表达人卵泡抑素的毕赤氏巴斯德酵母工程菌的构建

目的在P.pastoris中分泌表达人卵泡抑素基因.方法采用PCR法扩增目的基因FS288片段,将其亚克隆入pPIC9,构建pPIC9-FS288,DNA序列测定验证后,将pPIC9-FS288采用BamHⅠ和SalⅠ双酶切,回收小片段,连接pPIC9K,构建重组分泌型表达载体pPIC9K-FS288,电穿孔法转化SMD1168,G418筛选多拷贝转化子,转化子发酵后,取上清液进行SDS-PAGE和Western blot检测重组蛋白表达.结果成功构建了重组分泌型表达载体pPIC9K-FS288和工程菌株SMD1168-FS288,SDS-PGAE显示工程菌发酵上清液在50 000 ～ 60 000处有弥散条带,并且与Western blot结果相符.结论工程菌SMD1168-FS288能分泌表达重组人卵泡抑素.     

重组人血管抑素基因克隆与表达

目的：构建人血管抑素原核分泌型融合表达载体pEZZ18-As，诱导表达融合蛋白。方法：从人肝组织中提取总RNA，用RT-PCR的方法获得血管抑素基因，克隆到pEZZ18载体中，在E.coli DH5α中诱导表达。结果：成功构建人血管抑素表达载体并表达出目的蛋白。结论：该研究为抗血管药物治疗实体瘤奠定了基础。     

人血管抑素基因分泌型融合载体的构建与表达

【目的】构建人血管抑素(angiostatin,As)原核分泌型融合表达载体pEZZ18-As,诱导表达As融合蛋白。【方法】根据人AscDNA序列的开放读码框架设计上、下游引物,从人肝组织中提取总RNA后,利用RT-PCR技术扩增As基因;酶切目的基因与pEZZ18载体,回收纯化后做定向克隆连接,转化E.coliDH5α;XbaⅠ及EcoRⅠ双酶切电泳与测序鉴定pEZZ18-As;诱导培养重组菌,表达目的蛋白。【结果】酶切pEZZ18-As,电泳分析插入片段长度为1111bp,与预期结果一致,对连接点两端进行测序,结果显示接头两端序列连接正确;SDS-PAGE分析诱导培养重组菌,新出现的蛋白大小约61kD,与预期相符。【结论】成功构建人血管抑素表达载体并表达出目的蛋白,该研究为抗血管药物治疗实体瘤奠定了基础。     

人卵泡抑素基因全长cDNA的克隆

目的克隆人卵泡抑素(FS)全长cDNA基因.方法采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)从人肝组织中扩增FS cDNA,构建PMD18-T载体,采用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切以及DNA测序进行鉴定.结果RT-PCR扩增长度为968 bp的基因片段,BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切结果显示重组T载体中含有目的基因片段,测序结果显示编码区无基因突变.结论人FS全长cDNA基因克隆成功,并构建了重组PMD18-T载体.     

含小鼠分泌型内皮抑素基因重组质粒的构建及表达

目的:克隆小鼠分泌型内皮抑素(sEndostatin)cDNA,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,检测重组质粒在B16细胞中的表达. 方法:用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出内皮抑素cDNA,经测序证实后,连入信号肽,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,以脂质体转染小鼠B16细胞,用Western blot方法检测B16细胞上清中内皮抑素的表达.结果:测序表明扩增的分泌型内皮抑素序列与报道完全一致, Egr-1启动子和分泌型内皮抑素cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1,Western blot证实转染B16细胞上清中有目的蛋白表达.结论:小鼠内皮抑素基因成功地被克隆和表达,为今后检测pEgr-分泌型内皮抑素的辐射诱导表达和恶性肿瘤的基因-放射治疗奠定基础.     

人内皮抑素基因的质粒构建及在大肠杆菌中的表达

目的:将人内皮抑素(endostatin)基因插入表达载体并进行原核表达.方法:将endostatin基因定向插入表达载体pQE-31 BamH I/Kpn I位点,构建重组质粒pQEN,转化E.coli M15,进行原核表达.结果:在IPTG的诱导下,endostatin基因在重组转化株E.coli M15 (pQEN) 中获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物分子量为22×103 u,表达产物主要以包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的34.6%.结论:从组织中克隆endostatin基因并进行原核表达是可行的方法.     

