CCL11和 CCL26基因3′UTR 真核表达载体的构建和意义

目的：构建CCL11、CCL26基因3′非翻译区（3′UTR）真核表达载体。方法多聚酶链式反应（ PCR）扩增获得CCL11、CCL26基因3′UTR目的片段,双酶切目的基因片段及pMIR REPORT真核表达质粒后,将目的基因片段插入pMIR REPORT质粒,再将重组质粒转化感受态DH5α菌株,筛选阳性克隆行双酶切鉴定及测序分析。结果成功构建CCL11、CCL26基因3′UTR真核表达载体。结论 CCL11、CCL26基因3′UTR真核表达载体成功建立,为进一步研究CCL11、CCL26基因与MicroRNAs的关系提供实验基础。     

Has-mir-335慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定

目的构建过表达miR-335的稳定细胞株SW620并筛选和初步鉴定miR-335的靶基因。方法扩增包含hsa-miR-335前体序列在内的基因片段,并将其亚克隆至PLVTHM慢病毒载体;扩增包含RASA1 3’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut;检测萤火虫荧光素值(F)和海肾荧光素值(R),以R/F表示相对荧光素酶活性。流式细胞仪筛选建立稳定表达miR-335的细胞株,利用荧光定量PCR检测miR-335及其靶基因RASA1的表达,Western Blot检测RASA1蛋白水平的表达。结果质粒双酶切以及测序鉴定PLVTHM-miR335、psiCHECK-2-RASA1、psiCHECK-2-RASA1-Mut重组质粒构建成功。荧光定量PCR显示结直肠癌细胞中miR-335与RASA1表达趋势成负相关。双荧光素酶报告基因分析证实hsa-miR-335能够作用于RASA1的3’UTR。稳定过表达miR-335的细胞中,miR-335的表达明显高于对照组和未处理组,蛋白质水平有所下降。结论成功构建了PLVTHM-miR-335慢病毒重组质粒,构建过表达miR-335的细胞株SW620,初步证实RASA1是miR-335的靶基因。     

miR-192负性调控人肝癌细胞株HepG2中RB1基因的表达

目的 探讨miR-192对人肝癌细胞株HepG2中RB1基因表达的调节作用.方法 运用生物信息学方法对miR-192进行靶基因预测并分析其潜在靶基因RB1;将含有miR-192结合位点的RB1 mRNA 3′端非编码区(3′UTR)片段和在miR-192结合位点进行突变的RB1 3′UTR突变片段克隆至报告基因载体pMIR-Report luciferase vector,重组质粒分别命名为pMIR-RB1和pMIR-RB1-mut;将重组质粒、Beta-gal内参质粒和microRNA共转染HepG2细胞,双荧光素酶报告基因系统检测各实验组中细胞荧光素酶的表达;SYBR Green荧光定量PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测miR-192对内源性RB1表达的调节作用.结果 生物信息学分析筛选出89个miR-192的潜在靶基因,RB1基因是其中之一;测序验证重组质粒pMIR-RB1和pMIR-RB1-mut构建成功;过表达miR-192时,共转染pMIR-RB1质粒的细胞相对荧光素酶活性(4.80±0.36)较相应过表达miR-NC组(7.90±0.91)明显降低(P＜0.05),而共转染pMIR-Luc或pMIR-RB1-mut质粒的细胞相对荧光素酶活性[pMIR-Luc:(7.68±1.04);pMIR-RB1-mut:(7.56±0.99)]较相应过表达miR-NC组[pMIR-Luc:(7.86±0.73);pMIR-RB1-mut:(7.82±1.05)]无显著差异;上调miR-192水平显著降低HepG2细胞中内源性RB1 mRNA[(0.56±0.10)vs (1.05±0.13)]和蛋白(47% vs 100%)的表达.结论 RB1基因是miR-192的一个靶基因,在HepG2细胞中,miR-192通过直接结合RB1 mRNA 3′UTR而负性调控RB1基因表达.     

