乙型肝炎病毒E抗原肝细胞作用蛋白AK026018表达谱芯片的研究

目的 应用基因芯片技术,筛选能被乙型肝炎病毒E抗原（HBeAg）肝细胞作用蛋白AK026018反式调节的靶基因,初步研究该蛋白的生物学功能.方法 应用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术,从HepG2细胞中扩增编码AK026018蛋白的全基因,构建真核表达载体,转染肝母细胞瘤系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果 经限制性内切酶分析和DNA序列测定鉴定构建的重组表达载体正确.在8464个基因表达谱的筛选中,发现有122个基因有差异表达,其中78种基因表达水平显著下调,45种基因表达水平显著上调.结论 成功地应用DNA芯片技术筛选出HBeAg结合蛋白新基因AK026018的反式调节蛋白,证明该基因对于肝细胞基因表达谱有显著影响.     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1“饵”载体的构建及在酵母中的表达

目的 构建乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1（ HBEBP1）真核表达载体,并在酵母细胞中进行表达.方法 以HepG2细胞来源的eDNA为模板,PCR扩增获得HBEBP1基因,克隆至pGEM-T载体.测序正确后双酶切pGEM-T-HBEBP1,回收目的片段并连接至酵母表达载体pGBKT7中,转化酵母菌AH109,在色氨酸缺陷型培养基（SD/-Trp/卡那霉素）上筛选阳性菌落后大量表达并提取重组蛋白,再进行SDS-PAGE和Western Blot分析.结果 成功构建酵母表达载体pGBKT7-HBEBP1,Western Blot结果显示重组蛋白表达产物存在于胞内,条带清晰、大小正确,相对分子质量约33 × 103.结论 利用真核表达载体在酵母细胞中成功表达HBEBP1蛋白,为研究HBEBP1蛋白的生物学功能奠定了基础.     

乙肝病毒e抗原反式激活蛋白的亚细胞定位研究

目的 验证HBeAgTP基因在细胞内的表达及表达蛋白的亚细胞定位。方法 构建HBeAgTP基因的酵母表达诱饵质粒pGBKT7-HBeAgTP及绿色荧光蛋白表达质粒DEGFP-C1-HBeAgTP，pEGFP-C1．HBeAgTP转染HepG2细胞，24h后荧光显微镜下观察蛋白表达的亚细胞定位。pGBKT7-HBeAgTP转化AH109酵母细胞，提取转化了质粒的酵母蛋白质，进行Western免疫印迹分析。结果 成功构建出HBeAgTP基因。HBeAgTP基因的酵母表达诱饵质粒pGBKT7-HBeAgTP及绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1．HBeAgTP，Western免疫印迹法印证HBeAgTP可表达蛋白，其表达的蛋白亚细胞定位于细胞质。结论 HBeAgTP基因可表达蛋白，其表达蛋白亚细胞定位于细胞质。     

乙型肝炎病毒e抗原基因作为酵母双杂交体系结合域载体的构建及表达

目的　以乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)全基因为外源片段 ,构建酵母双杂交体系中结合域载体 ,研究其在酵母细胞中的表达 ,排除自身激活作用及毒性作用 ,验证其适用性。方法　根据报道序列设计、合成HBeAg全基因巢式引物 ,取患者血清 ,通过PCR方法分离HBeAg全基因片段 ,克隆入T载体 ,酶切鉴定及序列测定后 ,克隆入酵母双杂交体系结合域载体pGBKT7,构建pGBKT7 eAg载体。再次酶切鉴定阳性克隆后转入酵母 ,验证毒性作用 ;通过Western blot实验证实外源基因在酵母中的表达 ;并进一步验证自身激活作用。结果　由血清中分离的及 2次酶切鉴定的片段大小分别为 6 5 7bp和 6 39bp ,与预期大小一致 ;序列测定与报道的HBV分离株核酸及氨基酸同源性分别为96 %和 10 0 % ;转人酵母后无毒性及自身激活作用 ;Western blot实验出现阳性与预期大小 (2 4 .3× 10 3)一致的条带。结论　pGBKT7 eAg载体在酵母细胞中表达出融合蛋白 ,进一步验证无自身激活及毒性作用 ,此载体构建成功 ,适用于酵母双杂交体系。     

