华支睾吸虫病金标诊断试剂盒的研制和现场初步实验

目的　研制华支睾吸虫病金标快速免疫诊断试剂盒 ,评价其敏感性、特异性和现场试用效果。　方法　以华支睾吸虫成虫水溶性抗原、分泌排泄抗原和重组抗原磷酸甘油酸激酶 (PGK)作为诊断试剂 ,制备胶体金免疫层析检测 (Im-munochromatography test,ICT)试剂盒 ,检测患者血清和唾液中抗华支睾吸虫 Ig G,并与常规 EL ISA血清学检测方法和粪便虫卵检查法相比较。　结果　实验室检测临床确诊的华支睾吸虫病人血清中特异的 Ig G,3种抗原的敏感性均为10 0 %。天然抗原除与慢性血吸虫病人血清有较强的交叉反应外 ,与囊虫、包虫、弓形虫病人血清没有交叉反应。重组PGK抗原同慢性血吸虫病人血清也没有交叉反应。用分泌排泄抗原制备的 ICT检测试剂盒在流行区现场检测被调查者的血清和唾液 ,总符合率为 92 .31% ;ICT与 EL ISA血清检测的总符合率为 81.5 4 %。现场获取了 9人的粪便样本 ,其中 4人检出华支睾吸虫卵 ,其血清 ICT和 EL ISA检测均呈强阳性 ,另外未检出虫卵的 5人中 ,1人血清 ICT和 EL ISA均呈阳性 ,另 1人仅血清 EL ISA呈弱阳性。　结论　诊断华支睾吸虫感染的 ICT抗体检测技术 ,尤其是无创性唾液检测技术 ,简便、快速、准确、安全 ,优于血清 EL ISA检测和粪便虫卵检测 ,适用于临床检验和现场大规模流行病     

斯氏狸殖吸虫幼虫排泄分泌抗原Dot—ELISA诊断肺吸虫病研究

目的 探索斯氏狸殖吸虫幼虫排泄分泌抗原的免疫诊断价值。方法 采用斯氏狸殖吸虫幼虫排泄分泌抗原Dot-ELISA检测28例斯氏狸殖吸虫病人血清、6份日本血吸虫病人血清、4份华支睾吸虫病人血清、20份健康 人血清中抗斯氏狸殖吸虫幼虫排泄分泌抗原的抗体IgG。结果 斯氏狸殖吸虫幼虫排泄分泌抗原与28例斯氏狸殖吸虫病人血清均呈阳性反应,与其它2种吸虫病和健康人血清未发生反应。结论 斯氏狸殖吸虫幼虫排泄分泌抗原Dot-ELISA为诊断肺吸虫病敏感、特异的诊断方法。     

酶联免疫吸附试验诊断华支睾吸虫病初步观察

实验感染兔取成虫制成1％华支睾吸虫成虫可溶性抗原。以1:1500包被ELISA板诊断华支睾吸虫病人血清,与粪检阳性符合率88.1％,健康人血清阴性符合率97.1％。用滤纸干血代替血清阳性符合率为87.0％,阴性符合率为85.4％,而在非流行区人群采滤纸干血阴性符合率则为95.1％。与丝虫病人血清未见交叉反应;与疟疾的交叉反应为3％;与血吸虫病的交叉反应为6.66％。结果表明应用ELISA诊断华支睾吸虫病是一种敏感性高、特异性强、重现性良好的免疫诊断方法,现场应用滤纸干血方法简便、微量,值得推广。     

