应用改良差速贴壁法和有限稀释技术分离培养小鼠来源肌源干细胞

背景：研究者们通过多种方法从肌组织中分离得到肌源干细胞,并应用于各类组织工程和再生医学研究。目的：结合改良的差速贴壁法和有限稀释技术分离小鼠来源肌源干细胞,并培养其单细胞克隆和亚克隆集落。方法：以新生C57BL/6小鼠四肢作为肌组织取材对象,经三重酶消化和细胞筛过滤,运用改良的差速贴壁法分离出肌源干细胞,予细胞特异标记物以免疫组织化学染色;以有限稀释技术克隆培养的方法,获得稳定的肌源干细胞单克隆和亚克隆集落。结果与结论：差速贴壁培养过程中,肌性细胞占比逐渐增高,首次贴壁1h可以获得足够数量的细胞进行第6次贴壁培养;肌源干细胞需72h左右贴壁生长,经10d左右可以增殖为300～500细胞数量的集落,细胞形态以小圆形细胞为主,并有少量梭形细胞,肌源干细胞能够维持形态并持续增殖;应用有限稀释技术可获得肌源干细胞单克隆和亚克隆集落,肌源干细胞克隆细胞均呈现Desmin染色阳性,Sca-1染色阳性,阳性率为（92.3±4.1）%。提示应用preplate法和有限稀释技术可以分离得到小鼠来源肌源干细胞及其克隆集落。     

差速贴壁法体外培养失神经骨骼肌肌源性干细胞的生物学特性

目的:探讨失神经过程中的肌源性干细胞的生物学特性,掌握其分离、培养及鉴定方法,了解其生长规律并进行体内定位。方法:实验于2004-01/2005-10华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科完成。选取清洁级3周龄昆明种小鼠5只,切断小鼠双侧坐骨神经,造成失神经损伤模型。采用XI型胶原酶和胰蛋白酶消化法及差速贴壁法分离细胞获取小鼠肌源性干细胞,进行体外原代和传代培养。观察细胞的形态,通过生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力,利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。结果:①失神经骨骼肌内肌源性干细胞生长特性:失神经骨骼肌肌源性干细胞原代培养时细胞贴壁及生长较慢,1个月后才进行传代。传代培养3d后部分细胞呈梭形,成簇状生长。7～10d后大部分为梭形和多形状,细胞间相互出现成片融合,此后细胞生长速度放慢。②失神经骨骼肌肌源性干细胞生长曲线的绘制:细胞培养前3d细胞生长慢,3d后生长明显加快,7d后生长明显放慢,进入平台期。③失神经骨骼肌内肌源性干细胞的表型鉴定:细胞质CD34和Sca-1染色均呈阳性,细胞核大。④失神经骨骼肌内肌源性干细胞的体内定位:CD34和Sca-1阳性细胞位于肌细胞和基底膜之间,细胞小,细胞数量较少。结论:采用差速贴壁法可从失神经骨骼肌内分离出肌源性干细胞,体外培养的肌源性干细胞具有良好的增殖能力,适用于组织工程和基因治疗。     

差速贴壁法体外培养失神经骨骼肌肌源性干细胞的生物学特性

目的：探讨失神经过程中的肌源性干细胞的生物学特性，掌握其分离、培养及鉴定方法，了解其生长规律并进行体内定位。 方法：实验于2004-01／2005—10华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科完成。选取清洁级3周龄昆明种小鼠5只，切断小鼠双侧坐骨神经．造成失神经损伤模型。采用Ⅺ型胶原酶和胰蛋白酶消化法及差速贴壁法分离细胞获取小鼠肌源性干细胞，进行体外原代和传代培养。观察细胞的形态，通过生长曲线分析肌源性干细胞的增殖能力，利用免疫细胞化学染色对所获得的细胞进行鉴定。 结果：①失神经骨骼肌内肌源性干细胞生长特性：失神经骨骼肌肌源性干细胞原代培养时细胞贴壁及生长较慢，1个月后才进行传代。传代培养3d后部分细胞呈梭形，成簇状生长。7-10d后大部分为梭形和多形状，细胞间相互出现成片融合，此后细胞生长速度放慢。②失神经骨骼肌肌源性干细胞生长曲线的绘制：细胞培养前3d细胞生长慢，3d后生长明显加快．7d后生长明显放慢，进入平台期。③失神经骨骼肌内肌源性干细胞的表型鉴定：细胞质CD34和Sca-1染色均呈阳性，细胞核大。④失神经骨骼肌内肌源性干细胞的体内定位：CD34和Sea-1阳性细胞位于肌细胞和基底膜之间，细胞小，细胞数量较少。 结论：采用差速贴壁法可从失神经骨骼肌内分离出肌源性干细胞，体外培养的肌源性干细胞具有良好的增殖能力，适用于组织工程和基因治疗。     

