人羊膜间充质干细胞在大鼠受损肝组织中分化为肝细胞

背景：羊膜间充质干细胞在体外适当的诱导条件下可分化为肝细胞样细胞,而在受损肝脏原位是否可分化为肝细胞值得探讨。目的：观察人羊膜间充质干细胞在大鼠肝损伤原位植活及分化情况。方法：采用胰酶-胶原酶二酶消化法从羊膜组织中分离人羊膜间充质干细胞。采用腹腔注射D-氨基半乳糖建立大鼠肝损伤模型,随机分为2组,人羊膜间充质干细胞移植组造模后注射L-DMEM悬浮的人羊膜间充质干细胞悬液,对照组注射等量L-DMEM。结果与结论：①FCM分析结果显示,所分离的人羊膜间充质干细胞表达CD29、CD44和CD166;免疫荧光染色显示人羊膜间充质干细胞表达波形蛋白,不表达CK19。②与对照组比较,人羊膜间充质干细胞移植后肝病理无明显差异,均呈急性肝坏死病理改变。③免疫荧光双染色结果显示,人羊膜间充质干细胞移植后1周主要定植于肝小叶且表达CK19,至2周表达CK18,至3周表达Alb。结果表明,人羊膜间充质干细胞在大鼠受损肝组织中能被植活,且可分化为肝细胞,提示人羊膜间充质干细胞移植在临床肝病的治疗方面可能具有潜在应用价值。     

人胚胎骨髓间充质干细胞大鼠脾脏移植后向肝脏的迁移与分化

目的:研究人胚胎骨髓间充质干细胞在大鼠体内移植后向肝脏迁移和在肝内的分化.方法:将人胚胎骨髓间充质干细胞移植到肝损伤合并自身肝细胞再生抑制大鼠的脾脏,术后分时段取肝脏进行免疫组化染色,了解人白蛋白(ALB)、人角蛋白8(CK8)、CK18、CK19的表达情况.结果:人胚胎骨髓间充质干细胞移植后10 d大鼠肝脏可见人CK8、CK18、CK19阳性细胞,移植后15 d大鼠肝脏组织内可见人ALB阳性细胞.移植后90 d仍有阳性细胞检出.结论:人胚胎骨髓间充质干细胞大鼠脾脏移植后能够向肝脏迁移并分化为人肝细胞.     

肝硬化患者骨髓间充质干细胞诱导分化为肝样细胞的实验

目的:探讨肝硬化患者骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导分化,为患者自体骨髓间充质干细胞移植修复肝损伤提供实验依据。方法:实验于2005-05/06在解放军北京军区总医院肝病中心完成。骨髓来自北京军区总医院肝病中心一例肝硬化患者,应用Ficoll分离液分离培养其骨髓间充质干细胞,应用人肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞进行定向诱导分化,采用倒置显微镜形态观察、反转录聚合酶链反应及免疫组织化学染色检测诱导前后不同阶段骨髓间充质干细胞中白蛋白和角蛋白18核糖核酸和蛋白的表达,通过细胞形态及其白蛋白和角蛋白18的表达等指标确定骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化。结果:①经Ficoll分离液分离得到的人骨髓间充质干细胞体外培养20d左右细胞生长达80%～90%汇合,其形态呈较均一的长梭形。②人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导培养3周后,诱导组中出现圆形细胞,呈克隆样生长。③人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导2周时,表达少量白蛋白核糖核酸,于诱导3周时可见白蛋白核糖核酸的表达明显增多。④应用肝细胞生长因子诱导3周后人骨髓间充质干细胞胞浆中白蛋白及角蛋白18染色均呈阳性。结论:肝硬化患者骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子诱导下能定向分化为肝样细胞。     

小鼠再生肝浸出液体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化的研究

目的应用小鼠再生肝浸出液体外诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞样分化。方法利用2／3肝部分切除术后36h小鼠再生肝组织浸出液定向诱导小鼠骨髓间充质干细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态，应用免疫荧光法鉴定细胞性质。结果骨髓间充质干细胞经小鼠再生肝浸出液诱导7d后，呈肝细胞样圆形，1～2周后免疫荧光染色可见细胞表达肝细胞标记物CK8、CK18和清蛋白。结论小鼠再生肝浸出液可诱导骨髓间充质干细胞向肝细胞方向分化。     