Has-mir-335慢病毒表达载体的构建及其靶基因鉴定

接要：目的构建过表达miR-335的稳定细胞株SW620并筛选和初步鉴定miR-335的靶基因。方法扩增包含hsa-miR-335前体
序列在内的基因片段,并将其亚克隆至PLVTHM慢病毒载体;扩增包含RASA1 3’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至
psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut;检测萤火虫荧光素值(F)和海肾荧光素值(R),
以R/F表示相对荧光素酶活性。流式细胞仪筛选建立稳定表达miR-335的细胞株,利用荧光定量PCR检测miR-335及其靶基因
RASA1的表达,Western Blot检测RASA1蛋白水平的表达。结果质粒双酶切以及测序鉴定PLVTHM-miR335、psiCHECK-2-
RASA1、psiCHECK-2-RASA1-Mut重组质粒构建成功。荧光定量PCR显示结直肠癌细胞中miR-335与RASA1表达趋势成负
相关。双荧光素酶报告基因分析证实hsa-miR-335能够作用于RASA1的3’UTR。稳定过表达miR-335的细胞中,miR-335的表
达明显高于对照组和未处理组,蛋白质水平有所下降。结论成功构建了PLVTHM-miR-335 慢病毒重组质粒,构建过表达
miR-335的细胞株SW620,初步证实RASA1是miR-335的靶基因。
     

miR-1290与RASAL2基因靶向关系的探索

目的通过构建RASAL2 3′-非翻译区(3′-UTR)双荧光素酶报告载体,探索RASAL2与非编码核糖核酸(ncRNA)miR-1290的靶向调控情况。方法借助在线数据库Targetscan预测miR-1290与RASAL2结合位点;利用聚合酶链反应(PCR)技术扩增RASAL2基因3′-UTR序列,并以GV272为载体将其连接,分别构建野生型GV272-RASAL2-wt 3′-UTR和突变型GV272-RASAL2-mut 3′-UTR荧光素酶报告基因重组质粒;并将miR-1290及相应阴性对照分别与这两种重组质粒共转染到293T细胞中,通过检测各组荧光素酶活性,探索miR-1290与RASAL2基因的结合情况。结果酶切和测序数据表明:野生型GV272-RASAL2-wt 3′-UTR及突变型GV272-RASAL2-mut 3′-UTR双荧光素酶报告载体构建成功;相较于miR-1290与突变型GV272-RASAL2-mut 3′-UTR共转染组,miR-1290与野生型GV272-RASAL2-wt 3′-UTR共转染组的荧光素酶活性无明显变化(P＞0.05)。结论成功构建了RASAL2 3′-UTR的双荧光素酶报告基因载体,但miR-1290不能与RASAL2结合,不能抑制其表达。     

Has-mir-335 慢病毒表达载体的构建及其靶基因初步鉴定

构建过表达miR-335的稳定细胞株SW620并筛选和初步鉴定miR-335的靶基因。方法 扩增包含hsa-miR-335前体序列在内的基因片段,并将其亚克隆至PLVTHM慢病毒载体;扩增包含RASA1 3’UTR种子区域的基因片段并将其亚克隆至psiCHECK-2载体,并对此重组载体进行定点突变构建psiCHECK-2-RASA1-Mut;检测萤火虫荧光素值(F)和海肾荧光素值(R),以R/F表示相对荧光素酶活性。流式细胞仪筛选建立稳定表达miR-335的细胞株,利用荧光定量PCR检测miR-335及其靶基因RASA1 的表达,Western Blot检测RASA1蛋白水平的表达。结果 质粒双酶切以及测序鉴定 PLVTHM-miR335、psiCHECK-2-RASA1、psiCHECK-2-RASA1-Mut重组质粒构建成功。荧光定量PCR显示结直肠癌细胞中miR-335与 RASA1表达趋势成负相关。双荧光素酶报告基因分析证实hsa-miR-335能够作用于RASA1的3’UTR。稳定过表达miR-335的细胞中,miR-335的表达明显高于对照组和未处理组,蛋白质水平有所下降。结论 成功构建了PLVTHM-miR-335慢病毒重组质粒,构建过表达miR-335的细胞株SW620,初步证实RASA1是miR-335的靶基因。     

