慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的抑制作用

目的观察慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子(PSF)对氧诱导视网膜病变(OIR)小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法5日龄C57BL/6J小鼠112只随机分为正常对照组、单纯OIR模型组、OIR模型+慢病毒空载体处理组(以下简称Vec组)及OIR模型+PSF慢病毒处理组(以下简称PSF组),分别为16、32、32、32只。小鼠7日龄时,正常对照组小鼠常规环境饲养;单纯OIR模型组、Vec组及PSF组小鼠建立OIR模型。小鼠12日龄时,Vec组、PSF组小鼠玻璃体腔分别注射滴度为1×1011 TU/ml的空载体病毒或PSF慢病毒1μl。正常对照组和单纯OIR模型组小鼠不再做任何处理。小鼠17日龄时,采用HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核;作视网膜铺片,测量各组小鼠视网膜无灌注区相对面积;采用实时定量PCR检测各组小鼠视网膜中NF-E2相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶1(HO-1)的mRNA相对表达量;采用Western blot检测各组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1及PSF的蛋白相对表达量。组间比较采用单因素方差分析。结果正常对照组、单纯OIR模型组、Vec组、PSF组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09个;视网膜无灌注区面积分别为0.00%、(35.71±2.81)%、(36.57±4.53)%、(15.33±4.75)%。4组间小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数及视网膜无灌注区面积比较,差异均有统计学意义(F=24.87、165.70,P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组较正常对照组突破内界膜的血管内皮细胞核数增多,视网膜无灌注区面积增大;PSF组较单纯OIR模型组、Vec组突破内界膜的血管内皮细胞核数减少,视网膜无灌注区面积减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。实时定量PCR及Western blot检测结果显示,4组间小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量(F=53.66、83.54)以及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量(F=58.38、52.69、24.79)比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。组间两两比较,单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较正常对照组明显降低,PSF组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较单纯OIR模型组、Vec组明显增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的PSF可通过上调Nrf2及HO-1的表达抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成。     

二十二碳六烯酸对人视网膜色素上皮细胞中血红素氧合酶-1表达的诱导作用

背景 氧化应激是年龄相关性黄斑变性发生的重要机制.研究表明,二十二碳六烯酸(DHA)在视网膜光感受细胞的发育中发挥重要作用,并可上调血红素氧合酶1(HO-1)的表达,从而发挥抗氧化效应,但DHA是否能影响人视网膜色素上皮(RPE)细胞表达HO-1尚未阐明. 目的 观察DHA对体外培养的RPE中HO-1表达的影响及其分子机制. 方法 对人RPE细胞系ARPE-19进行培养,分别用30、50、100和120 μmol/L DHA作用4～24 h,以不含DHA培养的细胞作为对照组.采用乳酸脱氢酶(LDH)法检测DHA对细胞的毒性;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组细胞中HO-1 mRNA及其蛋白的相对表达;采用比色法分析各组细胞中HO-1酶活性变化情况;采用荧光探针H2DCFDA检测细胞中活性氧簇(ROS)的相对比例,并采用免疫荧光技术检测各组培养细胞中核转录因子-E2相关因子2(Nrf2)的核转位情况;分别采用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预法和Nrf2小干扰RNA(siRNA)转染法作用于培养的细胞,采用Western blot法检测细胞中Nrf2蛋白的表达,并观察其对细胞中HO-1蛋白表达量的影响. 结果 0、30、50、100和120 μmol/L DHA作用于ARPE-19细胞后24 h,培养上清液中LDH漏出率的总体比较差异有统计学意义(F=8.14,P＜0.05),其中120 μmol/L DHA作用后细胞中LDH漏出率明显高于0、30、50、100 μmol/L DHA组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).不同浓度DHA作用ARPE-19细胞后8h,HO-1mRNA及其蛋白的相对表达量以及HO-1的酶活性总体比较差异均有统计学意义(F=16.24,P＜0.05;F=11.34,P＜0.05;F=11.81,P＜0.05),其中30、50、100 μmol/L DHA组细胞中HO-1 mRNA及其蛋白的相对表达量以及HO-1的酶活性均明显高于0μmol/L DHA组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).不同浓度DHA作用ARPE-19细胞后4h细胞内ROS相对荧光强度、细胞核Nrf2阳性细胞比例的总体比较差异均有统计学意义(F=11.08,P＜0.05;F=16.42,P＜0.05),其中30、50和100μmol/L DHA组细胞中ROS相对荧光强度、细胞核Nrf2阳性细胞比例均明显高于0μmol/L DHA组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).100 μ.mol/L DHA处理条件下,NAC预处理后细胞中HO-1蛋白的相对表达量和细胞核Nrf2阳性细胞比例均明显低于单纯100μmol/L DHA组,Nrf2 siRNA转染组细胞中HO-1的相对表达量和细胞核Nrf2阳性细胞比例均明显低于空白siRNA转染组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 低于100 μmol/L的DHA可能通过ROS/Nrf2途径诱导RPE细胞表达HO-1,从而发挥对细胞的保护作用.     