肝硬化患者骨髓间充质干细胞诱导分化为肝样细胞的实验

目的：探讨肝硬化患者骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导分化，为患者自体骨髓间充质干细胞移植修复肝损伤提供实验依据。方法：实验于2005-05／06在解放军北京军区总医院肝病中心完成。骨髓来自北京军区总医院肝病中心一例肝硬化患者，应用Ficoll分离液分离培养其骨髓间充质于细胞，应用人肝细胞生长因子对骨髓间充质干细胞进行定向诱导分化，采用倒置显微镜形态观察、反转录聚合酶链反应及免疫组织化学染色检测诱导前后不同阶段骨髓间充质干细胞中自蛋白和角蛋白18核糖核酸和蛋白的表达，通过细胞形态及其白蛋白和角蛋白18的表达等指标确定骨髓间充质干细胞向肝样细胞的分化。结果：①经Ficoll分离液分离得到的人骨髓间充质干细胞体外培养20d左右细胞生长达80％～90％汇合，其形态呈较均一的长梭形。②人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导培养3周后，诱导组中出现圆形细胞，呈克隆样生长。③人骨髓间充质干细胞经肝细胞生长因子诱导2周时，表达少量白蛋白核糖核酸，于诱导3周时可见白蛋白．核糖核酸的表达明显增多。④应用肝细胞生长因子诱导3周后人骨髓间充质干细胞胞浆中自蛋白及角蛋白18染色均呈阳性。结论：肝硬化患者骨髓间充质干细胞在肝细胞生长因子诱导下能定向分化为肝样细胞。     

人类脐血间充质干细胞在急性肝坏死大鼠体内分化潜能的实验研究

目的探索人类脐血间充质干细胞在急性肝坏死大鼠体内肝样细胞自主分化的潜能。方法体外分离培养人类脐血间充质干细胞。CC l4橄榄油溶液腹腔注射SD大鼠建立急性肝坏死大鼠模型。造模24 h后肝脏局部注射移植人类脐血间充质干细胞给急性肝坏死大鼠模型,造模后1周、2周和4周分别处死6只模型鼠,取肝脏切片做免疫组织化学检测人类特异性ALB、AFP、HepPar的表达,实时荧光RT-PCR检测人类特异性ALB、AFP、CK19、CK18的表达,测序扩增产物。结果体外分离培养的脐血来源细胞符合人类脐血间充质干细胞的生物学特性。处死移植模型鼠,肝脏免疫组织化学检测显示:人类特异性ALB、AFP、HepPar在接受移植的模型鼠体内呈阳性表达;实时荧光RT-PCR检测显示:人类特异性ALB、AFP、CK19、CK18在接受移植的模型鼠体内呈阳性表达,扩增产物序列与GENEBANK对应序列一致。结论无外部诱导干预,人类脐血间充质干细胞在急性肝坏死大鼠体内已具有肝样细胞自主分化潜能。     

人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景:国内外的研究多采用细胞因子诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞,而较少用人羊膜与骨髓间充质干细胞共培养的方法进行诱导分化。目的:观察人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的可行性。方法:体外分离培养、扩增人骨髓间充质干细胞,选用第5代人骨髓间充质干细胞与健康人羊膜共培养12d进行诱导分化。结果与结论:人骨髓间充质干细胞贴壁生长,呈长梭形,流式细胞仪检测表达CD29,CD44的阳性细胞数分别为96.6%,94.6%。人羊膜与人骨髓间充质干细胞共培养12d,人骨髓间充质干细胞渐变为扁平的表皮样细胞,免疫组化染色显示CK19散在阳性,广谱CK为弥漫阳性。说明人羊膜可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。     