NFAT5基因报告载体的构建及其与miR-155关系的实验研究

目的 通过生物信息软件预测出miR-155的靶基因,构建miR-155靶基因荧光素酶基因报告载体,验证其与miR-155的对应关系.方法 以数据库miR Base为依据,对miR-155进行生物信息学分析,通过Target Scan、Mir Base、Pic Tar三大软件预测miR-155的靶基因;将设计合成的T淋巴细胞核因子5(NFAT5)及其突变序列NFAT5-mu序列分别克隆至荧光素酶报告质粒pMIR-REPORTTM Luciferace;将第4代人胚胎肾293AD(HEK-293AD)细胞按随机数字表法分为4组:miR-155 mimics+pMIR-NFAT5组、miR-155 mimics+pMIR-NFAT5-mu组、miR-155 inhibitor+pMIR-NFAT5组、miR155 Negative control+pMIR-NFAT5组与对照质粒(pRL-TK)共转染24 h后用双荧光素酶检测试剂盒测定相对荧光素酶活性.结果 Mirbase、TargetScan、PicTar预测交叉结果显示,NFAT5基因3'UTR与miR-155存在结合互补位点;构建pMIR-NFAT5、pMIR-NFAT5-mu重组质粒经酶切及测序鉴定正确;双荧光素酶报告基因检测系统显示:pMIR-NFAT5+ miR155 mimics组较pMIR-NFAT5+miR-control组荧光素酶活性降低,差异有统计学意义(P＜0.01);而其他组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建pMIR-NFAT5、pMIR-NFAT5-mu荧光素醇报告基因重组质粒;证实miR-155对NFAT5基因mRNA 3'-UTR具有靶向调控作用,为下一步研究miR-155在吸入性肺损伤机制中的作用提供前期实验室数据和方法.     

COPD中MicRNA-320c-5p调节SERPINA1基因表达的研究

目的 通过双荧光素酶报告系统验证miR-320c-5p对SERPINA1基因的靶向调控关系。方法 从人正常肺上皮细胞基因组库中获取SERPINA1基因的3′UTR序列,并通过序列匹配拟定候选miRNA。利用3%香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)诱导人支气管上皮细胞(BEAS-2b细胞)建立慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)细胞模型作为实验组,正常培养的BEAS-2b细胞作为对照组,使用实时荧光定量聚合酶链反应(real time flurocent qualitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)法检测两组SERPINA1和候选miRNA的表达水平。构建野生型及突变型双荧光素酶报告基因载体,分别将双荧光素酶报告质粒(psiCHECK-2-SERPINA1-3′UTR和psiCHECK-2-SERPINA1-3′UTR mut)和miRNA质粒(miR-320-5p mimic)共转染到293T细胞,进行荧光活性测定。结果 通过序列...     

miR-20a-5p调控成骨细胞分化相关靶基因的筛选及靶向关系验证

目的:筛选miR-20a-5p调控成骨分化的靶基因,深入研究miR-20a-5p调控成骨分化的分子机制。方法:通过靶基因预测软件预测miR-20a-5p的靶基因,将靶基因的3′UTR及点突变序列插入荧光素酶或绿色荧光蛋白（GFP）报告载体中,并与miR-20a-5p的模拟物或阴性对照共转染HEK-293T细胞,通过双荧光素酶实验和GFP抑制实验检测荧光素酶活性及GFP阳性细胞比例,确定miR-20a-5p与靶基因的靶向关系。结果:通过生物信息学预测到Smad7是miR-20a-5p的靶基因,miR-20a-5p在不同物种的Smad7基因3′UTR区都有保守的结合种子序列;荧光素酶、GFP报告基因及点突变载体经PCR及测序鉴定均正确;双荧光素酶活性检测结果显示:miR-20a-5p显著降低Smad7 3′UTR报告基因载体的荧光素酶活性;GFP抑制实验及流式细胞仪检测结果显示:miR-20a-5p可以显著降低GFP阳性细胞的比例。结论:miR-20a-5p可以直接靶作用于Smad7 3′UTR的种子序列,提示其可能通过直接靶向Smad7基因来发挥促进成骨分化的调控作用。     

Let-7a负性调控肺癌A549细胞中NIRF基因的表达

目的：探讨肺癌A549细胞中let-7a对其靶基因NIRF表达的调控作用.方法：运用生物信息学方法对let-7a进行靶基因预测并分析其靶基因NIRF;构建含有NIRF 3′UTR全长的荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR;将pRL-TK或pRL-TK-NIRF 3′UTR与pGL3-control,及let-7a mimics或control mimics共转染A549细胞,双荧光素酶报告系统检测试剂盒测定转染后A549细胞中荧光素酶的表达;A549细胞分别转染let-7a mimics和control mimics,Western Blot检测NIRF蛋白的表达.结果：NIRF3′UTR含有一个let-7a结合位点,而且该结合位点在多个物种高度保守;经测序证实荧光素酶报告质粒pRL-TK-NIRF 3′UTR构建成功;共转染let-7amimics,pRL-TK-NIRF3′UTR与pGL3-control的A549细胞组,荧光素酶活性明显降低（P〈0.01）,为对照组（共转染pRL-TK与pGL3-control的A549细胞组）的50%;Western Blot检测显示,与未转染的A549细胞相比,转染let-7a mimics的A549细胞中NIRF蛋白的表达显著降低（P〈0.01）,而转染control mimics的A549细胞中NIRF表达无明显变化（P〉0.05）.结论：肺癌A549细胞中,let-7a可以结合到NIRF 3′UTR,负性调控NIRF的表达.     