吡哆胺对AGEs干预的人RPE细胞的保护作用

目的：观察吡哆胺(PM)对高级糖基化终末产物(AGEs)干预的RPE细胞的影响,探讨PM对RPE细胞的保护作用。

方法：取传代至第3代的细胞进行分组：(1)对照组：含100mg/L BSA的DMEM培养基培养48h;(2)AGEs干预组：含200mg/L AGEs的DMEM培养基培养48h;(3)PM组：PM1组：含16mg/L PM+200mg/L AGEs的DMEM培养基培养48h; PM2组：含32mg/L PM+200mg/L AGEs的DMEM培养基培养48h。采用免疫组织化学法检测RAGE蛋白的表达; 荧光染色法观察细胞内ROS的生成; Tunel法检测细胞凋亡情况。

结果：AGEs可明显刺激RPE细胞内RAGE蛋白的表达和ROS的生成,增加细胞凋亡情况,而PM可抑制该过程,且具有一定的浓度依赖性。

结论：PM能够抑制AGEs干预的RPE细胞内RAGE蛋白的表达和ROS生成,减少细胞凋亡,具有一定的细胞保护作用。     

p75 NTR受体在视网膜色素上皮细胞氧化损伤中的作用及机制

目的：研究p75 NTR受体在视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)氧化损伤过程中的作用及机制。

方法：将转染p75 NTR受体的RPE细胞作为实验组,未转染的RPE细胞作为对照组。BrdU检测法检测细胞增殖活性; PI/Annexin V-FITC双染法检测细胞凋亡率; 激光显微镜观察细胞内ROS的表达情况; 流式细胞仪检测细胞内ROS、线粒体标志物、细胞色素C表达水平; Western blot法检测细胞中Fas蛋白、裂解Caspase-3、VEGF165蛋白的表达水平。

结果：随着p75 NTR受体转染时间的延长,实验组RPE细胞的增殖活性呈逐渐降低趋势,各转染时间点的RPE细胞增殖活性比较,差异有统计学意义(P<0.05); 实验组各转染时间点的RPE细胞增殖活性均明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。随着转染时间的延长,实验组RPE细胞凋亡率呈逐渐增加趋势,各转染时间点的RPE细胞凋亡率比较,差异有统计学意义(P<0.01); 实验组各转染时间点的RPE细胞凋亡率均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。实验组ROS荧光信号明显强于对照组。流式细胞仪检测结果显示,实验组RPE细胞中ROS、细胞色素C水平均明显高于对照组,线粒体标志物水平明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。Western blot 法检测结果表明,实验组细胞内Fas蛋白、Caspase-3、VEGF₁₆₅蛋白的表达水平均明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。

结论：p75 NTR受体高表达可导致RPE细胞线粒体发生损伤,同时促进细胞凋亡,最终导致脉络膜新生血管的形成,表明p75 NTR受体可能是导致RPE细胞发生损伤的因素之一。     