组分抗原斑点金标免疫渗滤法检测血吸虫短程抗体的研究

目的建立一种可用于检测血吸虫病人短程抗体的斑点金标免疫渗滤法（dot immuno-gold filtration assay,DIG-FA）。方法将血吸虫可溶性虫卵组分抗原（107～121 kDa）包被于混纤膜上,以胶体金标记的抗人IgG为二抗,建立组分抗原-DIGFA。用该法检测慢性血吸虫病人、健康人、卫氏并殖吸虫病人和华支睾吸虫病人血清。同时与血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）-DIGFA比较。结果检测54份慢性血吸虫病人血清,组分抗原-DIGFA敏感性为94.4%,SEA-DIGFA敏感性为96.3%,两种方法检测50份正常人血清的特异性均为100%。检测19份卫氏并殖吸虫病人血清和30份华支睾吸虫病人血清,SEA-DIGFA敏感性分别为26.3%和10.0%,组分抗原-DIGFA均未检出阳性反应。结论应用组分抗原-DIGFA检测血吸虫短程抗体具有较高的敏感性和特异性,且与其他吸虫病几乎无交叉反应,特异性优于SEA-DIGFA。     

华支睾吸虫重组半胱氨酸蛋白酶用于血清学调查的效果评价

目的 以华支睾吸虫重组半胱氨酸蛋白酶(CsCp)为ELISA包被抗原检测流行人群血清特异性抗体水平,与成虫粗抗原比较,评价其用于华支睾吸虫病血清学调查的价值. 方法 以佛山市南海区的1个行政村为调查点,用改良加藤厚涂片法检查粪便华支睾吸虫虫卵.同时采集血清,分别以rCsCP与成虫粗抗原(CsCAA)的ELISA方法检测血清特异性抗体水平,对粪检及两种抗原的ELISA结果进行统计学分析. 结果 接受血清检测的97人中,华支睾吸虫虫卵阳性率60.8%,CsCAA-ELISA阳性率75.3%,rCsCP-ELISA阳性率76.3%,特异性抗体阳性率高于虫卵阳性率(P<0.05),不同抗原ELISA阳性率差异无统计学意义(P>0.05);CsCAA-ELISA、rCsCP- ELISA结果与粪检结果的符合率分别为56.7%和55.7%,两种抗原ELISA结果的符合率为82.5%.59例粪检阳性者CsCAA-ELISA和rCsCP-ELISA阳性率均为76.3%,38例粪检阴性者CsCAA-ELISA和rCsCP-ELISA阳性率分别为73.7%和76.3%. 结论 以rCsCP为包被抗原,用ELISA检测华支睾吸虫病流行区人群血清特异性IgG抗体与使用CsCAA的检测结果有较高的符合率,但同样不能区分现症与既往感染.     

抗华支睾吸虫代谢抗原单克隆抗体的制备及鉴定研究

目的建立分泌抗华支睾吸虫代谢抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法用华支睾吸虫成虫代谢抗原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫全虫可溶性抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应。结果获得3株分泌高滴度抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应，3株单抗均属IgG。结论制备的抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗，为制备免疫诊断试剂盒奠定了基础。     

抗华支睾吸虫单克隆抗体的制备和鉴定

目的：建立分泌抗华支睾吸虫成虫的单克隆抗体杂交瘤细胞株并进行鉴定。方法：用华支睾吸虫成虫可溶性抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫虫卵抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应，用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定位。结果：获得５株分泌高滴度抗华支睾吸虫成虫单抗的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应；５株单抗均属ＩｇＭ；单抗所识别的抗原定位于华支睾吸虫肠管壁。结论：制备的抗华支睾吸虫成虫的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

排泄分泌抗原以ELISA法用于华支睾吸虫病血清学诊断优于粗抗原

粪检法是华支睾吸虫病的标准诊断方法 ,但由于依从性较差 ,应用起来有困难。为有效控制华支睾吸虫病 ,需要进行高效的群体检测。血清学诊断已快速发展起来并逐渐取代粪检法。虽然皮试法简单快速 ,但特异性较差 ,目前广为应用的是ELISA法。传统ELISA法用华支睾吸虫的粗抗原进行检测 ,敏感性和特异性较好 ,但存在交叉反应 ,因此需要更加敏感和特异的血清学诊断方法以检测华支睾吸虫病。本研究对华支睾吸虫的排泄分泌抗原 (ESA)检测抗体的ELISA法和粗抗原 (CA)检测抗体的ELISA法的诊断价值进行了比较和评估。收集流行区的华支睾吸虫…     