建立基于荧光素报告基因系统检测雌激素样物质方法的研究

目的 建立基于报告基因的HeLa细胞体外雌激素样物质检测方法.方法 分别构建含有人雌激素hER α和hER β编码序列的表达质粒以及人雌激素反应元件(estrogen response elements,ERE)调控的荧光素报告质粒,用脂质体将hER α、ERE质粒或hER β、ERE质粒共转染HeLa细胞,用雌二醇(E2)处理后检测报告基因荧光素酶的活性.结果构建了pER αneo和pER βneo质粒以及ERE调控的荧光素酶报告质粒pGL3-ERE-Luc,共转染质粒pERE4-Luc和pER αneo或pERE4-Luchygro和pEP αneo到HeLa细胞株后,建立稳定表迭ERE-Luc的hER α/hEP β HeLa细胞株,实验证实报告基因的表达与E2呈明显的剂量反应关系,ER α和ER β的EC50分别为9.2×10-11mol/L和2.5×10-10mol/L.结论 基于荧光素酶报告基因的体外雌激素样物质检测方法有效可靠.     

食管癌细胞中fascin基因启动子区的克隆与初步鉴定

目的:对食管癌细胞中fascin基因启动子区进行克隆鉴定. 方法:应用PCR技术从食管癌细胞系EC109中扩增出fascin基因5′侧翼区5段不同长度的片段,并将其克隆至萤火虫荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic(pGLB)中, 然后将这些质粒与对照质粒pGLB、内参照质粒pRL-TK共转染EC109细胞,48 h后用双荧光素酶检测系统分析这些重组子报告基因转染细胞的相对荧光强度,并结合生物信息学分析,以判断fascin基因启动子区所在位置. 结果:用DNA重组技术成功构建了5个系列缺失重组荧光素酶报告基因表达载体. 相对荧光素酶活性检测表明,与对照组相比,上述一系列重组质粒转染细胞均显示出较高的荧光素酶活性. 生物信息学分析发现,在启动子区(-436～ 1)有标志性调控元件TATA盒(-34～-29). 结论:在食管癌细胞中fascin基因的启动子区可能位于转录起始位点上游约436 bp的区段内.     

m iR-335通过靶向生存素对乳腺癌细胞增殖的调控作用

目的：探讨miR‐335通过靶向生存素对乳腺癌细胞增殖的调控作用。方法（1）选取乳腺癌组织及癌旁正常组织,分别采用RT‐PCR、Western blot检测组织中 miR‐335及生存素蛋白表达。（2）选取乳腺癌细胞系 MCF‐7,分别转染 miR‐335 mimic及mimic对照组,采用RT‐PCR、Western blot检测组织中miR‐335及生存素蛋白表达。（3）选取乳腺癌细胞系MCF‐7,分别将野生型survivin 3′‐UTR质粒（survivin‐wt）和突变型survivin 3′‐UTR质粒（survivin‐Mut）与miR‐335 mimic或模拟物阴性对照（NC）共转染至乳腺癌细胞系MCF‐7,双荧光素酶报告基因检测细胞荧光素酶活性。（4）选取乳腺癌细胞系MCF‐7,分别转染mimic对照组、miR‐335 mimic及miR‐335 mimic＋survivin ,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测各组细胞增殖活性。结果（1）与癌旁组织相比较,乳腺癌组织中miR‐335表达显著降低（P＜0．05）,同时生存素蛋白表达显著增高（P＜0．05）。（2）与转染mimic对照组相比较,转染miR‐335 mimic可使乳腺癌细胞MCF‐7中miR‐335表达上调（P＜0．05）,同时生存素蛋白表达表达下调（P＜0．05）。（3）与转染NC相比较,共转染miR‐335 mimic与survivin‐wt可使MCF‐7荧光素酶活性降低（P＜0．05）,而共转染miR‐335 mimic与survivin‐Mut则MCF‐7荧光素酶活性无显著性变化（P＞0．05）。（4）转染miR‐335mimic后,MCF‐7增殖活性较转染mimic对照组显著降低（P＜0．05）;而转染miR‐335 mimic＋survivin后,MCF‐7增殖活性较单纯转染miR‐335 mimic显著提高（P＜0．05）,但仍显著低于转染mimic对照组（P＜0．05）。结论在乳腺癌组织中miR‐335呈现低表达,生存素呈现高表达;而miR‐335可通过靶向生存素抑制乳腺癌细胞系MCF‐7增殖。     