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对缺氧诱导人视网膜微血管内皮细胞功能的影响

目的观察多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞(hRMECs)功能的影响。方法采用三质粒系统构建慢病毒颗粒(LV)-PSF。LV-PSF体外感染hRMECs后通过流式细胞计数法测定其感染效率。应用实时定量PCR(RT-PCR)检测经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA表达水平。将实验分为体内和体外两部分。体内实验:7日龄健康C57B/L6小鼠20只,采用随机数字表法分为正常组、氧诱导视网膜病变(OIR)组、OIR+LV-空载体(Vec)组和OIR+LV-PSF组,每组5只。除正常组外,其余3组构建OIR模型。OIR组除缺氧刺激外,不做其余处理。OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠分别玻璃体腔注射LV-Vec或LV-PSF。观察LV-PSF对视网膜新生血管(RNV)形成的影响。体外实验:将hRMECs分为正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组。正常组为正常体外培养的hRMECs;缺氧组为缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs;空载组、PSF高表达组分别为用LV-Vec、LV-PSF感染48 h,再用缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs。采用MTT比色法观察PSF对细胞增生能力的影响。采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验观察PSF对缺氧刺激下细胞迁移能力的影响。采用RT-PCR观察各组细胞中HIF-1α、VEGF及PSF的mRNA表达。结果成功构建可稳定高表达PSF的LV-PSF,流式细胞仪测定其感染效率为97%,RT-PCR测得经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA水平明显上调。体内实验:OIR组、OIR+LV-Vec组小鼠RNV面积较正常组明显增加(t=18.31、43.71),OIR+LV-PSF组小鼠RNV面积较OIR组(t=11.30)、OIR+LV-Vec组(t=15.47)明显减小,差异均有统计学意义(P<0.05)。体外实验:MTT比色法检测结果显示,缺氧组hRMECs增生能力较正常组明显增强(t=2.57),PSF高表达组hRMECs增生能力较正常组、缺氧组、空载组明显降低(t=5.26、5.46、3.73),差异均有统计学意义(P<0.05)。细胞划痕实验结果显示,缺氧刺激3 h恢复正常条件24 h或48 h均可刺激缺氧组与空载组细胞明显迁移(t=8.35、13.84,P<0.05);而与缺氧组与空载组比较,PSF高表达组细胞迁移不明显(t=10.99、18.27、9.75、8.93、26.94、7.01,P<0.05)。Transwell小室实验结果显示,正常组和空载组微孔膜上染色的细胞数较多,而PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数明显减少(t=9.33、6.15,P<0.05)。RT-PCR检测结果显示,与正常组比较,缺氧组、空载组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显增加(t=15.23、21.09,P<0.05),PSF mRNA表达无明显变化(t=0.12、2.15,P<0.05);与缺氧组、空载组比较,PSF高表达组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显下降(t=10.18、13.10,P<0.05),PSF mRNA表达明显增加(t=65.00、85.79,P<0.05)。结论PSF可减少OIR模型小鼠RNV面积。PSF可能通过HIF-1α/VEGF信号通路抑制缺氧诱导的hRMECs增生和迁移。     