人羊膜间充质干细胞联合神经生长因子及纤维蛋白胶移植治疗大鼠脑损伤

背景:以往对间充质干细胞分化的报道多为体外培养,甚少涉及宿主体内间充质干细胞的分化及辅助因子对其分化的影响。目的:探讨人羊膜间充质干细胞移植对脑损伤大鼠行为学和空间学习记忆能力的影响,以及神经生长因子、纤维蛋白胶在人羊膜间充质干细胞移植中的作用。设计、时间及地点:细胞学体内对照观察,于2006-07/2007-01在郑州大学医学院完成。材料:正常足月剖腹产胎儿的胎盘由郑州大学第一附属医院妇产科提供。Wistar大鼠90只,随机分为5组:假手术组、模型对照组、细胞移植组、细胞 神经生长因子组、细胞 纤维蛋白胶组,18只/组。方法:无菌条件下钝性分离胎盘脐带面的羊膜,经胰酶消化制成单细胞悬液,贴壁法纯化扩增,传至第3代的人羊膜间充质干细胞备用。假手术组只开颅钻孔不进行硬膜外撞击,其余4组大鼠均采用自由落体硬膜外撞击法建立脑损伤模型。造模1d后,模型对照组在损伤区分点注射生理盐水40μL;细胞移植组注射含1×107个人羊膜间充质干细胞的等量生理盐水;细胞 神经生长因子组在细胞移植组基础上于造模后连续2周每日腹腔注射0.5μg神经生长因子;细胞 纤维蛋白胶组注射人羊膜间充质干细胞与纤维蛋白胶混合液40μL;假手术组不行细胞移植。主要观察指标:行为学评分,Morris水迷宫检测潜伏期,脑组织切片免疫组化染色检测神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的表达。结果:移植后7d,与模型对照组比较,细胞移植组、细胞 神经生长因子组、细胞 纤维蛋白胶组行为学评分均明显升高,但细胞移植组升高幅度明显低于后2组(F=155.322,P<0.05)。移植后3周,与模型对照组比较,细胞移植组、细胞 神经生长因子组、细胞 纤维蛋白胶组潜伏期均明显缩短,但细胞移植组缩短幅度明显小于后2组(F=22.678,P<0.05)。移植后4周,人羊膜间充质干细胞能够在大鼠损伤脑组织内分化,与神经生长因子、纤维蛋白胶混合移植可提高神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白的阳性表达率(F=705.406,F=424.884,P<0.05)。结论:人羊膜间充质干细胞可改善脑损伤大鼠行为能力及空间学习记忆能力,分化后能表达神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白,神经生长因子与纤维蛋白胶均可增强细胞移植治疗效果。     

骨髓间充质干细胞移植在大鼠急性肝损伤组织中的定植能力

背景:目前对于移植后的骨髓间充质干细胞在肝组织中的分化途径以及能够在多大程度上修复损伤的肝细胞等问题,尚未达成统一共识.目的:观察经尾静脉移植的骨髓间充质干细胞在急性肝损伤大鼠肝组织中的定植分化情况.设计、时间及地点:细胞学体内对照观察,于2007-12/2008-06在兰州大学中心实验室地点完成.材料:清洁级6～8周龄雄性SD大鼠47只,取5只用于制各骨髓间充质干细胞,剩余42只随机分为3组:肝正常细胞移植组15只、肝损伤细胞移植组14只、肝损伤盐水对照组13只.方法:肝损伤细胞移植组、肝损伤盐水对照组大鼠通过腹腔注射D-氨基半乳糖建立急性肝损伤模型.造模后24 h,肝损伤细胞移植组、肝正常细胞移植组经尾静脉注入BrdU标记的第3代大鼠骨髓间充质干细胞悬液1 mL,含(1.5～2.0)×106个细胞:肝损伤盐水对照组大鼠同法注入等量生理盐水.主要观察指标:移植后肝功能恢复情况,肝脏免疫组织化学检测结果.结果:与造模后24 h比较,移植后2,3周肝正常细胞移植组、肝损伤盐水对照组血清谷丙转氨酶活性无明显变化(P>0.05);肝损伤细胞移植组血清谷丙转氨酶活性明显降低(P＜0.05),肝功能恢复较好.与肝正常细胞移植组比较,肝损伤细胞移植组Brdu+细胞数明显增多(P＜0.01),多分布在汇管区及中央静脉周围,但随着时间延长BrdU+细胞数逐渐减少.结论:经尾静脉移植的骨髓间充质干细胞可促进急性肝损伤大鼠的肝功能恢复,并能够在受损肝脏及正常肝脏中定植分化,且定植与分化的程度可能与肝脏损伤程度有关.     