生长因子对骨骼肌肌源性干细胞增殖的影响

背景:单纯应用差速贴壁法获得的原代肌源性干细胞数量少,生长速度较慢,不利于获取满足实验及将来临床所需的细胞数量.目的:观察碱性成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子1在体外对体外培养肌源性干细胞增殖的作用,探索体外大量培养肌源性干细胞的方法和条件.设计、时间及地点:观察对比实验,于2007-09/2008-04在武汉大学人民医院泌尿外科实验室完成.材料:2周龄体质量50～80 g的SD大鼠20只.方法:采用改良差速贴壁培养法分离大鼠骨骼肌肌源性干细胞:取新生大鼠肌肉标本分离细胞;维持总的贴壁时间基本不变,减少贴壁次数,取第2代肌源性干细胞进行体外成肌分化.主要观察指标:以免疫细胞化学法及免疫荧光法鉴定肌源性干细胞.以MTT比色实验检测5,10,20,40,80 μg/L的碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1及胰岛素样生长因子1+碱性成纤维细胞生长因子对肌源性干细胞增殖的影响.以流式细胞仪检测碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1和胰岛素样生长因子1+碱性成纤维细胞生长因子对细胞周期的影响.结果:肌源性干细胞原代培养70 h后开始贴壁,呈规则的圆形.1周后细胞数量增多,细胞展开呈纺锤性.免疫细胞化学染色法和细胞免疫荧光法显示肌源性干细胞呈结蛋白、干细胞抗原1和CD34阳性.传代细胞加入碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子1后肌源性干细胞的增殖活性增强,两种细胞因子作用强度相近,随着两种细胞因子浓度的提高促细胞增殖作用逐渐提高,在达到有效浓度后作用趋于饱和.两种细胞因子作用机制不同,碱性成纤维细胞生长因子主要是增加G2M期的细胞比例,通过缩短细胞周期达到增殖作用,胰岛素样生长因子1则主要增加S期细胞的比例,通过活化由G0期到G1期转化的进入有丝分裂细胞来达到增殖作用.结论:胰岛素样生长因子1和碱性成纤维细胞生长因子都具有刺激肌源性干细胞增殖的作用,两者联合作用既可以增加早期由 G0期进入G1期的数量,又可以减短细胞有丝分裂周期,从而达使促增殖效果更快、更强.     

全骨髓贴壁并差速传代分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞:与密度梯度离心法的比较

背景:目前国内外分离纯化骨髓间充质干细胞有两种主要方法;密度梯度离心法及全骨髓贴壁法,前者步骤较复杂,后者简单易操作,但纯化效果不理想.目的:在全骨髓贴壁分离骨髓间充质干细胞基础上,并用差速传代消化法,建立大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养纯化方法.方法:全骨髓贴壁培养法分离并差速消化传代大鼠骨髓间充质干细胞,利用间充质干细胞在消化传代过程中较其他骨髓细胞消化悬浮速度快,以及贴壁快的特点,代替密度梯度离心操作来分离纯化间充质干细胞,对其形态学特征进行观察,并与密度梯度离心法比较两种分离培养法的细胞生长增殖情况;观察碱性磷酸酶及油红染色情况,验证骨髓间充质干细胞的分化能力;检测细胞表面标记物,验证免疫特性及检测其纯度.结果与结论:全骨髓贴壁培养法分离并差速传代大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞鉴定、成骨成脂肪培养结果显示其细胞免疫特性、纯度、分化能力与密度梯度离心法无显著差异,但细胞活力,增殖能力有明显提高.     