广西146例华支睾吸虫疑似感染者粪样虫卵和血清IgG抗体的检测分析

检测广西华支睾吸虫疑似感染者粪样华支睾吸虫/扇棘单睾吸虫虫卵和血清华支睾吸虫IgG抗体,分析二者的相关性,为华支睾吸虫感染的监测和诊断提供参考。收集2017年3-9月于广西疾病预防控制中心预防性健康体检科就诊的疑似华支睾吸虫感染者粪样,采用改良加藤厚涂片法(一粪三检)检查华支睾吸虫/扇棘单睾吸虫虫卵并计算每克粪样虫卵数(EPG)。同步收集粪检阳性患者的血液标本,采用间接ELISA法检测血清华支睾吸虫IgG抗体。分析EPG值与IgG抗体A_(450)值的相关性,并根据华支睾吸虫感染度分类标准,分析轻度、中度和重度感染者EPG值与血清IgG抗体阳性率以及IgG抗体定性结果与EPG值的关系。在146份华支睾吸虫/扇棘单睾吸虫虫卵阳性粪样中,EPG最大值为21 502,最小值为8。血清华支睾吸虫IgG抗体阳性率为84.9%(124/146),男、女性IgG抗体阳性率分别为86.0%(111/129)和13/17,差异无统计学意义(P 0.05)。感染者EPG值和IgG抗体A_(450)值呈正相关性(r_s=0.436, P 0.01)。轻度、中度和重度感染者IgG抗体阳性率分别为78.4%(69/88)、 96.0%(48/50)和7/8,差异有统计学意义(P 0.05)。华支睾吸虫血清IgG抗体阳性组和阴性组粪样几何均数(GM EPG)值分别为736和204,差异有统计学意义(P 0.01)。提示在华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫共感染的广西,粪样虫卵镜检和血清华支睾吸虫IgG抗体检测结果呈正相关;但单独粪便虫卵检查用于华支睾吸虫监测和诊断会存在误判,应辅助IgG抗体等血清学检测。     

重组抗原应用于SPG-ELISA检测华支睾吸虫循环抗体的效果评价

目的评价重组抗原用于SPG-ELISA诊断华支睾吸虫感染的价值。方法分别使用重组华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶（Cs-CysB）与华支睾吸虫成虫可溶性抗原（CAA）,以SPG-ELISA检测华支睾吸虫病患者血清特异性IgG,比较两种抗原包被SPG-ELISA方法的敏感性与特异性。结果检测50份华支睾吸虫感染者血清,重组Cs-CysB与CAA包被的SPG-ELISA阳性率均为94.00%,健康人血清50例均为阴性;检测日本血吸虫病血清20份、并殖吸虫病血清20份、囊虫病血清10份,交叉反应率分别为5.00%、10.00%、20.00%和5.00%、0、20.00%。结论以重组Cs-CysB为包被抗原用SPG-ELISA检测血清华支睾吸虫抗体具有较高的敏感性及特异性,检测效果与CAA包被的SPG-ELISA相当。     

