胞外囊泡是否促进神经干细胞向有益于神经生成的方向分化，帮助神经修复，还不是很明确。目的：探究神经元来源细胞外囊泡是否有利于神经干细胞向神经生成的方向分化。方法：用胰酶消化法从新生SD大鼠大脑皮质中提取神经元和神经干细胞。收集培养神经元的细胞上清，提取神经元来源细胞外囊泡。将培养10 d的神经干细胞与神经元来源细胞外囊泡或PBS共培养7 d，采用免疫印迹、免疫荧光和RT-qPCR技术分别检测神经元、神经干细胞、少突胶质细胞和星形胶质细胞特异性标志蛋白的表达。结果与结论：神经干细胞与神经元来源细胞外囊泡共培养后，高表达神经元特异性蛋白β3微管蛋白、神经丝蛋白200和少突胶质细胞特异性蛋白髓鞘碱性蛋白，低表达星形胶质细胞特异性标志蛋白胶质纤维酸性蛋白。这些结果说明，神经元来源细胞外囊泡能够促进神经干细胞向神经元和少突胶质细胞分化，抑制其向星形胶质细胞分化。     

来源于大鼠脊髓星形胶质细胞的神经干细胞的增殖分化特性

目的:通过研究碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)在A-NSC培养中的作用来观察其增殖特性;通过添加血小板生长因子PDGF-AA作为诱导因子来研究A-NSC分化的特性。方法:将A-NSC分四组:bFGF+EGF添加组,bFGF添加组,EGF添加组和对照组进行培养,通过形态观察和流式细胞仪检测细胞周期。同时添加PDGF-AA诱导A-NSC分化,以自然分化为对照组,通过免疫荧光染色观察比较其各类细胞分化比例的差异。结果:可观察到A-NSC在bFGF添加组和bFGF+EGF添加组有正常的分裂周期,而EGF添加组和对照组的细胞几乎都停滞在G0/G1期,显示其增殖受到阻滞;诱导实验检测到对照组细胞的分化比例分别为神经元(89.0±4.2)%,星形胶质细胞(4.6±3.2)%,少突胶质细胞(7.6%±2.5%),具有很高的神经元分化比例;诱导组细胞的分化比例分别为神经元(80.6±4.1)%,星形胶质细胞(3.0±1.3)%,少突胶质细胞(20.6±1.8)%,诱导组分化成少突胶质细胞的能力有显著提高(P<0.001)。结论:在A-NSC的生长过程中,bFGF对A-NSC的增殖起重要作用,在本实验条件下A-NSC倾向于向神经元分化,同时PDGF-AA能够显著诱导A-NSC分化成少突胶质细胞。     

神经干细胞移植治疗视网膜缺血再灌注损伤的研究进展

视网膜缺血再灌注损伤尚无理想的治疗手段。神经干细胞是具有自我更新、多向分化潜能的细胞群,能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。随着干细胞研究技术的不断发展,通过体外培养神经干细胞,移植整合入视网膜各层并定向诱导分化为目的细胞,有望重建视网膜功能。     

GDNFR-α在体外培养的大鼠脊髓和背根节神经元中分布的免疫组织化学研究

目的观察胶质细胞源性神经营养因子受体-α(GDNFR-α)在体外培养的大鼠脊髓和背根节神经元中的分布,探讨GDNF对脊髓运动神经元和感觉神经元的作用. 方法原代培养脊髓和背根节神经元,5d后行抗GDNFR-α多克隆抗体免疫组织化学SP法染色. 结果 GDNF免疫反应存在于体外培养的脊髓神经元、背根节神经元以及胶质细胞中. 结论 GDNF可能对脊髓神经元、背根节神经元和胶质细胞的生理功能具有一定的调节作用.     