HBeAg阴性慢性乙型肝炎9年前瞻性研究

目的对乙型肝炎病毒e抗原(Hepatitis B e antigen,HBeAg)阴性慢性乙型肝炎(chronichepatitis B,CHB)患者的临床特征及转归进行随访。方法前瞻性地观察93例HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者(9·4±6·9)年,对患者的临床特征及转归进行研究。结果93例患者多数平均随访9·4年,23·66%发展成肝硬化,6·45%发生原发性肝癌,4·30%死亡。通过单因素分析表明年龄、是否有嗜酒史、ALT活动形式与HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者发生肝硬化和原发性肝癌的比例相关,差异有统计学意义。结论HBeAg阴性乙型肝炎患者平均随访9·4年转归不佳。年龄、是否有嗜酒史、ALT活动形式与HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者发生肝硬化和原发性肝癌相关。     

乙型肝炎病毒前S1蛋白抗原检测的临床意义

目的通过分析HBV前S1（PreS1）蛋白抗原和血清标志物之间的关系,探讨PreS1蛋白抗原检测在临床上的应用价值。 方法收集382例HBV患者血清样本,采用ELISA法检测HBVPreS1蛋白抗原和血清标志物,采用荧光定量PCR法检测HBV—DNA,并比较所有检测结果。 结果382例HBV患者血清样本PreS1蛋白抗原和HBV-DNA的检出率分别为33．8％和40．8％;其中HBeAg阳性的144例中,PreS1抗原阳性为112例,HBV-DNA阳性为134例,阳性率分别为77．8％和93．1％;HBeAg阴性的102例中,PreS1抗原阳性为17例,HBV-DNA阳性为22例,阳性率分别为7．1％和9．2％。HBV-DNA检出率稍高于PreS1抗原的检出率,但两者间检出率差异均无统计学意义（P〉0．05）。 结论HBVPreS1蛋白可反映HBV复制的情况,与HBV-DNA结果有较好的一致性,可作为临床上HBV感染诊断或监测的指标。     

HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒外膜大蛋白检测分析

目的 探讨血清乙型肝炎病毒外膜大蛋白(HBV-LP)检测在HBeAg阴性慢性乙型肝炎中的诊断价值和临床意义.方法 分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法和实时荧光定量PCR法检测306份慢性乙型肝炎患者血清中HBV.M、HBV-LP和HBV.DNA.结果 (1)在未经过抗病毒治疗的患者中,HBV-LP阳性率和HBV DNA无明显差异,而且HBV-LP的吸光度(A值)和HBV DNA拷贝数呈正相关性;(2)在经过抗病毒治疗的患者中HBV-LP的阳性率明显高于HBV DNA.结论 血清中乙型肝炎病毒大蛋白水平能反映HBV感染者体内HBV复制程度,对于判断HBeAg阴性患者体内复制具有重要的临床意义.     

e抗原阳性慢性乙型肝炎患者血清HBV-DNA与HBsAg、HBeAg的相关性分析

目的 研究e抗原阳性慢性乙型肝炎患者外周血中HBV-DNA载量与乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）的相关性,及其在不同性别、年龄群体中的差异.方法 收集319例e抗原阳性慢性乙肝患者血清,采用实时荧光定量PCR法检测HBV-DNA载量,用时间分辨免疫荧光法检测HBsAg和HBeAg的浓度,利用SPSS软件做统计分析.结果 HBV-DNA载量与HBsAg含量有良好的相关性（r=0.514,P〈0.001）;与HBeAg含量有相关（r=0.337,P〈0.001）;女性的HBeAg水平要高于男性患者（P〈0.05）;年龄（31～50）岁组、〉50岁组的HBV-DNA、HBsAg 及HBeAg值皆高于年龄 〈30岁组 （P〈0.001）.结论 e抗原阳性慢性乙型肝炎患者血清中HBV-DNA载量与HBsAg、HBeAg定量水平皆有相关性,其中与HBsAg相关性更佳.     

