RNA干扰抑制小鼠OX40基因表达的实验研究

目的研究靶向小鼠OX40基因的二聚体小干扰RNA(siRNA-OX40)对靶基因表达的沉默作用。方法建立并筛选稳定表达OX40基因的293T转染细胞株,用脂质体转染法将体外合成的siRNA-OX40转染上述细胞株,采用实时荧光定量PCR检测靶基因OX40 mRNA表达情况。结果用不同浓度的siRNA-OX40转染细胞48h,10nmol/L浓度对293T细胞靶基因表达的抑制作用最强(抑制率76.4%),1nmol/L浓度仍有一定的抑制作用(39.4%);25、10nmol/L siRNA转染293T细胞后,均在24h内起效(24.9%,20.5%),抑制作用至少能维持72h(74.4%,38.8%)。结论siRNA-OX40对293T细胞外源性靶基因表达有较强的特异性沉默作用,siRNA在24h内起效,48～72h达高峰,抑制作用至少能维持72h。本研究结果为下一步在动物或临床进行siRNA干扰试验提供了实验依据。     

小干扰RNA对大鼠OX40基因表达的沉默作用

目的:研究靶向大鼠OX40基因的二聚体小干扰RNA(siRNA-OX40) 对靶基因表达的沉默作用.方法:建立并筛选稳定表达OX40基因的293T转染细胞株,用脂质体转染法将体外合成的siRNA-OX40转染上述细胞株,采用实时荧光定量PCR检测靶基因OX40 mRNA表达情况.结果:用不同浓度的siRNA-OX40转染细胞48小时,10 nmol/L浓度对293T细胞靶基因表达的抑制作用最强 [抑制率(68.3±8.7)%],1 nmol/L浓度仍有一定的抑制作用[(37.2±4.8)%];25、10 nmol/L siRNA转染293T细胞后,均在24小时内起效[(21.4±3.2)%,(26.8±3.8)%],抑制作用至少能维持72小时[(61.7±8.4)%,(39.6±5.6)%].结论:siRNA-OX40对293T细胞外源性靶基因表达有较强的特异性沉默作用,siRNA在24小时内起效,48～72小时达高峰,抑制作用至少能维持72小时.本研究结果为下一步在动物或临床进行siRNA干扰试验提供了实验依据.     

特异siRNA抑制宫颈癌细胞中人乳头状瘤病毒16型E6表达的研究

目的 优化HPV-16 E6癌基因特异的U6质粒表达的siRNA，抑制HPV癌基因表达及其对子宫颈癌细胞生长繁殖的影响。方法 选择4个分别针对HPV-16 E6 mRNA外显子和内含子序列为靶序列，合成DNA链，构建表达HPV-16 E6短发卡样dsRNA的重组pSilencer1．0-U6载体，导入HPV-16DNA阳性的宫颈癌细胞株CaSki中，观察该细胞中HPV-16 E6、E7基因表达水平及其蛋白含量的变化，并观察细胞生长被抑制的情况。结果 4种HPV-16 E6 siRNA均能降低宫颈癌细胞CaSki的生长速率。通过细胞生长曲线观察到HPV-16 E6 shRNA表达质粒导入细胞0-96h内，可降低细胞生长速度。荧光定量RT-PCR检测HPV-16 E6 siRNA可使宫颈癌细胞株CaSki中HPV-16 E6、E7基因转录的mRNA水平降低，其中针对E6 mRNA内含子的重组shRNA只抑制E6基因的表达水平。Western blot分析表明，4个HPV-16 E6 siRNA作用72h后，未能检测到宫颈癌细胞中HPV-16 E6蛋白。结论 HPV-16 E6 siRNA能使宫颈癌细胞CaSki生长缓慢；选择针对E6内含子的siRNA作用位点，特异性抑制E6表达；而针对E6外显子的siRNA作用位点，可抑制E6和E7基因的表达，是用于治疗HPV阳性宫颈癌细胞的理想靶位。     