不同双荧光素酶方法对检测胃癌相关miRNAs靶向基因TIAM1的影响

目的:探讨不同双荧光素酶实验方法对检测胃癌相关miRNAs靶向基因TIAM1的影响。方法:从胃癌细胞系BGC823基因组中提取T-细胞淋巴瘤侵袭转移诱导基因(TIAM1)的3’非编码区(3’-UTR)片段全长,将TIAM1-3’UTR构建在2种不同的荧光素酶基因质粒上,选择8个miRNAs进行双荧光素酶实验研究。结果:miR-10b的抑制物使2种质粒的相对荧光素酶活性均升高;miR-651和miR-653的抑制物使2种质粒的相对荧光素酶活性变化完全相反;miR-10b-5p的抑制物和类似物(mimic)分别使psi-TIAM1-3’UTR的相对荧光素酶活性增高和减弱;而miR-372-3p、miR-373-3p和miR-653-5p的抑制物和类似物处理组荧光素酶活性均升高,miR-335-3p的抑制物和类似物处理组荧光素酶活性均减低。结论:进行双荧光素酶实验时psi-TIAM1-3’UTR这类2种基因位于同一质粒且不以Renilla作为内参的质粒较为合适,并发现miR-10b-5p能够直接靶向作用于TIAM1-3’UTR。     

CCL3、CCL4下调表达和重症继发性肺结核病理损伤的关系

目的研究趋化因子CCL3和CCL4下调表达与重症继发性肺结核病理损伤的相关性。方法用基因表达谱芯片对5例重症、5例轻症继发性肺结核和5例健康对照进行差异基因的筛选;用实时荧光定量PCR测定20例重症、20例轻症,患者和8例健康对照外周血单个核细胞CCL3、CCL4相对表达量;酶联免疫吸附法测定20例重症、20例轻症和20例健康对照CCL3、CCL4在血浆中的蛋白表达量;用方差分析和非参数检验统计方法判断组间比较的统计学差异。结果芯片筛选重症与轻症组比较的差异基因显示CCL3、CCL4表达下调,下调比值分别为0.153 1和0.122 7。实时荧光定量PCR结果、酶联免疫吸附法均显示重症组与轻症组相比CCL3、CCL4表达下调(均P<0.05)。结论重症继发性肺结核患者CCL3、CCL4表达下调,可能是促进重症继发性肺结核肺结构破坏的因素之一。     

转录因子MZF1对大鼠RGC32基因启动活性的影响及可能的结合部位

目的 :构建大鼠补体应答基因32(response gene to complement,RGC32)启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察人胚肾细胞(HEK293)过表达髓锌指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)对大鼠RGC32基因启动活性的影响。同时,筛选其可能的MZF1结合位点。方法:将RGC32基因启动子全长(-686~-1 nt)插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得RGC32基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-RGC32-FL)后,再将p GL3-RGC32-FL与本课题组前期构建的大鼠野生型MZF1表达质粒(p IRES2-EGFP-MZF1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,以确定MZF1对RGC32基因的启动作用。另用生物信息学软件预测RGC32基因启动子上转录因子MZF1潜在的结合位点,并据此构建3个RGC32基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3)。将上述RGC32基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒与MZF1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,以筛选MZF1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠RGC32基因启动子(全长和各截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-RGC32-FL和p IRES2-EGFPMZF1共转染HEK293细胞发现,RGC32基因启动子活性显著增加。而将p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3分别与p IRES2-EGFP-MZF1共转染HEK293细胞后显示,p GL3-RGC32-3的启动活性显著低于p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1和p GL3-RGC32-2。提示MZF1可能结合在RGC32基因启动子的-286~-86 nt区域。结论 :成功构建了大鼠RGC32基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,证实过表达MZF1可促进RGC32基因的启动,并初步筛查出转录因子MZF1在RGC32基因启动子上可能的结合区域。     