应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒x抗原结合蛋白1结合的肝细胞蛋白编码基因

目的:构建乙型肝炎病毒x抗原结合蛋白1(XBP1)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与XBP1相互作用的基因。方法:通过PCR扩增获得XBP1基因,构建真核表达载体pGBKT7-XBP1,转化酵母菌AH109并在其中进行表达。随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-β-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆。提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-XBP1共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-β-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆。挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析。结果:筛选出20种与XBP1相互作用的蛋白,其中包括金属硫蛋白,平滑肌细胞相关蛋白,去唾液酸糖蛋白受体,丙酮酸脱氢酶激酶1,甜菜碱甲基转移酶,视黄醇结合蛋白,补体因子B、人补体C9,转化生长因子β1,丝氨酸蛋白酶抑制剂;cAMP应答元件结合蛋白,拓扑异构酶IIβ等已知功能基因及1个未知功能序列。结论:筛选到多种XBP1相互作用的基因,包括与细胞内结构、细胞生长相关蛋白基因,参与细胞内代谢的蛋白基因,参与信号转导途径、免疫及其他相关蛋白基因,参与DNA的复制、转录、重组、修复的基因。     

酵母双杂交技术筛选乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白的研究

目的　筛选与乙型肝炎病毒 (HBV)DNA聚合酶-N末端蛋白 (TP)相互结合的肝细胞蛋白 ,进一步探讨TP的生物学功能。方法　用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增TP片段 ,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH 10 9并在其内表达 ,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合 ,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖苷酶 (X-α-gel)上进行双重筛选阳性菌落 ,DNA序列测定并进行生物信息学分析。结果　成功获得了 4 7个与TP特异性结合的阳性克隆 ,包括人类固醇调节元件结合蛋白 1(SREBP1)、RNA聚合酶Ⅱ亚单位 (hsRPB7)、血浆铜蓝蛋白(CP)等 2 1种已知功能蛋白质基因和 19个假设蛋白基因。结论　HBVDNA聚合酶-TP可以与某些已知和未知功能蛋白相互结合 ,提示其具有较广泛的生物学功能     

慢性乙肝发生致死性重型肝炎与重叠嗜肝病毒感染及HBV e系统状态关系的研究

目的　为了查清慢性乙型肝炎 (慢性乙肝 )病程中发生致死性重型肝炎与重叠感染甲、丙、丁或戊型肝炎病毒以及乙肝病毒 (HBV)e系统状态的关系 ,以便采取相应措施降低慢性乙肝的死亡率。方法　用ELISA法检测慢性乙肝病程中发生致死性重型肝炎时重叠甲、丙、丁或戊型肝炎病毒的感染情况以及HBVe系统的状态。结果　在慢性乙肝病程中发生致死性重型肝炎的 2 19例患者中 ,甲、丙、丁或戊型肝炎病毒的重叠感染率分别为 1. 4 % (3 /2 19)、9.6 % (2 1 2 19)、1.8% (4 2 19)和30.1% (6 6 / 2 19) ,重叠嗜肝病毒的感染率之和为 4 2.9% (94 2 19)。其中 ,以戊型肝炎病毒为主 ,并且近10年来感染率基本没有改变。原因未明者为 5 7.1% (12 5 2 19)。HBeAg和抗 HBe的阳性率在甲、丙、丁或戊型肝炎病毒重叠感染组分别为 17.0 % (16 94 )和 5 4.0 2 % (5 1 94 ) ;原因未明组分别为 2 7.2 %(34 /12 5 )和 4 7.2 % (5 9/12 5 ) ,两组之间HBeAg和抗 HBe阳性率的比较差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。结论　研究结果提示 ,重叠嗜肝病毒感染是发生致死性重型肝炎的重要原因 ;严格饮食卫生和使用安全的血液制品可降低慢性乙肝的死亡率。未能发现HBVe抗原的血清转换与慢性乙肝患者病程中发生致死性重型肝炎有明确的关系     