脂质体RNAiMAX介导siRNA转染沉默星形胶质细胞AQP4基因

目的明确脂质体RNAiMAX(lipofectamine RNAiMAX)是否可以介导小干扰RNA(siRNA)转染入原代培养星形胶质细胞并实现水通道蛋白4(AQP4)基因沉默。方法利用原代培养的Wistar大鼠大脑皮层星形胶质细胞,通过倒置荧光显微镜和Tecan酶标仪,观察lipofectamine RNAiMAX是否能介导Cy3标记的siRNA转染入细胞内,以及RNAiMAX浓度和siRNA浓度对转染效率的影响;利用Real-time PCR方法检测AQP4 siRNA转染的基因沉默效果。结果倒置荧光显微镜和Tecan酶标仪检测发现,随着siRNA和RNAiMAX浓度的增加,转染细胞荧光强度随之增加(n=6);Real-time PCR检测结果显示,3ml/L RNAiMAX和30nmol/L AQP4 siRNA以及6ml/L RNAiMAX和60nmol/L AQP4 siRNA转染星形胶质细胞24h、48h、72h时,AQP4 mRNA水平均降低80%以上(n=6)。结论 Lipofectamine RNAiMAX可以介导siRNA转染入原代培养星形胶质细胞中并实现AQP4基因的沉默,3ml/L RNAiMAX和30nmol/L AQP4 siRNA即可达到理想的沉默效果。     

siRNA沉默LBH基因促进人支气管上皮细胞周期进展

目的: 利用合成的小分子干扰RNA(siRNA)转染人支气管上皮细胞16HBE,观察LBH(limb-bud and heart) 基因表达下调对16HBE细胞周期及相关基因表达的影响。方法: 脂质体2000转染靶向LBH 基因的siRNA到16HBE细胞,荧光定量RT-PCR检测siRNA转染后LBH基因表达,流式细胞术检测LBH基因沉默后16HBE 细胞周期的改变,荧光定量RT-PCR及Western blotting检测LBH基因沉默后细胞周期素E1和E2表达水平。结果: 50 nmol/L siRNA转染16HBE细胞48 h后, LBH基因的表达水平只有对照组的14%;siRNA转染16HBE细胞48 h,其G₁期细胞百分率比对照组减少9.28%,而S期细胞百分比增加14.08%;16HBE细胞在50 nmol/L siRNA的转染后,细胞周期素E2的表达水平为对照组的2倍,而细胞周期素E1的表达没有发生明显改变。结论: 靶向于LBH基因的siRNA能有效沉默16HBE细胞中LBH基因的表达,LBH基因的表达下调促进了16HBE细胞周期G₁/S期的进展;细胞周期素E2的表达上调参与了LBH沉默导致的细胞周期G₁/S期的进展。     

Hax1基因及其特异性小干扰RNA对人胚肾293细胞凋亡的影响

目的构建Hax1基因特异性小干扰RNA(sihax),检测sihax对Hax1基因的表达抑制,在293细胞中研究Hax1和Hax1siRNAs对细胞凋亡的影响。方法设计Hax1siRNA序列构建真核表达载体并转染到293细胞,倒置荧光显微镜下观察、流式细胞仪、AnnexinV-EGFP/PI双染法及RT-PCR检测靶基因Hax1的表达,以及293细胞的凋亡。结果成功构建了Hax1siRNA干扰质粒pBS/U6-sihaxA和pBS/U6-sihaxB,并且sihaxB对Hax1抑制效应明显强于sihaxA。过量表达Hax1可显著抑制293细胞的早期凋亡比例。用sihaxA和sihaxB抑制内源性Hax1表达,可使晚期细胞凋亡比例从对照的9.03%±0.473%分别增加到10.8%±0.513%(P<0.05)和16.6%±0.858%(P<0.01)。与此同时,sihaxB还可使早期细胞凋亡比例由37.3%±0.5%降低到32%±1.77%(P<0.01)。结论 Hax1siRNA对靶基因Hax1的抑制作用与靶序列的保守性有一定相关性。Hax1基因在细胞中参与凋亡相关的多种调节过程。本研究为进一步探讨Hax1...     

siRNA对γδT细胞Eomes基因表达的抑制功能研究

本文旨在探讨RNA干扰对人外周血γδT细胞Eomes基因的表达和产生IFN-γ的抑制效应。化学合成3对EomessiRNA,脂质体转染试剂介导siRNA转染到用结核杆菌(Mtb)抗原刺激的人外周血单个核细胞中(主要是γδT细胞),通过转染条件优化后,对转染了siRNA的γδT细胞采用流式细胞术(FCM)进行分选,利用RT-PCR检测转染细胞EomesmRNA表达抑制率,以FCM检测转染前后γδT细胞IFN-γ产生的情况。结果显示,有2对siRNA能有效抑制Eomes的mRNA表达,并对γδT细胞IFN-γ的产生起抑制作用。提示Eomes siRNA可特异地抑制γδT细胞Eomes基因表达,Eomes可能是调控γδT细胞产生IFN-γ的重要转录因子。     