小鼠睾丸支持细胞对大脑皮质细胞的体外营养作用

目的通过观察睾丸支持细胞(SCs)对大脑皮质细胞体外的营养作用,探讨移植的SCs在体内对神经组织营养作用的方式。方法将原代分离的小鼠大脑皮质细胞单独培养(对照组)或与小鼠SCs共培养(实验组),比较两组中神经元、神经干细胞(NSC)及神经胶质细胞的生长情况。结果实验组的神经元数及其突起数、神经元特异性烯醇化酶光密度(P<0.01)和神经胶质细胞数均较对照组高,两组各时期的神经元胞体面积也不相同(P<0.05),实验组于第3天出现NSC的集落形成。结论SCs在体外对大脑皮质的神经元、NSC和神经胶质细胞均有较强的营养作用,在中枢神经系统疾病的细胞移植治疗中将具有很大的应用价值。     

脑出血对大鼠前脑碱性成纤维细胞生长因子影响的实验研究

用免疫组织化学方法 ,对胶原酶注入尾壳核诱导的脑出血模型大鼠前脑中碱性成纤维细胞生长因子的分布进行了观察。结果显示 :脑出血后大鼠脑内此因子明显上调 ,除了病灶周围、海马及额叶、扣带皮质的神经元和神经胶质细胞表达碱性成纤维细胞生长因子外 ,还见室管膜细胞、伸展细胞以及脑室周围器官 (穹窿下器、连合下器、正中隆起 )等处的细胞表达增强。另外 ,软脑膜细胞、脑蛛网膜细胞、软脑膜下胶质界膜星形胶质细胞也表达碱性成纤维细胞生长因子。脑出血后脑内神经元和非神经元碱性成纤维细胞生长因子的上调提示它可拮抗神经元的减少与溃变、保持神经元的存活和损伤组织的修复。根据实验结果对碱性成纤维细胞生长因子的分泌和转运途径进行了讨论     

星形胶质细胞与神经元在蚕丝素纳米纤维上的联合培养

目的:研究胶质细胞结合丝素纳米纤维对神经元生长发育的作用,为神经干细胞结合丝素蛋白材料用于临床移植修复神经系统损伤提供实验依据.方法:从新生大鼠脑室下区分离细胞与取自混合培养得来的星形胶质细胞共培养在柞蚕、家蚕2种丝素蛋白溶液制成的材料上,分别选取各时间段的细胞进行β-Ⅲ-tubulin特异性免疫荧光显色,并统计不同时间段神经元在丝素材料上的复杂度.结果: 神经元与星形胶质细胞共培养在柞蚕丝素无纺布上(TSF)的复杂度明显比家蚕丝素无纺布(SF)高.结论: 柞蚕、家蚕丝素无纺布结合星形胶质细胞支持神经元的生长,具有良好的生物相容性;胶质细胞结合柞蚕丝素无纺布比家蚕丝素无纺布更适合神经元的生长发育.     

骨髓基质细胞体外诱导分化成神经元和胶质细胞

目的　探索骨髓基质细胞 (bonemarrowstromalcells,BMSC)体外诱导分化为神经元和神经胶质细胞的可行性 ,为BMSC在神经科学领域内的应用奠定基础。方法　以成年犬BMSC为实验对象 ,利用碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、表皮生长因子 (EGF)、维甲酸 (RA)、脑源性神经营养因子 (BDNF)、胶质细胞系来源神经营养因子 (GDNF)等作为增殖及分化诱导因子 ,进行增殖培养、分化诱导 ;免疫组化法进行细胞性质鉴定。结果　加入bFGF、EGF增殖培养 72h可见细胞分裂相 (成纤维细胞样细胞 )。加入RA、BDNF、GDNF诱导 3d ,部分细胞有NSE、GFAP成分表达 ;第 10d可见有神经元、神经胶质形态样细胞形成 ,经细胞成分 (NSE、GFAP)鉴定证实为神经元、神经胶质细胞。结论　BMSC在体外培养条件下 ,经过bFGF、EGF、RA、BDNF、GDNF等因子的“程序性”作用 ,可以分化成神经元和神经胶质细胞     

视网膜神经胶质细胞及其分泌的细胞因子与视网膜病变

视网膜内常见的神经胶质细胞包括星形胶质细胞、Müller细胞(放射状胶质细胞)和小胶质细胞。最近研究表明,这些神经胶质细胞能释放多种细胞因子,包括VEGF、bFGF、TGF、IGF、TNF及IL等,这些细胞因子不仅在调节视网膜神经细胞生长发育中起着重要作用,而且是参与视网膜病变的重要因素。     

嗅鞘细胞与神经细胞体外共培养的研究进展

嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)分布于嗅球和嗅上皮基底膜,同时具有中枢神经系统星形胶质细胞和周围神经系统雪旺细胞特性,其生物学功能极为广泛.近年研究证实OECs具有支持和促进多种神经元存活和轴突再生的作用,目前已被广泛应用于中枢神经系统损伤的修复[1,2].     