华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a类抗原基因的克隆、表达和免疫学诊断价值评价

目的采取免疫学方法筛选华支睾吸虫成虫cDNA表达文库,寻找新的抗原基因。方法使用华支睾吸虫病人混合血清以及华支睾吸虫排泄分泌抗原的免疫小鼠血清,分别免疫学筛选华支睾吸虫成虫λ ZAP cDNA表达文库;将阳性噬菌体克隆、测序以及核苷酸序列比对分析;将目的基因的编码区克隆至原核表达质粒pET28a(+)中,采用制备不带N端融合标签的天然蛋白的策略表达融合蛋白,使用组氨酸标签亲和纯化柱（Ni NTA树脂）纯化融合蛋白;采用间接ELISA法,检测血清中的特异性抗体,共检测35例华支睾吸虫虫卵粪检阳性血清,36例正常人血清,15例日本血吸虫、15例卫氏并殖吸虫和13例猪囊尾蚴病人血清,评价重组蛋白的免疫学诊断价值。结果发现华支睾吸虫特异性富甘氨酸2a（GRA2a）类抗原基因家族,将其中的Cs4抗原基因植入重组表达质粒pET28a(+)的NcoI位点,成功实现融合蛋白的表达,并进一步纯化得到可溶性重组蛋白。采用间接ELISA法检测血清中的特异性抗体,该ELISA法的敏感性为80.0%,特异性为97.2%,总符合率为88.7%;日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴病人血清的假阳性率分别为6.7%、6.7%和7.7%。经核苷酸序列同源性比较,华支睾吸虫GRA2a类抗原是迄今为止尚未进行功能研究的华支睾吸虫特异性抗原。结论发现华支睾吸虫GRA2a类抗原基因家族;成功构建重组表达质粒,并表达、纯化出可溶性重组蛋白;该抗原具有较高的免疫学诊断价值。     

华支睾吸虫溶血磷脂酶在虫体组织定位及其特异性抗体类型分析

目的观察华支睾吸虫溶血磷脂酶(CsLysoPLA)在成虫的组织定位,分析其诱导人体产生的特异性抗体类型。方法应用免疫荧光方法,观察CsLysoPLA在成虫的组织定位;应用ELISA方法,CsLysoPLA重组蛋白检测25份华支睾吸虫病人血清的IgG1、IgG2、IgG4、IgE。结果CsLysoPLA定位于虫体的口吸盘、排泄囊、肠支、生殖孔,与虫体分泌/排泄抗原物质密切相关的部位;以CsLysoPLA重组蛋白检测华支睾吸虫感染者血清,IgG1抗体水平较高,IgG2抗体水平稍高,而感染者的IgG4、IgE水平则与健康人无明显差异。结论CsLysoPLA主要经虫体消化道、生殖道、排泄系统分泌/排泄到体外,刺激人体免疫系统产生Th2为主的免疫应答。     

华支睾吸虫未脱脂和脱脂成虫抗原的免疫印迹分析

目的 寻找华支睾吸虫成虫抗原中具有特异性诊断价值的抗原组分。方法 应用SDS—PAGE和Westernblot分析华支睾吸虫成虫未脱脂、脱脂的可溶性抗原蛋白组分的血清学反应特征。结果 未脱脂成虫抗原有14条蛋白带可与华支睾吸虫病病人血清反应，其中分子质量单位为180、170、100、67、41、37、35、32、26ku是主带，180、170、37、35ku条带还可与日本血吸虫病、卫氏并殖吸虫病病人血清发生交叉反应。脱脂成虫抗原有10条蛋白带可与华支睾吸虫病病人血清反应，其中分子质量单位为180、100、67、37、35、24、20ku是主带，此外，180ku带可与日本血吸虫病和卫氏并殖吸虫病病人血清发生交叉反应，78ku带可以与血吸虫病病人血清发生交叉反应。结论 华支睾吸虫成虫抗原经脱脂处理后可减少与日本血吸虫病和卫氏并殖吸虫病病人血清交叉反应的蛋白组分数量。华支睾吸虫未脱脂和脱脂成虫抗原中主要的特异性抗原组分分别是100、67、41、32、26ku和100、67、37、35、24、20ku，这些组分抗原可用于华支睾吸虫病的免疫诊断。     