大鼠肌源性干细胞的分离、纯化和培养

背景:要获得满足临床需要的肌源性干细胞,体外筛选和扩增已成为关键环节.目的:拟建立稳定高效的成年大鼠肌源性干细胞的分离培养、纯化方法.方法:成年SD大鼠麻醉后,无菌条件下取骨骼肌,采用Ⅺ型胶原酶、Dispase和胰酶消化法获得肌源性干细胞,以密度梯度离心法和差速贴壁法进行纯化.记录细胞生长曲线,MTT比色法观察不同接种密度对细胞生长的影响,采用免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定.结果与结论:原代肌源性干细胞体积较小,贴壁缓慢,折光性较好,多呈球形、梭形或纺锤形,增殖缓慢.传代培养后,加入含体积分数为20%血清浓度的完全培养基,以1×109L-1密度接种时活细胞数量最多,为适宜接种密度,传1～4代细胞生长状态良好.免疫细胞化学染色结果为desmin(+),CD34(+),CD45(-),Sea-1(+),证实通过体外原代培养获得了高纯度的肌源性干细胞,并成功扩增.     

大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞的分离及鉴定

背景:前期研究在大鼠阴茎海绵体组织中检测到了具有干细胞标志物及肌源性标志物的干细胞.目的:在前期研究基础上,对大鼠阴茎海绵体肌源性干细胞进行分离及表型鉴定.方法:取2月龄SD大鼠阴茎海绵体组织,采用Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶消化分离组织,采用Preplate差速贴壁技术对细胞进行初步纯化,获得PP1~PP6贴壁细胞,并进行流式细胞仪检测、免疫荧光细胞化学鉴定及Western blotting检测.结果与结论:连续6步差速贴壁分离后,PP1~PP6细胞贴附能力逐渐减弱,PP6细胞两三天后开始贴壁形成圆形或梭形.流式细胞仪检测PP6细胞中干细胞抗原1(+)5.7%、胚胎抗原(+)2.6%、结蛋白(+) 41.2%.免疫荧光细胞化学显示仅有少量细胞分别表达干细胞抗原1和胚胎抗原,均散在分布,干细胞抗原1主要表达于胞浆,胚胎抗原主要表达于胞核,表达结蛋白的细胞聚集,数量较多,主要表达于胞浆;亦发现有极少量双阳性表达细胞,即干细胞抗原1/胚胎抗原、干细胞抗原1/结蛋白和胚胎抗原/结蛋白.PP1~PP5细胞中未检测到干细胞抗原1及胚胎抗原蛋白明显表达,但在PP6细胞中则检测到干细胞抗原1及胚胎抗原蛋白的表达.结蛋白在PP1~PP6细胞中的表达逐渐增强.提示在大鼠阴茎海绵体中发现具有干细胞及肌源性干细胞表型的细胞.     

体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞最佳胚龄的筛选:孕2.5d与3.5d及4.5d比较

背景:昆明小鼠基因型与人类近似,建立昆明小鼠胚胎干细胞系有利于其转基因动物的获得,但目前对于何时收集胚胎尚无明确报道.目的:探讨体外分离培养昆明小鼠胚胎干细胞的最佳胚龄.方法:分别从孕2.5 d,3.5 d和4.5 d的昆明系母鼠子宫中分离收集胚胎,于显微镜下观察胚胎的形态、贴壁情况、内细胞团形成情况、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率等,并进行碱性磷酸酶染色.结果与结论:孕2.5 d采集的胚胎多为16细胞期胚胎,孕3.5 d采集的胚胎多为桑椹胚,孕4.5 d采集的胚胎多为囊胚.孕2.5 d胚胎和孕3.5 d胚胎的贴壁率、内细胞团形成率、胚胎干细胞克隆率、胚胎干细胞亚克隆率均无明显差异(P＞0.05);孕4.5 d胚胎上述指标均显著高丁二前两者,更适合作为胚胎干细胞培养、克隆、分离、传代的材料.     