不同诱导因子对人脐带血非造血干细胞神经分化的影响

目的 探讨诱导人脐带血非造血干细胞向神经细胞分化的最佳条件.方法 通过密度梯度离心法原代培养脐带血非造血干细胞;用流式细胞术分析脐带血获得的贴壁细胞的CD34、CD90、CDl66、HLA-ABC、HLA-DR等免疫表型;并用不同诱导因子组合:1.维甲酸(RA);2.表皮生长因子(EGF) 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);3RA EGF bFGF;4二甲基亚砜(DMSO) 丁羟基茴香醚(BHA)诱导后,用免疫荧光化学法检测各组脐带血非造血干细胞中β-微管蛋白-Ⅲ(β-tubulin-Ⅲ)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖苷酶-C(Gal-C)等神经细胞、星型胶质细胞及少突胶质细胞的特异性标记抗原的表达.结果 脐带血非造血干细胞CD90、CD166、HLA-ABC表达阳性;无论那一种诱导因子组合,分化为少突胶质细胞的比率均高于神经元及星型胶质细胞;即各组分化为少突胶质细胞数＞神经元的细胞数＞星型胶质细胞数.对于少突胶质细胞(Ga-C)以RA EGF bFGF组合诱导率最高,达57.02%,其次是DMSO BHA诱导组.而对于神经元及星型胶质细胞的分化各组比较,以RA组最高,其次是DMSO BHA诱导组合.结论 RA对神经元及星型胶质细胞的诱导作用较好,而RA EGF bFGF组合对于少突胶质细胞诱导作用最明显.     

壁虎胚胎大脑皮层神经元和胶质细胞的分离、培养及纯化

目的 建立多疣壁虎胚胎大脑皮层神经元和胶质细胞的分离、培养及纯化方法.方法 分离孵化15d的多疣壁虎胚胎的大脑皮层,经胰酶消化,细胞计数后接种于培养瓶.采用差速贴壁及反复传代相结合的纯化培养方法培养胶质细胞;采用添加B27的神经元培养基培养神经元,并用免疫细胞化学方法鉴定.结果 获得体外培养的壁虎GFAP阳性表达胶质细胞,4代后纯度达95%以上;采用神经元培养基,神经元生长良好,NF、MAPⅡ表达阳性,第10d纯度达95%以上.结论 建立了壁虎细胞的培养方法,并获得高纯度的胶质细胞和神经元,为进一步对神经系统的深入研究提供细胞模型.     

脑创伤组织提取液的神经营养活性及其活性因子来源的探讨

切除成年大鼠大脑双侧顶叶部分皮质,在术后不同时间取损伤周围脑组织,制成脑创伤组织提取液(BWTE);并建立新生大鼠大脑皮质神经元体外培养模型,检测BWTE中的神经元营养因子(NTFs)和促神经突起生长因子(NPFs)。为探讨这些因子的来源,是否与脑创伤区早期出现大量的巨噬细胞有关,我们培养巨噬细胞,收集巨噬细胞条件性培养基(MφCM),检测MφCM对大脑皮质神经元的神经营养活性。此外,亦观察BWTE和MφCM对PC 12细胞的作用,以进一步探讨NPFs的作用机制。实验结果表明,BWTE和MφCM中含有对大脑皮质神经元的NTFs和NPFs。这些因子于脑损伤后第4天开始出现,第5天达高峰(NPFs在第9天还出现一个高峰),第13天仍有活性。MφCM的NTF活性不及BWTE,但NPF活性则比BWTE强。BWTE和MφCM对PC 12细胞也具有NPF活性。通过实验分析认为,BWTE中的神经营养因子,早期主要来源于巨噬细胞,后期可能与星形胶质细胞有关。这些因子成分复杂,可能含多种有效成分,有待今后进一步探讨。