华支睾吸虫成虫14～33 ku抗原诊断价值的研究

目的探讨纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原在华支睾吸虫病免疫诊断中的应用价值。方法使用SDS-PAGE和电洗提法,从可溶性华支睾吸虫成虫抗原中分离纯化14~33 ku抗原,用此抗原经ELISA方法检测华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病、日本血吸虫病、姜片虫病患者血清及健康人血清特异性IgG抗体,并与粗制可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原ELISA结果相比较。结果检测63例华支睾吸虫病患者血清,纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原ELISA阳性率为76.2%,可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原ELISA阳性率均为100%;检测25例卫氏并殖吸虫病、85例日本血吸虫病、27例姜片虫病患者血清,14~33 ku抗原的ELISA交叉反应阳性率分别为8.0%、3.5%、0,而可溶性成虫抗原分别为80.0%、62.4%、14.8%,可溶性成虫脱脂抗原分别为64.0%、55.3%、7.4%;检测127例健康人血清,14~33 ku抗原的ELISA假阳性率为0,可溶性成虫抗原和可溶性成虫脱脂抗原的假阳性率分别为5.5%、3.1%。结论纯化华支睾吸虫成虫14~33 ku抗原用于华支睾吸虫病免疫诊断的特异性优于粗抗原,但敏感性较低。     

ELISA检测华支睾吸虫病患者血清特异性IgG_4的诊断价值

目的　探讨用ELISA检测华支睾吸虫病患者血清中特异性IgG4 的诊断价值。　方法　用华支睾吸虫成虫可溶性抗原进行ELISA分别检测华支睾吸虫病患者 (76例 )血清中的特异性IgG和IgG4 抗体及日本血吸虫病、并殖吸虫病、囊尾蚴病患者 (分别为 63、3 5、41例 )和健康者 (65人 )血清中的交叉抗体。　结果　检测 76例华支睾吸虫病患者血清中IgG4 的检出率为 93 .42 % ,检测 65例健康者血清中的IgG4 均为阴性 ,分别与检测IgG结果比较差异均无显著性意义 (P均 >0 .0 5 ) ;与其它寄生虫病的交叉反应率 ,IgG4 显著低于IgG ;诊断效率及阳性、阴性预告值分别为 96.45 %、10 0 %和 92 .85 %。　结论　用ELISA检测华支睾吸虫病患者血清中特异性IgG4 具有较高的诊断应用价值。     

McAb Dot-ELISA检测血吸虫病循环抗原的现场应用及疗效考核

我们用中国预防医学科学院寄生虫病研究所检测血吸虫病人循环抗原的单克隆抗体Dot—ELISA(McAb Dot—ELISA)试剂盒在四川省几个地区作现场应用,结果如下.检测对象粪孵阳性的慢性血吸虫病人;健康献血员;华支睾吸虫病人;肺吸虫病人;不同血吸虫病流行区村民.     

快速ELISA法诊断血吸虫病的应用研究

目的对快速酶联免疫吸附试验（ELISA）的血吸虫病诊断实验条件进行优化,并观察其应用价值。方法同时将抗原、待测血清、HRP-SPA共置进行反应,替代常规ELISA法的分步反应。通过比较不同稀释度HRP-SPA的检测效果,确定其最佳工作浓度。观察待测血清和HRP-SPA不同混合反应时间对检测效果的影响,优化快速ELISA法的检测条件。用快速ELISA法、常规ELISA法和胶体染料试纸条法（DDIA）平行检测慢性血吸虫病人、华支睾吸虫病人及健康人血清,观察快速ELISA法的血吸虫病诊断实用价值。结果 HRP-SPA的最佳工作浓度为1∶2 000,待测血清和HRP-SPA最佳混合反应条件是37℃同步反应60 min。快速ELISA法检测慢性血吸虫病人血清抗体阳性检出率为93.8%,与华支睾吸虫病人血清的交叉反应率为4.0%,检测健康人血清的假阳性率为1.5%,与常规ELISA法和DDIA检测结果相似。结论快速ELISA法具有快速、简便等优点,是一种简便实用的血吸虫病免疫诊断方法。     

