霍乱弧菌O139和El Tor菌株毒力岛区域分子特征比较

目的:比较O139霍乱弧菌(VC O139)菌株MO45基因组与O1群El Tor霍乱弧菌(EVC)菌株N16961基因组中毒力岛(VPI)区域分子特征.方法:制备霍乱弧菌VPI上游VC0815基因探针.从VC O139菌株MO45基因组文库中筛选一个既含有VC0815基因又含有tcpA基因的克隆,命名为pCOSVC081545,绘制pCOSVC081545 VPI上游片段的限制性酶切图谱,并与N16961同段序列的限制性酶切图谱进行比较.结果与结论:pCOSVC081545和N16961中VPI上游约1 500 bp片段的限制性酶切图谱基本相同,支持O139霍乱弧菌是EVC O抗原突变而来的观点.     

Raji细胞基因组文库的构建与筛选

目的:构建Raji细胞基因组文库,用EBV DNA探针对文库进行筛选.方法:Raji细胞基因组DNA经Bam HI酶切消化后,低熔点琼脂糖回收9～23 kb的酶切DNA片段,通过匹配黏性末端与磷酸化的Lambda DASH Ⅱ Bam HI酶切载体臂连接,在体外经包装系统包装成活的重组噬菌体,测定原始文库与扩增文库的滴度,用同位素标记的EBV DNA探针对Raji细胞基因组文库进行筛选.结果:Raji细胞原始文库与扩增文库的滴度分别为1.8×105和2.8×108 pfu/mL.文库经筛选获得4个阳性克隆,随机挑取1个阳性克隆稀释后铺平板作进一步杂交鉴定,发现所有噬菌斑均有杂交信号,证明该克隆确为阳性克隆.抽提该阳性克隆DNA,进行BarnHI酶切鉴定,证实插入片段的长度为8.5 kb.经测序、BLAST序列比对,结果显示插入片段一侧为EBV Bam HI W片段,另一侧与人类15号染色体RP11-665A22克隆高度同源.结论:Raji细胞基因组文库的成功构建,为进一步克隆包含EBV整合位点的细胞基因组序列、探讨EBV整合参与肿瘤发生发展的分子机制奠定了基础.     

5株不同群型霍乱弧菌黏粒文库构建及JS9803株文库应用

目的研究5株不同群型霍乱弧菌（VC）黏粒文库的构建。方法染色体DNA提取、酶切,质粒DNA提取、酶切及去磷酸化,连接、包装、转染、铺板,克隆子鉴定和保存、菌落原位杂交,PCR和测序。结果成功构建吴江-2株（EVC流行株产毒株）、86015株（EVC流行株非产毒株）、JS32株（EVC非流行株非产毒株）、JS9803株（0139群VC产毒株）和GD98200株（0139群VC非产毒株）等5株霍乱弧菌的染色体基因组黏粒文库,文库克隆子中插入35～45kb的染色体DNA片段,库容量分别为3000～5000克隆子。从JS9803株文库中筛选出分别携带CTXφ或net—CTXφ基因组的克隆子,后一克隆子携带的rstR—ig2基因为新类型。结论成功构建5株不同群型霍乱弧茵染色体基因组黏粒文库,并对JS9803株文库进行应用。     

恶性疟原虫基因组文库的构建及未知抗原cDNA片段的筛选

恶性疟原虫FCC1／HN株基因组DNA经Sau3AⅠ部分酶切，取14－23kb片段连接入GEW-11λ噬菌体置换型载体构建基因组文库。所得重组体数目为7.3×104pfu，近达构建完整恶性疟原虫基因组文库理论值的10倍。随机挑取该库10个噬菌斑，抽提λDNA，用XhoⅠ酶切，得到14－23kb的插入片段和载体双臂，符合建库要求．以抗体筛选恶性疟原虫cDNA表达文库所获得的未知抗原cDNA片段为探针，在其中筛选到了阳性克隆，为阐明该未知cDNA对应的基因奠定了基础．     

致肾盂肾炎大肠埃希菌132基因组DNA消减文库的构建

目的:应用抑制性消减杂交技术,构建致肾盂肾炎大肠埃希菌132株(UPEC132)与已完成基因组测序的非致病性大肠埃希菌标准株MG1655的基因组DNA消减文库。方法:分别提取UPEC132与MG1655的基因组DNA,经RsaⅠ酶切成为大小200～800bp的片段,一部分与接头连接作为tester,和未与接头连接的酶切片段(driver)进行2次消减杂交及2次抑制性PCR后将产物与pMD18-T载体连接构建DNA消减文库,并转化给大肠埃希菌TOP10构建消减文库。结果:文库扩增后得到139个克隆,经PCR法快速测定,均得到200～800bp的插入片段。结论:所构建的基因组DNA消减文库为进一步筛选UPEC132中与致病相关基因奠定了基础。     