人卵泡抑素基因全长cDNA的克隆

目的 克隆人卵泡抑素(FS)全长cDNA基因。方法 采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)从人肝组织中扩增FS cDNA。构建PMD18-T载体，采用BamHⅠ、HindⅢ双酶切以及DNA测序进行鉴定。结果 RT-PCR扩增长度为968bp的基因片段，BamHⅠ、HindⅢ双酶切结果显示重组T载体中含有目的基因片段，测序结果显示编码区无基因突变。结论 人FS全长cDNA基因克隆成功，并构建了重组PMD18-T载体。     

Annexin32酵母分泌型表达载体的构建及其高拷贝转化子的快速筛选

Annexin家族是 2 0世纪 70年代末发现的一类钙依赖性磷脂结合蛋白 ,广泛存在于真核生物细胞内 ,迄今为止已发现 31个 annexin亚家族。孙树汉等 [1 ]从构建的猪囊尾蚴 c DNA表达文库中筛选出的人、猪共通抗原 c C1是一种高效的保护性抗原。利用该抗原基因研制的核酸疫苗能有效激发仔猪的免疫保护效应 [2 ] ,还可诱导猪囊尾蚴细胞的凋亡 [3] 。随后还发现原核表达的 c C1融合蛋白产物 GST- c C1[4 ] 具有体外和体内抗凝血作用。本室利用生物信息学方法对 c C1的分析结果显示 ,c C1实质上是一个新的 annexin亚家族成员 ,现命名为 annexin3…     

小鼠血管抑素基因的克隆及真核表达载体构建

目的：克隆小鼠血管抑素(Angiostatin)cDNA，构建其真核表达载体pCMV-Angiostatin重组质粒，为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础。方法：根据Genebank中小鼠血管抑素基因序列，用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出Angiostatin cDNA，连接pMD18T载体测序，经测序证实后，通过中间栽体pKS，构建pCMV-Angiostatin重组质粒。结果：测序表明扩增的Angiostatin cDNA序列与报道基本一致，Angiostatin cDNA正确插入表达载体。结论：成功地克隆小鼠Angiostatin基因并完成其真核表达载体的构建。     

毕赤酵母表达杀菌/渗透性增强蛋白N端片段

目的 探讨在毕赤酵母中进行杀菌／渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达。方法从质粒pUCm-BPI上PCR扩增得到编码BPI氨基端196个氨基酸的基因片段(BPl588)。将该基因克隆到酵母表达载体Ppic9K上，使其准确融合于α交配因子分泌信号之后，电击转化毕赤酵母宿主菌GS115／His-。对酵母重组子的基因组DNA作PCR和总RNA作RT-PCR．分析。筛选出的转化子用甲醇作诱导物在29℃进行诱导后，分泌到培养基中的表达产物用于革兰氏阴性细菌E.coli JM109的抑菌实验。结果BP1588基因已整合到毕赤酵母染色体基因组中，并有转录产物mRNA的存在，表达产物能够抑制革兰氏阴性细菌的生长。结论利用毕赤酵母进行杀菌／渗透性增强蛋白N端片段的分泌表达是可行的。     

人肠三叶因子毕赤酵母表达载体的构建及稳定整合菌珠的筛选

目的 构建hITF毕赤酵母分泌型表达载体，获得稳定整合酵母菌珠，为大量获得重组hITF、进行功能研究奠定基础。方法 通过PCR获得hITFcDNA片段，将目的基因插入酵母表达载体pPICZαA分泌信号下游，得到重组载体pPICZαA—hITF，SαcⅠ线性化后氯化锂转化进入X-33，Zeocin筛选转化酵母菌，PCR鉴定目的基因，MD、MM鉴定基因型。结果 经测序证实PCR扩增的hITFcDNA与基因文库中的完全一致并准确插入酵母表达载体pPICZαA中，氯化锂转化后，PCR鉴定证明重组载体整合进入酵母基因组中，基因型鉴定表明获得的酵母菌株均为Mut^＋。结论 成功构建出酵母表达载体pPICZαA—hITF，获得稳定整合hITFcDNA的酵母菌株，为hITF的大量表达及其功能研究奠定了基础。     

基因工程菌Pichia pastoris高密度发酵表达重组人血清白蛋白

在摇瓶条件下对基因工程菌Pichia pastoris的发酵条件进行了实验，并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料分批高密度发酵。在分批发酵时，接种量为10%且种子细胞光密度（OD600）为20左右时，细胞生长的延迟期约为2.11h，细胞生长光密度与培养时间的关系模型为：y=0.7841e^0.2319t（线性相关系数r=0.9936）；在补料发酵时细胞浓度可达115g/L-160g/L（干重），在120h重组人血清白蛋白表达量达3.6g/L。     