稳定表达人CCL17基因的肝癌细胞系的建立及CCL17活化T淋巴细胞功能的初步鉴定

目的建立稳定表达人CCL17基因的肝癌细胞系并初步验证CCL17活化T淋巴细胞的抗肿瘤功能。方法分离肝癌患者腹腔液单个核细胞及淋巴细胞,提取单个核细胞总RNA,RT-PCR扩增CCL17基因,经克隆测序后将CCL17插入真核表达载体pCDNA3.1(-);将真核表达质粒转染肝癌细胞系BEL-7402细胞,利用G418筛选抗性单克隆细胞株,Western blot检测细胞培养上清中CCL17的表达水平;用含CCL17的培养上清液刺激腹腔液来源淋巴细胞后,再与BEL-7402细胞共孵育,利用Annexin V/PI凋亡检测试剂盒检测肿瘤细胞凋亡率,倒置相差显微镜观察肿瘤细胞形态学改变。结果成功克隆出CCL17基因全长序列,并构建了真核表达质粒pCDNA3.1(-)-CCL17;质粒转染BEL-7402细胞后经G418筛选获得5个抗性单克隆细胞株,Western blot结果显示5株细胞培养上清液中均有CCL17表达,其中克隆株F9、F11和G8表达量较高;与对照组比较,含CCL17培养上清液刺激后的腹腔液淋巴细胞,能诱导BEL-7402细胞发生显著凋亡样改变。结论成功构建了稳定表达人CCL17基因的肝癌细胞系,并初步证实含CCL17的细胞培养上清液有活化T淋巴细胞,促进杀伤肿瘤的作用。     

CCL28-CCR10通路在类风湿关节炎单核细胞迁移中的作用

目的：观察类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者关节中单核/巨噬细胞趋化因子受体CCR10的表达,探讨趋化因子CCL28与其受体CCR10在RA单核细胞迁移中的作用及机制。方法：采用免疫组织化学法分析8例RA患者、4例骨关节炎(osteoarthritis, OA)患者和4例正常对照者滑膜组织中CCR10的表达并进行细胞染色评分(0～5分),流式细胞术检测26例RA患者和20例健康对照者外周血、15例RA患者滑液CD14⁺单核细胞中CCR10阳性细胞比例,Transwell迁移实验检测CCL28对RA和健康对照单核细胞的趋化性,Western blotting检测CCL28干预RA单核细胞的细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路磷酸化。结果：CCR10表达在RA滑膜衬里层细胞及衬里下层的巨噬细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞;RA滑膜衬里层细胞和衬里下层巨噬细胞的CCR10表达明显高于OA和正常对照的滑膜(P均&l...     

CCL20通过ERK通路促进食管鳞癌细胞迁移和侵袭

目的 研究趋化因子配体20(CCL20)对食管鳞癌细胞迁移、侵袭和增殖的影响,并初步探讨其分子机制.方法 转染CCL20表达质粒和干扰质粒至食管鳞癌细胞,用G418筛选稳定转染细胞,Western blot或实时定量PCR实验评估过表达和干扰效果.采用Transwell和CCK8实验检测CCL20对食管鳞癌细胞迁移、侵...     

POMC基因5‘上游近端片段的转录调控作用初探

目的　建立阿片黑皮质素原 (POMC)基因 5′上游近端转录调控体系并初步探讨其作用特点。方法　采用 DNA重组技术构建一系列受大鼠 POMC基因 5′上游近端不同长度片段介导的荧光素酶报告基因质粒 ,以lipofectam ine 包裹质粒转染垂体 ACTH瘤细胞系 (At T2 0 ) ,然后测定荧光素酶活性。结果　成功地构建了含POMC基因 - 34 / 6 3bp、- 16 5 / 6 3bp、- 32 3/ 6 3bp和 - 480 / 6 3bp片段的 4种报告基因质粒 ,其荧光素酶相对表达活性分别为 1、2 .1± 0 .3、3.3± 0 .3和 3.7± 0 .5 ,阳性对照为 4.8± 0 .8。结论　 POMC基因的核心启动子比较弱 ,提示 POMC基因可能存在多个转录起始位点 :At T2 0细胞中 POMC基因持续表达的近端组织特异性调控元件主要集中于 - 34 / - 16 5 bp范围内。上述结果为进一步研究各种调节因子对该基因的表达调控打下基础