TCAB1基因RNAi慢病毒载体的构建及在人子宫内膜间质细胞中沉默TCAB1基因的效应

目的构建TCAB1基因RNAi慢病毒载体,为子宫内膜异位症(EMs)的基因靶向治疗提供理论依据。方法化学合成3条靶向TCAB1基因的siRNA,转染HEK-293T细胞,24h后采用荧光素酶报告系统筛选有效siRNA,其对TCAB1mRNA有明显抑制作用。针对已经筛选确定的TCAB1基因RNAi有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经XhoI和HpaI酶切后的LV1载体[含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)]连接产生LV1-shRNA慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LV1-shRNA、pRev、pVsvg、pcgv四质粒共转染包装细胞HEK-293T细胞,包装产生慢病毒,分别于转染后48h、72h收取病毒上清,感染人子宫内膜间质细胞(ESC),进行RT-qPCR检测TCAB1基因相对表达量,检测LV1-shRNA干扰效率。结果 PCR和测序证实,成功构建TCAB1 shRNA的慢病毒载体LV1-shRNA。结论成功构建TCAB1基因的RNAi慢病毒载体,其转染ESC细胞后显著抑制了TCAB1的表达,为子宫内膜异位症的基因靶向治疗提供了实验基础。     

RNA干扰阻抑Bax inhibitor-1(bi-1)基因表达对卵巢癌细胞凋亡的影响

目的： 研究RNA干扰(RNAi)效应对人卵巢癌细胞株HO8910PM和HO8910中bi-1基因表达的抑制作用和凋亡诱导作用。 方法： 把表达bi-1 shRNA的各重组干扰质粒转染到HO8910PM和HO8910细胞中,RT-PCR和Western blotting法检测bi-1基因mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术和Hoechst 33258/PI荧光染色检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果：与对照组细胞相比较,转染4种候选干扰质粒组细胞中bi-1的mRNA和蛋白表达水平均明显下降（P<0.05）,以转染pmU6-b4组细胞的表达抑制率最高,在HO8910PM细胞中的抑制率分别为 (45.50±3.04）%和(51.08±4.96）%,在HO8910细胞中的抑制率分别为 (37.29±3.69）%和(44.96±4.28）%;流式细胞术结果表明,与对照组细胞相比较,转染pmU6-b4质粒24 h、48 h、72 h、96 h的HO8910PM细胞中亚二倍体峰比值明显升高 (P<0.05),以转染72 h组细胞的比值最高,达到 (25.89±5.63）%,而HO8910细胞中无亚二倍体峰出现;荧光显微镜下可见转染pmU6-b4质粒72h的HO8910PM细胞出现细胞核缩小、染色质固缩和核断裂,而HO8910细胞核无明显变化。 结论： 针对bi-1的siRNA能特异有效地下调HO8910PM和HO8910细胞中bi-1基因的表达,不同序列特异性的siRNA下调bi-1基因表达的能力不同;瞬时转染质粒pmU6-b4能有效诱导HO8910PM细胞凋亡,但不能诱导HO8910细胞凋亡。     

激素对T淋巴细胞生长激素基因表达调控的影响1

目的探讨各种激素对T淋巴细胞GH基因表达的影响.方法构建含人GH调控序列的荧光素酶报告基因质粒PGL2-GH-luc,然后转染入T淋巴细胞系--JurkatE6-1细胞中,在培养液中分别加入各种激素.结果各浓度的GH、GHRH对Jurkat细胞中荧光素酶的表达有抑制作用(P＜0.01),而高剂量的TRH(10、100nmol/L)和SS(100nmol/L)对Jurkat细胞中荧光素酶的表达也有抑制作用(P＜0.05).结论T淋巴细胞中GH基因的表达受下丘脑激素和GH的调节.     

广州东部妇女宫颈人乳头瘤病毒16型感染及基因分析

目的 研究广州东部妇女中人乳头瘤病毒16型(HPV-16)宫颈感染分布,分析其早基因E6/E7的多态性,分析L1和E6基因定量与病程的关系.方法 通过导流杂交基因芯片技术检测宫颈脱落细胞的HPV-16感染;通过特异性扩增获取病毒早基因E6/E7序列,克隆测序并进行多态性分析;荧光定量PCR技术对E6基因和L1基因进行定量分析.结果 806例宫颈脱落细胞样本中HPV-16感染阳性36例(4.5%),其中18例(50.0%)宫颈细胞发生高度以上病变;7例(4例低度或以下病变,3例高度以上病变或浸润癌)阳性标本得到E6/g7序列有15个位点分别出现变异;高度病变组(A组,11例)与低度或以下病变组(B组,14例)的L1基因和E6基因定量数据对数值均有显著差异(P<0.05),但L1/E6比值差异无统计学意义(P=0.19).结论 本地区在17～62岁妇女中HPV-16感染阳性发生率约4.5%,50.0%发生高度以上宫颈病变,本研究显示病毒基因拷贝数与宫颈病变程度可能有关,L1/E6比值未能提示病毒整合的发生.     