兔肌源性干细胞的分离及诱导分化为成骨细胞的观察

目的:探讨兔肌源性干细胞的分离、鉴定和诱导分化的方法。方法:取2月龄幼兔臀肌1g,采用胶原酶,dispase,胰蛋白酶分步消化,针头过滤,差速贴壁法分离肌源性细胞。用锥虫蓝染色细胞计数描记生长曲线,MTT法间接反映细胞增殖活性。作Bcl-2,Desmin免疫细胞化学染色鉴定肌源性细胞。用分化培养基(DMEM+5mL/LFBS+50mL/LHS+10mg/LBMP2+5g/L维生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+10mg/L地塞米松+10g/L青霉素/链霉素)诱导细胞分化,用Osteocalcin,碱性磷酸酶,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色鉴定成骨前体细胞。结果:用上述方法分离的肌源性细胞呈短梭形或多角形,体积明显小于肌细胞,24h贴壁,接种后36h开始增殖,生长有明显的方向性,原代肌源性干细胞对数生长期为7～9d,16d汇合。第3代肌源性干细胞接种后第3～5天为对数生长期,约8d汇合。细胞汇合后少部分细胞出现双核或三核,甚至出现核链,显示肌细胞分化倾向。约60%～70%的原代肌源性干细胞Bcl-2,Desmin免疫细胞化学染色呈阳性。用成骨细胞分化培养基中培养2周后,大部分细胞Osteocalcin,碱性磷酸酶,Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色呈阳性,显示其成骨前体细胞分化。结论:用上述方法分离的肌源性细胞具有干细胞特征,并能在体外分化为成骨前体细胞和肌起源细胞,是一种组织特异性干细胞,即肌     

乳鼠肌源性干细胞向许旺样细胞的诱导分化

背景：有证据显示,肌源性干细胞能够促进肌纤维的再生,增强再生肌组织的功能,并具有分化为神经外膜组织细胞和具有许旺细胞表型细胞的潜能。目的：分析许旺细胞条件培液诱导小鼠乳鼠源肌源性干细胞向许旺细胞的分化,探讨其作为神经组织工程的种子细胞的可行性。方法：取C57BL/6乳鼠四肢骨骼肌,采用改良的Preplate技术纯化培养肌源性干细胞,利用抗体Desmin和Sca-1对纯化后的细胞进行免疫细胞化学鉴定。采用许旺细胞条件培液诱导其向许旺细胞分化,并行许旺细胞特异性抗体S100β、P75NTR免疫细胞化学鉴定。结果与结论：从小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞,能在体外稳定增殖传代,Desmin和Sca-1免疫细胞化学染色阳性。肌源性干细胞经体外诱导分化后部分细胞S100β、P75NTR染色阳性。说明应用改良的Preplate方法,可从新生小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞;采用许旺细胞条件培液能将其诱导分化为许旺样细胞,有可能成为神经组织工程神经较理想的许旺细胞替代物。     

大鼠肌源性干细胞的培养与鉴定

背景:肌源性干细胞是一种成体多能干细胞,已成为基因治疗和细胞介导的组织工程领域内的研究热点,临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁具有广泛前景。目的:探讨大鼠肌源性干细胞体外原代培养的方法,为临床应用自体肌源性干细胞注射治疗压力性尿失禁提供实验依据。设计:重复观察测量。单位:武汉大学人民医院生殖中心与泌尿外科。材料:实验于2003-12/2004-05在武汉大学人民医院泌尿外科实验室完成。选取4～6周龄雌性SD大鼠20只,XI型胶原酶、胰酶、多聚赖氨酸(Sigma公司),dispase酶(Gibco公司),鸡胚提取液(自制)。方法:①将大鼠以质量浓度为10g/L的戊巴比妥钠30g/kg腹腔麻醉后,无菌条件下取腓肠肌,置入冷DMEM培养基中,D-Hank’s液洗涤组织块,除去筋膜、肌腱、神经和血管,剪成1.0～3.0mm3小块,移入离心管。向组织中加入0.2%XI型胶原酶及0.1%的胰酶,采用胶原酶分离大鼠骨骼肌细胞。②应用差速贴壁法大鼠骨骼肌细胞进行纯化。细胞筛网过滤后接种至多聚赖氨酸包被的培养瓶中,37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中孵育1h,未贴壁细胞移入新的培养瓶中,加入新的培养基37℃培养1h后,未贴壁细胞再次转瓶换液,37℃培养过夜,如此反复,每次间隔24h转瓶换液,培养第5～6天贴壁的细胞即肌源性干细胞。③细胞生长到70%融合后,胰蛋白酶消化,以1∶2的比例进行传代。传代细胞消化后接种于放有盖玻片的6孔培养板中,加入生长培养基,24h后制备细胞爬片,采用免疫组织化学方法鉴定所培养细胞上特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1的表达。主要观察指标:肌源性干细胞的形态及其鉴定结果。结果:①肌源性干细胞的形态观察:从骨骼肌组织中分离出来的肌源性干细胞呈球形,折光性强。培养12h后开始贴壁仍为圆形,48h后贴壁完全并开始增生,细胞逐渐延展成梭形或纺锤形,有两极,体积小。随培养时间的延长,细胞相互融合形成成熟的多核肌管。②肌源性干细胞的鉴定结果:细胞特异性结蛋白抗原和干细胞抗原-1染色呈阳性,荧光显微镜可见细胞浆发出红色荧光,阳性率达90%。结论:肌原性干细胞属于成体干细胞,具有取材方便、免疫原性低、移植后存活时间长等优点。高纯度的肌原性干细胞可通过体外原代培养获取,免疫组化技术可鉴定其肌源性和干细胞特性,在组织工程和基因治疗中具有广泛的应用前景。     