驻景丸加减方对干性年龄相关性黄斑变性模型小鼠视网膜的保护作用

目的　探讨驻景丸加减方对干性年龄相关性黄斑变性(AMD)模型小鼠视网膜的保护作用以及对核因子E2相关因子2 (Nrf2)通路和自噬的影响。方法　取6月龄健康雄性C57BL/6小鼠90只，将小鼠随机分为:年龄对照组(正常饮食)、溶媒对照组(高脂饮食+氢醌)、对照药物组(高脂饮食+氢醌+莱视盯)及中药组(高脂饮食+氢醌+驻景丸加减方，分低、中、高三个剂量组)6组，每组15只。莱视盯主要成分:叶黄素、β-胡萝卜素、葡萄糖酸锌 (每100 g含叶黄素 2.20 g、β-胡萝卜素 0.86 g、锌 1.50 g)。各组小鼠灌胃给药，每天1次，持续3个月。动物观察期满处死并摘取眼球，透射电镜观察视网膜组织，测量视网膜色素上皮(RPE)下沉积物面积及Bruch膜厚度，检测视网膜匀浆活性氧自由基(ROS)、丙二醛 (MDA) 含量，Western blot检测Nrf2、血红素加氧酶-1(HO-1)、醌氧化还原酶-1(NQO-1)、p62和LC3蛋白表达水平。结果　与年龄对照组相比，溶媒对照组RPE下沉积物面积显著增大、Bruch膜明显增厚，差异均有统计学意义(均为P<0.01)；与溶媒对照组相比，中药中、高剂量组RPE下沉积物面积减小、Bruch膜厚度变薄，差异均有统计学意义(均为P<0.01)；与溶媒对照组相比，中药低剂量组和对照药物组RPE下沉积物面积也均减小，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，但Bruch膜厚度变化不明显。与溶媒对照组相比，中药中、高剂量组ROS、MDA含量显著降低 (均为P<0.01)，中药低剂量组和对照药物组ROS、MDA含量也均降低 (均为P<0.05)；与溶媒对照组相比，中药中、高剂量组细胞质Nrf2蛋白表达显著下调，细胞核Nrf2蛋白表达上调 (均为P<0.01)，中药低剂量组和对照药物组细胞质Nrf2蛋白表达下调，细胞核Nrf2蛋白表达上调 (均为P<0.05)；与溶媒对照组相比，中药中、高剂量组HO-1、NQO-1、p62和LC3 II蛋白表达均显著上调 (均为P<0.01)，中药低剂量组HO-1、p62和LC3 II蛋白表达均上调 (均为P<0.05)，对照药物组HO-1和LC3 II蛋白表达均上调 (均为P<0.05)。结论　驻景丸加减方可激活Nrf2通路，上调下游靶基因酶HO-1、NQO-1表达，快速清除ROS、MDA；增强自噬，加快清除氧化损伤的细胞器，对干性AMD模型小鼠视网膜有保护作用。     

α-硫辛酸对蓝光诱导损伤的ARPE-19细胞的保护作用

目的 研究α-硫辛酸(ALA)对蓝光诱导损伤的ARPE-19细胞的保护作用。方法 体外培养ARPE-19细胞，随机分为正常组(N组)、药物组(D组)、光照组(L组)、药物+光照组(D+L组)。倒置显微镜下观察ARPE-19细胞形态结构。CCK-8法检测各组ARPE-19细胞活性；流式细胞仪(Annexin V/PI双染色法)检测ARPE-19细胞凋亡率；倒置荧光显微镜检测ARPE-19细胞ROS水平；实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ARPE-19细胞核因子E2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)、血红素氧合酶-1(HO-1) mRNA表达水平；Western blot检测ARPE-19细胞天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Nrf2、NQO1蛋白表达水平。结果 N组及D组细胞均呈贴壁生长，分布均匀，形态清晰，细胞存活率差异无统计学意义(P>0.05)。与N组相比，L组细胞皱缩、变小、变圆，失去正常形态，部分细胞不能贴壁生长，细胞存活率降低，细胞凋亡率升高，ROS水平升高(均为P<0.05)...     

17-β雌二醇对高糖诱导RPE细胞保护作用的研究

目的:探讨17-β雌二醇对高糖诱导人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞的保护作用和可能机制.方法:RPE细胞传代培养,随机对照法分为四组:空白对照组:5.5 mmol/L葡萄糖常规培养基进行处理;高糖组:100 mmol/L葡萄糖作用12 h;17-β 雌二醇低浓度组:10μmol/L 17-β雌二醇孵育24 h后,加入100 mmol/L葡萄糖作用12 h;17-β雌二醇高浓度组:100μmol/L 17-β雌二醇孵育24 h后,加入100 mmol/L葡萄糖作用12 h.MTT比色法检测细胞活力,Hochest33258染色观察细胞凋亡,H2 DCFDA染色检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,比色法检测过氧化氢酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的表达.结果:随着葡萄糖浓度的增加,RPE细胞活性逐渐下降,17-β雌二醇能明显抑制高糖诱导的RPE细胞活力的下降,降低RPE细胞凋亡率,抑制细胞内ROS生成.此外,17-β雌二醇能明显增加RPE细胞内CAT、SOD表达,降低MDA的表达.结论:17-β雌二醇能有效抑制高糖对RPE细胞的损伤,从而为用于治疗视网膜相关疾病提供可靠的实验依据.     