HCV核心蛋白结合蛋白基因6的克隆

目的：克隆与丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白结合的肝细胞中的未知蛋白基因。方法：应用酶母双杂交系统，构建丙型肝炎病毒核心蛋白诱铒质粒，转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合，在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。筛选出30个克隆，既能在四缺营养缺陷培养基上生长(SD/Trp-Leu-Ade-His）又能在涂有x-α-gal的四缺培养平皿上长出蓝色菌落，提取此酵母克隆的质粒，转化大肠埃希菌后进行测序，进行生物信息学分析。结果：分析结果显示，其中6号克隆的测序结果与Genbank中的2个未知功能序列有98％的同源性，初步证明了此基因与丙型肝炎病毒核心蛋白有结合性。结论：丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白肝基因克隆成功。     

人源性抗HBc单链抗体的筛选、鉴定及基因序列测定

目的:筛选人源性抗乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)单链抗体(ScFv)并在体外原核表达、鉴定和基因序列测定, 为抗HBcScFv的进一步研究奠定基础。方法: 采用噬菌体表面展示技术, 以乙肝病毒核心抗原为包被抗原, 从人源性单链噬菌体抗体库中经过3轮"吸附-感染-扩增"的筛选过程, 获得抗原结合活性较强的人源性抗HBc单链抗体阳性克隆, 并在大肠杆菌HB2151中进行ScFv可溶性表达, 对其进行免疫学鉴定和序列测定。结果:筛选出的ScFv具有抗HBc的特异性, 并可在大肠杆菌中进行可溶性表达;基因序列测定表明, 该ScFv的重链段基因与人类免疫球蛋白重链可变区相符, 轻链段基因为人类免疫球蛋白κ轻链可变区。结论:利用噬菌体抗体库技术, 成功筛选出人源性抗HBcScFv并获得其基因序列。     

羧甲基茯苓多糖对HBV转染细胞表达功能影响的实验研究

目的研究羧甲基茯苓多糖在2.2.15细胞株培养中抗乙型肝炎病毒(HBV)的作用。方法分别采用20.0、12.0、6.0、3.0、1.5g/L的药液,在2.2.15细胞株培养中观察其对细胞的毒性和对HBsAg和HBeAg分泌的抑制效果。结果羧甲基茯苓多糖对2.2.15细胞株的50%毒性浓度(TC50)为13.6g/L,对2.2.15细胞株HBsAg、HBeAg分泌的半数有效浓度(IC50)为4.45、5.61g/L,治疗指数(TI)值为3.06和2.42,高于已用于临床抗病毒的阿昔洛韦。结论羧甲基茯苓多糖在2.2.15细胞株培养中对HBsAg和HBeAg分泌有较好的抑制作用。     

HBV cccDNA在2.2.15细胞表达的动态观察

目的研究2.2.15细胞中是否存在HBVcccDNA,探讨2.2.15细胞内HBV产物的动态表达规律。方法采用PCR方法检测2.2.15细胞内cccDNA,Taqman定量PCR技术检测2.2.15细胞内及培养上清中HBVDNA含量,EIA方法检测培养上清中HBsAg、HBeAg的动态表达,并进行定量资料相关性统计学分析。结果2.2.15细胞及培养上清中存在cccDNA,2.2.15细胞培养上清中HBVDNA与HBsAg、HBeAg之间存在相关性(r=0.833,P<0.05和r=0.939,P<0.01),而细胞内HBVDNA与培养上清HBVDNA及HBsAg、HBeAg之间无相关性(r=0.024,P>0.05和r=0.177,P>0.05)。结论为阐明2.2.15细胞内HBV的复制规律提供一定依据。     

Hepatitis B virus genotypes and spontaneous hepatitis B e antigen seroconversion in Taiwanese hepatitis B carriers