华支睾吸虫PPMPⅠ型抗原重组Cs2蛋白免疫诊断价值的评价

目的应用华支睾吸虫PPMPⅠ型抗原重组Cs2蛋白(rCs2)建立2种华支睾吸虫病免疫学检测方法,并进行初步评价。方法以可溶性rCs2作为诊断抗原,建立间接ELISA检测方法,并研制胶体金免疫层析检测(GICA)动力流体型试条,检测血清中的特异性抗体。采用ELISA法和GICA试条共检测35例华支睾吸虫虫卵粪检阳性患者、15例日本血吸虫病患者、15例卫氏并殖吸虫病患者和13例猪囊尾蚴病患者的血清,以及33份健康人血清。为进一步评价诊断价值,8只新西兰兔各感染600个华支睾吸虫囊蚴,随机均分为感染组和治疗组,感染第56天,治疗组各兔给予吡喹酮治疗[150 mg/(kg.d)×2 d],用ELISA法和GICA法检测两组兔0~44周抗rCs2特异性抗体的消长。结果 ELISA法的敏感性为71.4%(25/35),特异性为93.4%(71/76),总符合率为86.5%(96/111),与日本血吸虫病、卫氏并殖吸虫病和猪囊尾蚴病患者血清的交叉反应阳性率分别为1/15、1/15和1/13。GICA试条检测法的敏感性为85.7%(30/35),特异性为92.1%(70/76),总符合率为90.1%(100/111)。经EL...     

两种血吸虫病免疫诊断试剂盒临床诊断特异性的评价

目的评价胶体染料试纸条(DDIA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)两种试剂盒在血吸虫病临床诊断中的价值。方法采集非血吸虫病流行区的华支睾吸虫、并殖吸虫病人、健康正常人群血清和乙肝病人血清,按照单盲试验进行DDIA和ELISA检测。结果 DDIA和ELISA两种试剂盒,检测186份健康献血员的特异性分别为98．92％和99．6％,检测35例并殖吸虫病人的交叉反应率为42．86％和17．14％,检测31例华支睾吸虫病人的交叉反应率为9．68％和6．45％,检测159 份乙肝病人假阳性率分别为1．26％和5．03％;DDIA试剂盒与并殖吸虫病人的交叉反应显著高于 ELISA试剂盒(X2=5．510,P=0．019),DDIA试剂盒检测乙肝病人和健康正常人群的阳性率差异无显著性(X2=0．025,P=0．875),ELISA试剂盒检测乙肝病人的阳性率显著高于健康正常人群(X2 =6．814,P=0．009),其阳性率是健康正常人群的9．36倍。结论在血吸虫病现场筛查和医院门诊检查血吸虫病时,DDIA试剂盒优于ELISA试剂盒。     

肺吸虫抗体快速检测试剂盒(金标渗滤法)的研制和应用

目的开发研制简易、快速、经济、准确的肺吸虫病诊断试剂盒。方法以肺吸虫成虫可溶性蛋白为检测用抗原,以胶体金标记羊抗人IgG为探针,采用自行设计的渗滤装置,检测病人血清中肺吸虫特异性IgG抗体;用深圳康百得生物技术有限公司提供的肺吸虫抗体ELISA检测试剂盒作比较。结果用本试剂盒检测90人份肺吸虫病人血清和100人份健康人血清,其敏感性为98.9%(89/90),特异性为100%(100/100),Youden’s指数为0.989。用该试剂盒分别检测25人份血吸虫病和华支睾吸虫病患者血清,交叉反应率为24%(6/25)和4%(1/25);与姜片虫、囊虫、丝虫、肺结核病人血清均未见交叉反应。ELISA检测结果比较,符合率为93.5%,无显著性差异(χ2=0.7949,P>0.05)。结论肺吸虫抗体快速检测试剂盒(金标渗滤法)敏感性高、特异性强,可与ELISA相媲美,且操作更为简便、快速,结果判读容易,不需特殊仪器设备,非常适合临床检验和现场查病。