人乳头状瘤假病毒中和抗体滴度和ELISA法测定的小鼠血清抗体滴度的相关性研究

目的 探讨两种不同的报告基因纽扣珊瑚绿色荧光蛋白(Zoanthus sp.green fluorescent protein,ZsGreen)和分泌性碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)测量的人乳头状瘤假病毒中和滴度之间的相关性,以及中和滴度和抗体滴度的相关性.方法 将密码子优化的人乳头状瘤病毒(HPV)衣壳蛋白L1、L2基因表达质粒和报告基因质粒共转染293FT细胞,48 h后收集细胞裂解上清,柱层析纯化假病毒,对假病毒滴度进行测定.采集免疫过候选HPV疫苗和Gardasil疫苗的小鼠血清,测量血清的中和滴度和抗体滴度.结果 经统计分析,这两种报告基因系统的假病毒检测的中和滴度结果高度相关(Spearman相关系数r=0.760),而且中和滴度和抗体滴度的相关度很高(Spearman相关系数r=0.577和0.741).结论 两种不同的报告基因ZsGreen和SEAP测量的HPV假病毒中和滴度之间,以及中和滴度和ELISA测定的抗体滴度之间高度相关,揭示了部分HPV疫苗预防病毒入侵的机制,为快速准确鉴定HPV-16和HPV-18候选疫苗的免疫保护效果奠定了基础.     

密码子优化HPV16衣壳基因真核共表达载体的构建及细胞转染

目的:构建密码子优化的HPV16衣壳基因真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2.方法:用PCR技术从988载体中获得L1-IRES-L2片段,将该片段克隆到pCR -XL-TOPO 载体,然后定向亚克隆到pcDNA3.1( )真核表达载体中,从而构建真核共表达载体pcDNA3.1-L1-IRES-L2;通过水动力转染技术(hydrodynamics-based transfection)和脂质体细胞转染法(liposome-mediated transfection of cells),检测衣壳基因的体内、外转录情况;重组质粒转染后293T细胞后观察其形态变化,用Western blot方法检测293T细胞中L1衣壳蛋白的表达.结果:酶切和测序结果表明真核共表达载体pcD-NA3.1-L1-IRES-L2构建正确.重组质粒中的L1和L2基因在小鼠肝脏、293T细胞中均发生转录.重组质粒转染293T细胞后出现CPE(cytopathic effect)现象,表明衣壳基因在细胞中已表达.Western blot方法检测发现L1蛋白在293T细胞中表达.结论:成功地构建了pcDNA3.1-L1-IRES-L2共表达真核载体,为进一步研究HPV16感染机制奠定基础.     

Prediction of conserved microRNAs from skin and mucosal human papillomaviruses

Eight human papillomavirus (HPV) types including four cutaneous HPV types (HPV-5, HPV-8, HPV-20 and HPV-38) and four mucosal HPV types (HPV-6, HPV-11, HPV-16 and HPV-18) were selected for this miRNA study. Pre-miRNAs were predicted using a computer programme, and the conserved mature miRNAs were compared to currently known miRNAs. Predicted HPV miRNAs related to miR-466, -467 and -669 were common and specific to the mucosal HPV types. Northern blot hybridization confirmed a predicted miRNA in HPV-positive cervical cancer cell lines encoded by mucosal HPVs. HPV-38 was predicted to express an miRNA conserved to human let-7a and the expression of let-7a, in HPV-38-positive non-melanoma skin cancer (NMSC) biopsies was 10-fold higher than those with HPV-positive (for other types except HPV-38) and HPV-negative NMSCs, suggesting that let-7a expression might be related to HPV-38 infection. Potential gene targets of the predicted miRNA that may aid HPV in infection and pathogenesis were also analysed.     