Gene therapy and tissue engineering based on muscle-derived stem cells

Skeletal muscle represents a convenient source of stem cells for cell-based tissue and genetic engineering. Muscle-derived stem cells (MDSCs) exhibit both multipotentiality and self-renewal capabilities, and are considered to be distinct from the well-studied satellite cell, another type of muscle stem cell that is capable of self-renewal and myogenic lineage differentiation. The MDSC appears to have less restricted differentiation capabilities as compared with the satellite cell, and may be a precursor of the satellite cell. This review considers the evidence for the existence of MDSCs as well as their origin. We will discuss recent investigations highlighting the potential of stem cell transplantation for the treatment of skeletal, cardiac and smooth muscle injuries and disease. We will highlight challenges in bridging the gap between understanding basic stem cell biology and clinical utilization for cell therapy.     

诱导人眼轮匝肌来源肌源干细胞向许旺细胞样细胞的分化

背景:肌源干细胞的优越性引导学者们尝试从人眼轮匝肌中分离该细胞,同时进行许旺细胞方向的诱导分化,为周围神经的修复提供新的种子细胞来源。目的:诱导人肌源干细胞向具有许旺细胞特性的细胞分化。方法:①收集重睑成形术中切除的上睑眼轮匝肌,经酶消化和细胞筛过滤,贴壁培养分离人肌源干细胞,予细胞特异标记物以免疫组织化学染色。②取大鼠坐骨神经分离培养许旺细胞,收集许旺细胞条件培养液。③将人肌源干细胞与许旺细胞条件培养液共培养,观察转化细胞的形态和免疫组织化学染色的变化。结果与结论:①原代培养4周时可见人肌源干细胞,与传代培养之人肌源干细胞同样呈现明显的小圆形形态,折光性强,少量细胞呈现短梭形。所有人肌源干细胞表现为 Desmin 阳性,Sca-1 染色阳性。②分离培养大鼠坐骨神经来源许旺细胞S100染色阳性率为(97.4±0.7)%。③经与许旺细胞条件培养液共培养,人肌源干细胞分化后细胞表达许旺细胞特异标记物S100,GFAP和p75。结果提示分离获得人肌源干细胞与许旺细胞条件培养液共培养,可以诱导人肌源干细胞表达许旺细胞特异标记物,初步证实了人肌源干细胞可分化为许旺细胞样细胞。     

Nerve growth factor improves the muscle regeneration capacity of muscle stem cells in dystrophic muscle

Researchers have attempted to use gene- and cell-based therapies to restore dystrophin and alleviate the muscle weakness that results from Duchenne muscular dystrophy (DMD). Our research group has isolated populations of muscle-derived stem cells (MDSCs) from the postnatal skeletal muscle of mice. In comparison with satellite cells, MDSCs display an improved transplantation capacity in dystrophic mdx muscle that we attribute to their ability to undergo long-term proliferation, self-renewal, and multipotent differentiation, including differentiation toward endothelial and neuronal lineages. Here we tested whether the use of nerve growth factor (NGF) improves the transplantation efficiency of MDSCs. We used two methods of in vitro NGF stimulation: retroviral transduction of MDSCs with a CL-NGF vector and direct stimulation of MDSCs with NGF protein. Neither method of NGF treatment changed the marker profile or proliferation behavior of the MDSCs, but direct stimulation with NGF protein significantly reduced the in vitro differentiation ability of the cells. NGF stimulation also significantly enhanced the engraftment efficiency of MDSCs transplanted within the dystrophic muscle of mdx mice, resulting in the regeneration of numerous dystrophin-positive muscle fibers. These findings highlight the importance of NGF as a modulatory molecule, the study of which will broaden our understanding of its biologic role in the regeneration and repair of skeletal muscle by musclederived cells.     