霍乱弧菌不同血清群NhaA基因的变异性分析

目的：克隆霍乱弧菌O1群和O139群NhaA基因，并分析其变异性。方法：收集我国散发霍乱弧菌O1群和O139群40株，用PCR方法扩增NhaA基因，克隆至pcDNA3载体，通过序列测定分析其同原性和变异性。结果：分别从霍乱弧菌O1群和O139群扩增出约1．2kb的NhaA基因片段，基因序列分析表明，我国霍乱散发O1群和O139群的NhaA基因与GENEBANK中霍乱弧菌O1群野毒株参考序列同源性分别为99％和96％。编码氨基酸的突变率相近(均为2％)，NhaA基因重要的结构和功能决定簇(Asp133，Asp163，Asp164，His225，Leu73和Gly338)未发生变异；第204、222位的氨基酸，O1群和O139群发生相同的变异(Gly→Ala，Gly→Glu)。结论：成功扩增并克隆我国散发霍乱O1群和O139群NhaA基因为研究霍乱流行规律和基因疫苗提供重要的实验依据，NhaA基因编码氨基酸的变异可能是霍乱弧菌适应外环境变化的结果。     

骨肉瘤基因组DNA的提取及部分酶切分析

目的比较提取骨肉瘤基因组DNA,建立基因组DNA的最佳部分酶切条件并制备其部分酶切产物.方法采用经典的基因组DNA提取法和改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA,以限制内切酶Sau3A I部分酶切,采用玻璃珠(Silver Beads)DNA胶回收试剂盒与蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA.结果提取基因组DNA片段大于150 kb,37℃,Sau3AI 14(u/μg)部分酶切骨肉瘤基因组DNA 30 min获得18 kb ～23kb基因片段的富集,制备目的片段DNA.结论经改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA具有纯度、产量高,方法简单,无蛋白和RNA污染,片段足够长,可被Sau3AI部分酶切,玻璃珠(Silver Beads)DNA胶回收试剂盒和蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA纯度高,无小的DNA片段混入,可满足构建入噬菌体载体(EMBL3)基因组文库.为构建骨肉瘤的入EMBL3载体基因组文库做好了前期工作.     

O139群霍乱弧菌TLC、CTX、RTX基因簇缺失株的构建及鉴定

目的构建O139群霍乱弧菌TLC、CTX、RTX基因簇缺失株。方法PCR扩增TLC上游片段(TLC up)、RTX下游片段(RTX down),克隆入pU18中,再在两者间插入氯霉素抗性(Cm)基因,获得重组质粒pUC18-TLC up-Cm-RTX down。酶切回收TLC up-Cm-RTX down片段,克隆入自杀质粒pDS132,构建重组自杀质粒pDS132-TLC up-Cm-RTX down。通过接合将重组自杀质粒转入O139群霍乱弧菌ZJ199693,20%蔗糖选择培养基(Cm抗性)筛选TLC、CTX、RTX基因缺失株。结果PCR、酶切证明重组自杀质粒pDS132-TLC up-Cm-RTXdown构建正确。PCR证实O139群霍乱弧菌ZJ199693TLC、CTX、RTX毒力基因簇成功缺失。结论成功缺失O139群霍乱弧菌ZJ199693TLC、CTX、RTX基因簇,为进一步研究其功能和疫苗构建打下基础。     

新疆中麻黄基因组DNA文库的构建

目的:构建新疆中麻黄(EphedraIntermedia)的基因组DNA文库。方法用Sau3AI对所提新疆中麻黄基因组DNA进行酶切,回收15-23Kb之间的酶切产物片段,然后与LambdavectorBamHIArms进行连接、包装形成文库,计算文库重组噬菌体滴度、包装效率。结果,所建文库的重组噬菌体滴度为1×106pfu/ml、包装效率为2×106重组子/μg载体DNA。结论成功构建了基因组DNA文库,为进一步研究奠定了基础。     

骨肉瘤基因组DNA的提取及部分酶切分析

目的比较提取骨肉瘤基因组DNA,建立基因组DNA的最佳部分酶切条件并制备其部分酶切产物。方法采用经典的基因组DNA提取法和改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA,以限制内切酶Sau3A I部分酶切,采用玻璃珠(SilverBeads)DNA胶回收试剂盒与蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA。结果提取基因组DNA片段大于150 kb,37℃,Sau3A I 1∶4(u/μg)部分酶切骨肉瘤基因组DNA 30 min获得18 kb~23 kb基因片段的富集,制备目的片段DNA。结论经改良玻璃棒缠绕法提取骨肉瘤基因组DNA具有纯度、产量高,方法简单,无蛋白和RNA污染,片段足够长,可被Sau3AI部分酶切,玻璃珠(Sil-ver Beads)DNA胶回收试剂盒和蔗糖梯度离心回收分离目的片段DNA纯度高,无小的DNA片段混入,可满足构建入噬菌体载体(EMBL3)基因组文库。为构建骨肉瘤的入EMBL3载体基因组文库做好了前期工作。