重组人A20蛋白在巴斯德毕赤酵母GS115中的表达

目的利用酵母表达技术制备重组人A20蛋白(rhA20),为进一步研究其在脓毒血症中的治疗作用奠定基础。方法利用基因工程技术构建rhA20毕赤酵母表达载体yevCFP-hA20,电转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115,筛选高拷贝阳性菌株,甲醇诱导表达rhA20。产物用SDS-PAGE和W estern B lot鉴定。同时对诱导表达培养基的pH值和配方,以及培养环境温度等条件进行了优化研究。结果表达产物分子量约93×103,表达条件的优化研究提示:降低诱导培养基pH值、添加低剂量EDTA、蛋白酶水解物和降低培养温度,可以使全长表达产物提高11倍,占总蛋白的18.24%,达到(254.10±24.52)μg/m l水平。结论我们成功在巴斯德毕赤酵母GS115中表达了rhA20,通过对诱导培养基成分及诱导温度的优化,使全长rhA20表达得到明显提高,探索了人A20的生物合成途径,也为巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白遭遇降解时的处理提供了新的方法。     

hITF毕赤酵母表达载体的构建及分泌表达

目的构建hITF毕赤酵母分泌型表达载体,表达重组hITF,为功能研究奠定基础.方法通过PCR获得hITFcDNA片段,将目的基因插入酵母表达载体pGAPZαA分泌信号下游,得到重组载体pGAPZαA-hITF.BspH I线性化后氯化锂转化进入X-33,Zeocin筛选转化酵母菌,PCR鉴定目的基因.阳性转化子经摇瓶表达,取上清TCA沉淀后做Tricine SDS-PAGE分析及Western blot检测.结果经测序及PCR证实,hITFcDNA准确插入酵母表达载体pGAPZαA中,氯化锂转化后,重组载体通过同源重组整合进入酵母基因组中.Tricine SDS-PAGE分析证明hITF的分子量约为10×103,Western blot分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性.结论成功构建出酵母表达载体pGAPZαA-hITF,获得重组hITF,为深入研究hITF奠定了基础.     

人类白细胞介素2基因重组子在大肠菌中表达的研究

应用SDS-PAGE,Western blotting技术。对人类白细胞介素2基因的重组于pRET-90在大肠菌中的表达进行了分析。结果表明,pRET-90转化株不仅有IL-2的表达,而且表达量占菌体总量蛋白的30%左右,大肠茵表达的重组IL-2蛋白具有与抗人IL-2抗体结合的活性,说明pRET-90质粒是一个高效表达的质粒。     

培养温度对多拷贝毕赤酵母猪胰岛素前体的分泌表达和生理特性影响

研究了培养温度对多拷贝毕赤酵母分泌表达猪胰岛素前体（PIP）的生理特性的影响。将多拷贝重组菌A2（12拷贝）和A3（18拷贝）分别在25 ℃和 30 ℃培养,25 ℃培养时PIP表达水平分别比30 ℃培养时提高了40%和32%,而A3细胞的存活率提高了20%。对A3细胞内相关蛋白折叠和氧化程度的KAR2,PDI1, GLR和TRR1基因转录水平分析发现,相比30 ℃培养25 ℃培养时减少了16%~35%,这表明多拷贝重组A3菌株在低温培养时比高温培养在蛋白折叠和氧化协廹响应有明显的减缓效应,从而导致外源蛋白表达提高了40%.     

流式细胞仪检测重组毕赤酵母发酵过程中的细胞活性

建立了流式细胞仪检测重组巴斯德毕赤酵母(P.p astoris)细胞活性的方法,并在高密度发酵过程中得到应用。使用碘化丙锭染色法测定细胞活性,发现甲醇诱导时酵母细胞活性开始下降,随着细胞密度的增加,由于细胞胁迫和甲醇的影响,细胞活性明显下降,活细胞率最大下降了14%。与此同时,细胞生长减缓,目的蛋白发生降解,表明细胞活性与发酵过程中细胞的生长和目的蛋白生成等参数密切相关。实验证明:流式细胞仪可作为检测毕赤酵母发酵过程中细胞活性参数的一个便捷精确的有力工具。     

重组P_(53)真核表达载体的构建

为进一步探索Ｐ５３基因与机体发育、肿瘤发生的关系及其与细胞周期中其它调控因子的相互作用，我们采用粘性末端连接法构建了重组野生型Ｐ５３－ＰＸＴ１真核表达载体，并成功地转化Ｃａｃｌ２处理的ＲＲ １细胞，经多种方法鉴定表明其连接率为６９％，转化率为３９×１０３／μｇＤＮＡ。该重组载体的构建无疑将为肿瘤、胎儿畸形及着色性干皮病等的病因及诊治研究提供物质基础