Dystrophin delivery in dystrophin-deficient DMDmdx skeletal muscle by isogenic muscle-derived stem cell transplantation

Duchenne's muscular dystrophy (DMD) is a lethal muscle disease caused by a lack of dystrophin expression at the sarcolemma of muscle fibers. We investigated retroviral vector delivery of dystrophin in dystrophin-deficient DMD(mdx) (hereafter referred to as mdx) mice via an ex vivo approach using mdx muscle-derived stem cells (MDSCs). We generated a retrovirus carrying a functional human mini-dystrophin (RetroDys3999) and used it to stably transduce mdx MDSCs obtained by the preplate technique (MD3999). These MD3999 cells expressed dystrophin and continued to express stem cell markers, including CD34 and Sca-1. MD3999 cells injected into mdx mouse skeletal muscle were able to deliver dystrophin. Though a relatively low number of dystrophin-positive myofibers was generated within the gastrocnemius muscle, these fibers persisted for up to 24 weeks postinjection. The injection of cells from additional MDSC/Dys3999 clones into mdx skeletal muscle resulted in varying numbers of dystrophin-positive myofibers, suggesting a differential regenerating capacity among the clones. At 2 and 4 weeks postinjection, the infiltration of CD4- and CD8-positive lymphocytes and a variety of cytokines was detected within the injected site. These data suggest that the transplantation of retrovirally transduced mdx MDSCs can enable persistent dystrophin restoration in mdx skeletal muscle; however, the differential regenerating capacity observed among the MDSC/Dys3999 clones and the postinjection immune response are potential challenges facing this technology.     

NF-κB negatively impacts the myogenic potential of muscle-derived stem cells

Inhibition of the inhibitor of kappa B kinase (IKK)/nuclear factor-kappa B (NF-κB) pathway enhances muscle regeneration in injured and diseased skeletal muscle, but it is unclear exactly how this pathway contributes to the regeneration process. In this study, we examined the role of NF-κB in regulating the proliferation and differentiation of muscle-derived stem cells (MDSCs). MDSCs isolated from the skeletal muscles of p65(+/-) mice (haploinsufficient for the p65 subunit of NF-κB) had enhanced proliferation and myogenic differentiation compared to MDSCs isolated from wild-type (wt) littermates. In addition, selective pharmacological inhibition of IKKβ, an upstream activator of NF-κB, enhanced wt MDSC differentiation into myotubes in vitro. The p65(+/-) MDSCs also displayed a higher muscle regeneration index than wt MDSCs following implantation into adult mice with muscular dystrophy. Additionally, using a muscle injury model, we observed that p65(+/-) MDSC engraftments were associated with reduced inflammation and necrosis. These results suggest that inhibition of the IKK/NF-κB pathway represents an effective approach to improve the myogenic regenerative potential of MDSCs and possibly other adult stem cell populations. Moreover, our results suggest that the improved muscle regeneration observed following inhibition of IKK/NF-κB, is mediated, at least in part, through enhanced stem cell proliferation and myogenic potential.     