灯盏花素通过调节Bcl-2和Bax表达拮抗高糖诱导的RPE细胞损伤

目的:探讨灯盏花素对高糖环境下人视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激的影响。方法:常规培养RPE细胞,分为对照组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度为30mmol/L)、灯盏花素低浓度组(30mmol/L葡萄糖+1μmol/L灯盏花素)和灯盏花素高浓度组(30mmol/L葡萄糖+10μmol/L灯盏花素)。细胞划痕实验观察RPE细胞的迁移性,CCK-8法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平变化,Hoechst染色法观察凋亡细胞比例,Western blot分析各组Bcl-2和Bax的变化。结果:细胞划痕实验结果显示,灯盏花素低浓度组和灯盏花素高浓度组RPE细胞形态较高糖组改善,细胞迁移性较高糖组增加;CCK-8结果显示,用1、10μmol/L浓度的灯盏花素处理后,RPE细胞存活率分别提高到61.06%±5.59%和79.81%±7.04%,与高糖组(40.63%±4.72%)比较有差异(P<0.05);2’,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(H2DCFDA)荧光探针染色结果显示,灯盏花素抑制了RPE细胞内ROS水平;Hoechst染色法显示,1、10μmol/L灯盏花素处理后发生凋亡的RPE细胞数量逐渐减少;Western blot结果显示,灯盏花素增强了Bcl-2蛋白的表达,降低了Bax蛋白的表达。结论:灯盏花素可以抑制高糖诱导的RPE细胞氧化损伤和凋亡的发生,为糖尿病视网膜病变的治疗靶点研究提供了理论支持。     

白细胞介素-8拮抗剂通过抑制活性氧生成下调视网膜血管内皮细胞黏附和迁移

目的观察白细胞介素-8 (IL-8)对视网膜血管内皮细胞(RCEC)黏附和迁移的影响。方法细胞实验研究。将人RCEC (hRCEC)分为正常对照组(N组)、糖基化终末产物(AGE)处理组(AGE组)、AGE诱导联合IL-8抑制剂SB225002处理组(AGE+SB组)。采用蛋白质免疫印迹法观察AGE对hRCEC中IL-8表达水平的影响;细胞划痕实验观察SB225002对hRCEC迁移的影响;流式细胞仪检测SB225002对hRCEC上白细胞黏附、活性氧(ROS)产生的影响。两组间比较行Student-t检验;三组间比较行单因素方差分析。结果与N组比较, AGE组细胞中IL-8表达水平显著升高, 差异有统计学意义(t=25.661, P<0.001)。与N组、AGE+SB组比较, AGE组细胞迁移率显著升高(F=29.776 ), 白细胞黏附数量明显增多(F=38.159、38.556), ROS表达水平显著增高(F=22.336), 差异均有统计学意义(P<0.05 )。结论 IL-8拮抗剂SB225002可能通过抑制ROS的表达而下调hRCEC的黏附和迁移。     

miR-29b激活自噬抑制人视网膜色素上皮细胞增殖的实验研究

目的　研究miR-29b激活自噬抑制人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞增殖的作用。方法　通过病毒颗粒包装转染RPE细胞24~72 h，在倒置荧光显微镜下观察荧光强度检测感染效率，利用实时定量PCR检测miR-29b mRNA表达。采用凝血酶刺激RPE细胞增殖模拟增生性玻璃体视网膜病变模型。使用0.5×10³ U·L^-1凝血酶预刺激1 h，然后分别加入miR-29b和Lenti-vector空载体刺激24 h。分为空白对照组（Sham组）、凝血酶刺激组（RPE组）、凝血酶刺激组+miR-29b过表达组（RPE+Lenti-29b组）、凝血酶刺激组+空载体组（RPE+Lenti-vector组）。利用MTT微量酶比色法检测各组RPE细胞增殖情况，Western blot观察微管相关蛋白1轻链3（light chain 3,LC3）Ⅱ表达变化。结果　在倒置荧光显微镜下观察发现，RPE+Lenti-29b组和RPE+Lenti-vector组90%以上的RPE细胞成功转染，且RPE+Lenti-29b组miR-29 mRNA水平高表达，与其余3组相比差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与Sham组比较，其余3组RPE细胞增殖明显，差异均有统计学意义（均为P<0.05），LC3Ⅱ蛋白表达也明显升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；与RPE+Lenti-29b组比较，RPE组和RPE+Lenti-vector组细胞增殖明显（均为P<0.05），但LC3Ⅱ蛋白表达明显低于RPE+Lenti-29b组，差异有统计学意义（P<0.01）。结论　上调miR-29b表达可激活RPE细胞中LC3Ⅱ蛋白表达，提高细胞自噬水平，抑制RPE细胞增殖，可能在增生性玻璃体视网膜病变发生及发展中扮演重要作用。     