E6 and E7 oncoproteins from human papillomavirus type 16 induce activation of human transforming growth factor beta1 promoter throughout Sp1 recognition sequence

Human Papillomavirus (HPV) infection is the main etiologic agent of cervical cancer and HPV E6 and E7 oncogenes trans-regulate many cellular genes. An association between TGF-beta1 gene expression and cervical cancer development has been suggested; however, the mechanisms by which HPV influences TGF-beta1 expression remain unclear. In the present study we analyzed the mechanism through which HPV-16 E6 and E7 oncoproteins regulate the TGF-beta1 promoter in cervical tumor cells. Our results showed that E6 and E7 increased TGF-beta1 promoter activity. Furthermore, we identified a specific DNA sequence motif in the TGF-beta1 core promoter that is responsible for trans-activation and that corresponds to the Sp1e-binding site associated with HPV-16 E6 and E7 oncoproteins. Mutational analysis showed that the Sp1e recognition site abolished the trans-activation caused by E6 and E7. These results suggest a physical interaction and functional cooperation between viral oncoproteins and cellular regulatory elements of the TGF-beta1 promoter, and may explain the contribution of HPV-16 to TGF-beta1 gene expression in cervical cancer.     

RNAi沉默Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的抑制

目的：研究Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的影响。方法:设计合成针对Cripto基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，转染结肠癌LS-174T细胞。细胞分4组：空载对照组（对照组）和不同浓度（3.125、6.25和12.5 nmol/L）的siRNA组。分别于转染24、48、72 h后收集细胞，以实时定量PCR检测结肠癌细胞Cripto mRNA，分别采用Northern blotting和免疫荧光标记法检测癌细胞VEGF mRNA和蛋白表达。分别收集转染72 h的12.5 nmol/L组和对照组细胞，接种于裸鼠背部。30 d后处死裸鼠，收集裸鼠肿瘤组织，对组织VEGF进行免疫组化染色，计算染色平均强度。结果:实时定量PCR检测显示，转染组Cripto mRNA被有效地抑制，且呈浓度和时间依赖性。转染组细胞VEGF 蛋白和mRNA明显低于对照组。裸鼠肿瘤免疫组化分析显示，转染组VEGF平均染色强度明显低于对照组。结论:Cripto基因参与了结肠癌组织血管生成的调控。采用siRNA下调Cripto基因表达，可抑制结肠癌组织血管生成。     

HPV16 L1/E6-E7基因嵌和DNA疫苗质粒构建及其在CHO细胞表达的初步研究

目的：构建HPV 16 L1－E6、HPV16 L1－E7预防、治疗性DNA疫苗质粒。方法：运用PCR大引物定点诱变法逐个突变E6、E7基因与转化作用有关的位点，PCR产物连接至pGEMT-Easy质粒，测序鉴定突变基因正确后，分别均与L1基因共同连接并至真核表达载体pVAX1，得到真核表达质粒1MpVAX1-L1E6,2MpVAX1-L1E6,1MpVAX1-L1E7,2MpVAX1-L1E7,3MpVAX1-L1E7。运用磷酸钙法将所获得的质粒转染CHO细胞，以HPV－16L1特异性单克隆抗体进行转染细胞中L1蛋白表达的ELISA和免疫组化的检测。结果：ELISA检测显示转染各种L1－E6、L1－E7融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P／N值均＞2．1；免疫组化检测在胞质胞核可见棕黄色点状阳性产物沉积。结论：所构建的L1－E6、L1－E7融合蛋白表达质粒可在体外表达L1蛋白，为今后进行DNA疫苗动物实验和临床试验研究做好准备。     

增殖细胞核抗原 siRNA 序列的设计、合成与筛选

目的：设计并筛选能有效抑制人肝癌SMMC-7721细胞、人结肠癌Caco2细胞、人胃癌SCG-7901细胞增殖的增殖细胞核抗原(PCNA) siRNA。方法:总结以往提出的siRNA 设计原则的基础上，设计4 条PCNA siRNA，体外转录合成PCNA siRNA；并作用于3 种肿瘤细胞，WST-8法检测细胞增殖活性，筛选能有效抑制肿瘤细胞增殖的siRNA序列；RT-PCR检测细胞PCNA mRNA水平；免疫细胞化学方法检测 PCNA 蛋白表达水平。结果:4 条PCNA siRNA中，有3 条序列（No.2、No.4、No.3）的siRNA能有效抑制3 种肿瘤细胞的增殖；其中No.2、No.4作用效果最优，以50 nmol/L浓度作用48 h，对3种肿瘤细胞的增殖抑制率均可达到62％以上，No.2、No.4 PCNA siRNA均能在mRNA和蛋白水平显著下调PCNA的表达。结论:PCNA siRNA能在体外有效抑制SMMC-7721细胞、Caco2细胞、SCG-7901细胞的增殖，其适宜作用浓度为50 nmol/L，适宜作用时间为48 h。