Hepatitis B virus (HBV) is classified into eight genotypes (A-H), and genotype C is associated with more aggressive liver disease compared to genotype B. However, the mechanisms responsible for the clinical differences remain unclear. To test whether genotype C patients had with lower rates of spontaneous hepatitis B ge antigen (HBeAg) seroconversion than genotype B patients, stored serum samples from 146 Taiwanese adult HBeAg-positive hepatitis B carriers followed-up for a mean of 52 months (range, 12-120 months) were tested for HBV genotype by a molecular method. Genotype C patients were significantly older than genotype B patients (mean age, 37 +/- 12 vs. 29 +/- 10 years, P < 0.001). During the follow-up period, genotype C patients had a significantly lower rate of spontaneous HBeAg seroconversion than genotype B patients (27 vs. 47%, P < 0.025). Spontaneous HBeAg seroconversion occurred one decade later in genotype C patients compared with genotype B patients. Multivariate analyses identified age < or =35 years (odds ratio: 2.08; 95% confidence interval [CI], 1.07-4.0; P < 0.05), high baseline serum alanine aminotransferase level (odds ratio: 2.34; 95%CI, 1.39-4.09; P < 0.005), and HBV genotype B (odds ratio: 1.94; 95%CI, 1.03-3.63; P < 0.05) as independent factors associated with spontaneous HBeAg seroconversion. In conclusion, genotype C patients, compared to genotype B patients, have a delayed HBeAg seroconversion in the immune clearance phase of chronic HBV infection, which may contribute to a more progressive liver disease and more refractory to antiviral therapy.     

Persistence of intrahepatic hepatitis B virus DNA integration in patients developing hepatocellular carcinoma after hepatitis B surface antigen seroclearance

Background/AimsThe role of hepatitis B virus (HBV) integration into the host genome in hepatocarcinogenesis following hepatitis B surface antigen (HBsAg) seroclearance remains unknown. Our study aimed to investigate and characterize HBV integration events in chronic hepatitis B (CHB) patients who developed hepatocellular carcinoma (HCC) after HBsAg seroclearance.MethodsUsing probe-based HBV capturing followed by next-generation sequencing technology, HBV integration was examined in 10 samples (seven tumors and three non-tumor tissues) from seven chronic carriers who developed HCC after HBsAg loss. Genomic locations and patterns of HBV integration were investigated.ResultsHBV integration was observed in six patients (85.7%) and eight (80.0%) of 10 tested samples. HBV integration breakpoints were detected in all of the non-tumor (3/3, 100%) and five of the seven (71.4%) tumor samples, with an average number of breakpoints of 4.00 and 2.43, respectively. Despite the lower total number of tumoral integration breakpoints, HBV integration sites in the tumors were more enriched within the genic area. In contrast, non-tumor tissues more often showed intergenic integration. Regarding functions of the affected genes, tumoral genes with HBV integration were mostly associated with carcinogenesis. At enrollment, patients who did not remain under regular HCC surveillance after HBsAg seroclearance had a large HCC, while those on regular surveillance had a small HCC.ConclusionsThe biological functions of HBV integration are almost comparable between HBsAg-positive and HBsAg-serocleared HCCs, with continuing pro-oncogenic effects of HBV integration. Thus, ongoing HCC surveillance and clinical management should continue even after HBsAg seroclearance in patients with CHB.     

Immunoelectron microscopic localization of membrane attack complex and hepatitis B e antigen in membranous nephropathy

Summary Immunoelectron microscopy was used to localize membrane attack complex (MAC) and hepatitis B e (HBe) antigen in renal tissue specimens from a total of 9 patients with membranous nephropathy (MN); 6 with MN associated with a hepatitis B virus (HBV) infection, 2 with idiopathic MN, and 1 with lupus nephritis. All the patients were proteinuric, and 2 patients were classified as stage I-II, 6 as stage II, and 1 as stage IV. MAC, along with IgG and C3, was distributed within the subepithelial electron dense deposits in all the stages. MAC was also stained in the striated membranous structures within the glomerular basement membrane and mesangial matrix of some patients. In HBV-associated MN, HBe antigen was localized in the subepithelial electron dense deposits of 5 patients, while it was absent from the subepithelial deposits in a patient that was sero-positive for hepatitis B s antigen but negative for HBe antigen. This patient also lacked MAC deposition in these loci. These results suggest that MAC is associated with the formation of subepithelial deposits and proteinuria in MN. In HBV-associated MN, HBe antigen-antibody immune complex makes up the subepithelial deposits and is likely to activate the terminal components of complementin situ.