H2O2对体外培养视网膜色素上皮细胞中BMP-6及其相关受体的影响

目的　观察氧化应激对视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞的损伤作用以及对骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-6及其相关受体的影响。方法　RPE细胞随机分为对照组:正常培养的RPE细胞；H₂O₂组:加入200 μmol·L^-1 H₂O₂处理的RPE细胞；实验组:加入200 μmol·L^-1 H₂O₂和0.1 ng·L^-1 BMP-6的RPE细胞。采用活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测试剂盒运用流式细胞仪检测对照组与H₂O₂组RPE细胞内ROS的变化，运用PCR及Western blot法检查对照组与H₂O₂组BMP-6基因及蛋白水平的变化；TUNEL染色法观察三组细胞凋亡的变化，并运用PCR及Western blot法观察三组BMP受体及其共受体尤文素(Hemojuvelin，HJV）的变化。结果　H₂O₂组ROS水平（99.25±0.28）%较对照组（70.55±7.71）%明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；H₂O₂组相对于对照组BMP-6 mRNA水平及BMP-6蛋白水平均降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；H₂O₂组的TUNEL染色阳性细胞数显著高于对照组（P<0.05），而实验组TUNEL染色阳性细胞数明显减少，与H₂O₂组相比，差异有统计学意义（P<0.05）；与对照组相比，H₂O₂组BMP三种相关受体的BMPR1A、BMPR1B及HJV的表达水平显著降低，而实验组三种受体表达水平较H₂O₂组显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05)。结论　H₂O₂导致RPE细胞ROS增加，氧化应激可在基因及蛋白水平抑制BMP-6的表达；BMP-6可减轻氧化应激引起的细胞凋亡，且可能是通过激活其相关受体起作用的，这为探索年龄相关性黄斑变性的发病机制提供了一定的理论基础。     

艾塞那肽对4-羟基壬烯醛诱导人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤的抑制作用

目的　观察艾塞那肽（exendin-4,EX4）对4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal,4-HNE）诱导人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞氧化应激损伤的抑制作用。方法　体外培养人RPE细胞（ARPE-19）,采用CCK-8法检测不同浓度EX-4处理后细胞增殖情况;利用倒置显微镜观察对照组、EX4处理组、4-HNE组和4-HNE+EX4处理组细胞形态变化;利用荧光显微镜观察各组细胞的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）生成;运用流式细胞仪检测各组RPE细胞内ROS含量变化;化学比色法检测细胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）和丙二醛（malondialdehyde,MDA）的含量变化。结果　100.0 nmol·L^-1 EX4对RPE细胞具有较强的保护作用,在此浓度下对10 μmol·L^-1 4-HNE引起的氧化应激损伤具有较强的抑制作用（P<0.05）。荧光显微镜观察发现,与对照组相比,4-HNE组亮绿色高荧光信号明显增强;与4-HNE组相比,4-HNE+EX4处理组荧光信号强度明显减弱,细胞内ROS含量明显减少。流式细胞仪检测也发现,与对照组相比,4-HNE组细胞内ROS含量升高,差异有统计学意义（P<0.01）;与4-HNE组比较,4-HNE+EX4处理组细胞内ROS含量明显降低（P<0.05）。4-HNE组SOD含量明显低于对照组,差异有统计学意义（P<0.01）;与4-HNE组比较,4-HNE+EX4处理组SOD含量明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。与对照组相比,4-HNE组MDA含量明显升高（P<0.01）;4-HNE+EX4处理组MDA含量较4-HNE组明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）。结论　EX4对4-HNE诱导人RPE细胞的氧化应激损伤具有保护作用,对老年性黄斑变性的治疗具有一定的潜在价值。     