兔肌源性干细胞的生物学特性及表型分析

背景：骨髓间质干细胞作为种子细胞具有巨大的分化潜力和优势，但对于再生障碍性贫血或骨髓源性肿瘤等疾病的应用受限。现已发现肌源性干细胞具备与其相似的优越性，已引起相关领域研究者的注意。目的：观察兔肌源性干细胞的生物学特性，并对其进行表型分析。设计、时间和地点：细胞体外观察，于2005-08／2006-03在中山大学附属第二医院医研中心完成。材料：清洁级1．5月龄新西兰大白兔1只，增殖培养基为DMEM—LG＋体积分数0．1胎牛血清＋100gm/L血清，融合培养基为DMEM-LC＋2％胎牛血清。方法：兔麻醉后取大腿肌肉，采用差速贴壁Preplate技术分离培养肌源性干细胞，以Ⅺ胶原酶、dispase蛋白酶及胰蛋白酶分步消化，沉淀用增殖培养基重悬，接种在胶原包被的培养瓶中，该培养瓶为PP1。PP1于37℃、含体积分数为0．05的CO2培养箱中静置过夜，随后将悬液转移到另一个胶原包被的培养瓶，此为PP2。随后同法建立PP3，PP4，PP5，PP6。将PP6接种到6孔板进行融合实验，分为两组：一组使用增殖培养基培养，在汇合度超过50％后继续培养，不传代；另一组使用融合培养基进行培养，汇合度达30％时传代培养。主要观察指标：收集PP1～PP6，采用流式细胞仪、免疫细胞化学及Western Blot法鉴定细胞表型。通过不同汇合度及不同浓度血清培养，检测PP6融合情况。结果：PP6细胞〉80％为desmin^＋，〉70％为Bcl-2^＋，〉95％为CD45，提示为高浓度肌源性干细胞，随着纯化步骤的进行，α-SMA表达逐渐减弱，至高度纯化的PP6时己无α-SMA表达。PP6在高汇合度（〉50％）或低血清（仅含2％血清）培养时，极易融合成肌管或肌细胞链，骨骼肌肌球蛋白呈阳性表达。结论：肌源性干细胞具有高水平表达desmin，Bcl-2，极低水平表达CD45，不表达α-SMA的生物学特性，在高汇合度或低血清培养条件下能够多向分化。     

Regeneration of dystrophin-expressing myocytes in the mdx heart by skeletal muscle stem cells

Cell transplantation holds promise as a potential treatment for cardiac dysfunction. Our group has isolated populations of murine skeletal muscle-derived stem cells (MDSCs) that exhibit stem cell-like properties. Here, we investigated the fate of MDSCs after transplantation into the hearts of dystrophin-deficient mdx mice, which model Duchenne muscular dystrophy (DMD). Transplanted MDSCs generated large grafts consisting primarily of numerous dystrophin-positive myocytes and, to a lesser degree, dystrophin-negative non-myocytes that expressed an endothelial phenotype. Most of the dystrophin-positive myocytes expressed a skeletal muscle phenotype and did not express a cardiac phenotype. However, some donor myocytes, located at the graft-host myocardium border, were observed to express cardiac-specific markers. More than half of these donor cells that exhibited a cardiac phenotype still maintained a skeletal muscle phenotype, demonstrating a hybrid state. Sex-mismatched donors and hosts revealed that many donor-derived cells that acquired a cardiac phenotype did so through fusion with host cardiomyocytes. Connexin43 gap junctions were not expressed by donor-derived myocytes in the graft. Scar tissue formation in the border region may inhibit the fusion and gap junction connections between donor and host cells. This study demonstrates that MDSC transplantation warrants further investigation as a potential therapy for cardiac dysfunction in DMD.     

诱导人眼轮匝肌来源肌源干细胞向许旺细胞样细胞的分化

背景：肌源干细胞的优越性引导学者们尝试从人眼轮匝肌中分离该细胞,同时进行许旺细胞方向的诱导分化,为周围神经的修复提供新的种子细胞来源。目的：诱导人肌源干细胞向具有许旺细胞特性的细胞分化。方法：①收集重睑成形术中切除的上睑眼轮匝肌,经酶消化和细胞筛过滤,贴壁培养分离人肌源干细胞,予细胞特异标记物以免疫组织化学染色。②取大鼠坐骨神经分离培养许旺细胞,收集许旺细胞条件培养液。③将人肌源干细胞与许旺细胞条件培养液共培养,观察转化细胞的形态和免疫组织化学染色的变化。结果与结论：①原代培养4周时可见人肌源干细胞,与传代培养之人肌源干细胞同样呈现明显的小圆形形态,折光性强,少量细胞呈现短梭形。所有人肌源干细胞表现为 Desmin 阳性,Sca-1 染色阳性。②分离培养大鼠坐骨神经来源许旺细胞S100染色阳性率为（97.4±0.7）%。③经与许旺细胞条件培养液共培养,人肌源干细胞分化后细胞表达许旺细胞特异标记物S100,GFAP和p75。结果提示分离获得人肌源干细胞与许旺细胞条件培养液共培养,可以诱导人肌源干细胞表达许旺细胞特异标记物,初步证实了人肌源干细胞可分化为许旺细胞样细胞。