基质金属蛋白-9抑制剂阻断视网膜色素上皮细胞表面CD73脱落防治实验性自身免疫性葡萄膜炎的初步研究

目的:初步探讨MMP-9抑制剂阻断RPE细胞表面CD73脱落,防治实验性自身免疫葡萄膜炎(EAU)的机制。方法:体外培养分离自野生型C57BL/6小鼠及CD73基因敲除(CD73-/-)小鼠的RPE细胞,以脂多糖及TNF-α共同干预,诱导RPE表面CD73脱落。依据是否同时加入MMP-9抑制剂CTK8G1150(终浓度5.0μmol/L),将两种小鼠培养的RPE细胞分别设为MMP-9抑制剂干预组及无干预对照组。每组细胞给予溶媒、1μmol/L单磷酸腺苷(AMP)、1μmol/L AMP及3μmol/L 5'-α,β-亚甲基-二磷酸腺苷(APCP)(AMP+APCP)进行干预。氚化胸苷掺入法检测不同组别RPE细胞对CD4+T细胞增生的刺激作用。分别以野生型B6小鼠及CD73-/-小鼠为受体,过继免疫诱发EAU。受体小鼠分别随机分为MMP-9抑制剂干预组及未干预对照组,于过继免疫后4、7、10 d视网膜下腔分别注射CTK8G1150或溶媒。实时定量PCR(RT-PCR)、Western blot法检测受体小鼠RPE细胞中CD73 mRNA及蛋白表达。组间比较采用单因素方差分析。结果:刺激方式为AMP时,C57BL/6 MMP-9抑制剂干预组CD4+T细胞的增生能力较无干预组显著下降,差异有统计学意义(F=13.28,P<0.01);溶媒、AMP+APCP时,两组CD4+T细胞增生能力比较,差异无统计学意义(F=7.78、6.58,P>0.05)。CD73-/-MMP-9抑制剂干预组、无干预组不同刺激方式CD4+T细胞增生能力比较,差异均无统计学意义(F=5.24、6.12、7.04,P>0.05)。RT-PCR检测结果显示,B6受体小鼠MMP-9抑制剂组、无干预对照组RPE细胞中CD73 mRNA相对表达量比较,差异无统计学意义(F=6.54,P>0.05)。Western blot检测结果显示,B6受体小鼠MMP-9抑制剂组RPE细胞中CD73蛋白表达较未干预对照组显著增加,差异有统计学意义(F=15.24,P<0.01)。结论:MMP-9抑制剂阻断RPE细胞表面CD73的脱落对EAU具有保护作用。     

木犀草素调控Nrf2/HO-1通路保护视网膜色素上皮细胞氧化损伤

目的:探讨木犀草素对H2O2诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化损伤的保护作用及其机制。方法:将ARPE-19细胞分为对照组、H2O2组、不同剂量木犀草素组和Nrf2抑制剂组,除对照组外均采用100μmol/L H2O2制备RPE氧化损伤模型。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力并确定木犀草素处理浓度,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率及活性氧(ROS)含量,采用试剂盒法检测细胞中丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,采用Western blot检测细胞Caspase-3、多聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶(PARP)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、核因子E2相关因子2(Nrf2)及血红素氧化酶-1(HO-1)蛋白表达水平。结果:100μmol/L木犀草素对ARPE-19具有毒性作用,因此选择25μmol/L和50μmol/L木犀草素进行后续实验。与H2O2组比较,25μmol/L和50μmol/L木犀草素组细胞活力明显升高,凋亡率降低,ROS和MDA含量明显减少,SOD活性明显升高,Caspase-3和PARP蛋白表达水平明显降低,Bcl-2、Nrf2及HO-1蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与50μmol/L木犀草素组比较,Nrf2抑制剂组细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,ROS和MDA含量明显升高[(654.96±26.99)vs(446.52±29.42),(3.89±0.29)nmol/mL vs(2.06±0.19)nmol/mL],SOD活性明显降低[(13.83±1.49)U/mL vs(22.69±1.83)U/mL],Caspase-3和PARP蛋白表达水平明显升高,Bcl-2、Nrf2及HO-1蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:木犀草素能够改善H2O2诱导的RPE细胞氧化损伤,其作用机制与激活Nrf2/HO-1通路有关。