尾静脉移植羊膜间充质干细胞治疗大鼠脑缺血再灌注损伤

背景:羊膜间充质干细胞是一种理想的再生医学领域的种子细胞来源。目的:探讨尾静脉移植羊膜间充质干细胞对脑缺血损伤的作用。方法:线栓法制备大鼠大脑中动脉梗死模型,缺血2h后进行再灌注。造模后24h通过尾静脉移植1.0×105个人羊膜间充质干细胞,于造模后2,4周完成神经功能评分后取材。以未移植的模型大鼠为对照。结果与结论:脑损伤后,大鼠出现神经功能评分明显增高,羊膜间充质干细胞移植1周,大鼠的神经功能评分显著降低(P<0.05),移植2,4周时,神经功能进一步改善。免疫荧光染色显示,移植羊膜间充质干细胞的大鼠脑组织中可见较多发绿色荧光的BrdU阳性细胞,主要位于缺血区周围、皮质下和侧脑室。说明尾静脉移植羊膜间充质干细胞可迁移至大鼠脑缺血区,改善大鼠的神经功能。     

绵羊羊膜上皮细胞分离培养及鉴定

背景：目前有研究发现人羊膜和大鼠羊膜分离消化培养后,可成功获得具有干细胞特性的人羊膜上皮细胞和鼠羊膜上皮细胞,在体外一些外源因子作用下具有向三胚层细胞分化的潜能。目的：获取绵羊羊膜上皮细胞,并对其干细胞特性进行鉴定。方法：采用机械方法剥离绵羊羊膜组织,运用低速旋转TrypLE（胰酶替代物）消化法对绵羊羊膜进行分离培养获得绵羊羊膜上皮细胞。结果与结论：细胞免疫荧光检测结果表明绵羊羊膜上皮细胞表达Oct-4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等胚胎干细胞标记蛋白;RT-PCR技术鉴定结果显示绵羊羊膜上皮细胞的Oct-4、Sox-2、Rex-1全能性相关基因表达,而Nanog基因不表达。检测结果提示实验成功获得具有干细胞特性的绵羊羊膜上皮细胞。     

人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景：国内外的研究多采用细胞因子诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞,而较少用人羊膜与骨髓间充质干细胞共培养的方法进行诱导分化。目的：观察人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的可行性。方法：体外分离培养、扩增人骨髓间充质干细胞,选用第5代人骨髓间充质干细胞与健康人羊膜共培养12d进行诱导分化。结果与结论：人骨髓间充质干细胞贴壁生长,呈长梭形,流式细胞仪检测表达CD29,CD44的阳性细胞数分别为96.6%,94.6%。人羊膜与人骨髓间充质干细胞共培养12d,人骨髓间充质干细胞渐变为扁平的表皮样细胞,免疫组化染色显示CK19散在阳性,广谱CK为弥漫阳性。说明人羊膜可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。     

成体干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究现状

成体干细胞存在于已分化的组织器官中,具有明显的可塑性,能跨系统、跨胚层分化,在组织工程和损伤修复领域具有重要的应用价值.在血管组织工程研究领域中,成体干细胞作为种子细胞得到越来越广泛而深入的研究.目前研究表明,具有向血管内皮细胞分化的成体干细胞主要有骨髓间充质干细胞、造血干细胞、脂肪来源的干细胞以及羊膜来源的干细胞等基于此,就成体干细胞作为种子细胞在血管组织工程领域研究现状进行综述.     

羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞构建组织工程皮肤

背景：由于人胎盘来源的间充质干细胞具有多方面的优点,近年来已成为干细胞研究的热点。目的：分析鉴定羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞的生物学特性,探讨其作为皮肤种子细胞在三维气液培养构建组织工程皮肤中的应用情况。方法：用胰酶胶原酶多步消化法获取羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞,通过流式细胞术、反转录-聚合酶链反应和免疫荧光染色技术,鉴定两种细胞的表面分子标记、干细胞特性、与皮肤角质形成细胞的相似性,并利用两种细胞为种子细胞以鼠Ⅰ型胶原为基质进行三维气液培养。结果与结论：①流式细胞术检测体外培养羊膜间充质干细胞和羊膜上皮细胞均高表达CD90、CD73、CDl05,不表达造血干细胞标志CD34以及MHC-Ⅱ类分子HLA-DR。②反转录聚合酶链反应检测到羊膜间充质干细胞表达干细胞特性基因CMCY和NANOG,羊膜上皮细胞表达干细胞特性基因CMCY和KLF4,两种细胞均有干细胞特性。③反转录-聚合酶链反应检测羊膜间充质干细胞表达皮肤角质形成细胞特性基因K19、β1-integrin、K8,羊膜上皮细胞表达K19、β1-integrin、K5、K8,免疫荧光染色见羊膜上皮细胞表达与角质形成细胞增殖相关的的特性蛋白K14,说明羊膜上皮细胞与皮肤角质形成细胞更具相似性,在特定条件下更易于分化为皮肤角质形成细胞。④利用两种细胞成功构建组织工程皮肤,苏木精-伊红染色切片显示其具有一定的皮肤结构,且羊膜上皮细胞发生了初步分化。以上结果说明羊膜间充质干细胞与羊膜上皮细胞通过三维培养构建人皮肤组织是可行的。     

不同途径移植羊膜上皮细胞在肝脏的定居

背景:细胞移植对肝脏疾病具有一定的疗效,与肝脏移植相比有其自身的优点,但有诸多问题尚待解决。目的:探讨不同途径移植的人羊膜上皮细胞在肝脏内定居情况。方法:从剖腹产后的人胎盘羊膜中分离人羊膜上皮细胞,PKH26荧光标记后计数1×107细胞通过大鼠腹腔、门静脉、尾静脉及肝脏内直接注入方式移植入大鼠体内。结果与结论:门静脉、尾静脉及肝脏直接注入途径移植的细胞均在肝脏内定居,但移植细胞数过量时造成局部肝组织的缺血坏死等不良反应。腹腔途径移植入体内的细胞未转移肝脏内。通过门静脉移植入体内的人羊膜上皮细胞在大鼠肝脏内维持存活至少16d。移植细胞过量时,导致肝脏血管堵塞及坏死。证明人羊膜上皮细胞至少在大鼠肝脏中存活2周,提示低免疫原性的羊膜来源细胞可成为肝脏病治疗的候选细胞之一。     

自体骨髓单个核细胞肝内移植治疗失代偿期肝硬化

背景:大量研究发现,骨髓间充质干细胞是肝干细胞的主要肝外来源,骨髓间充质干细胞在特定环境下可分化为肝组织和肝细胞从而参加肝脏的修复与重建.目的:观察自体骨髓单个核细胞移植治疗失代偿期肝硬化的效果及安全性.方法:选择肝硬化失代偿期患者20例,在无菌条件下由髂后上棘抽取骨髓200 mL,在体外分离纯化骨髓单个核细胞并制成10 mL细胞悬液,经肝动脉将细胞悬液移植入肝脏,分别在移植后第2、4、8、12周复查肝脏功能,观察实验室指标,临床症状及不良反应.结果与结论:移植后2周内所有血清学指标均无显著改变,移植后4周白蛋白由(27.05±5.23) g/L升到(30.02±5.02) g/L,纤维蛋白原由(1.55±0.53) g/L升到(2.55±0.53) g/L,凝血酶原时间由(24.05±5.23) s降到 (17.05±5.13) s,胆碱酯酶和甲胎蛋白也有不同程度上升,氨基转移酶、总胆红素水平在移植前后无显著性变化.单个核细胞移植后食欲改善、体力好转10例,腹胀减轻6例,腹水减少7例,下肢浮肿减轻4例.全部患者在移植中未发生严重并发症,移植近期无不良反应出现.     

自体骨髓干细胞治疗肝硬化基础研究与临床应用现状

背景:活体肝移植仍面临很多问题:如供体的匮乏、移植后的免疫排异反应及其高额的费用等,因此使其在临床上的开展受到限制.目的:说明自体骨髓干细胞移植可以分化成熟肝细胞而替代受损的肝脏组织发挥功能,从而改善患者症状,提高患者生活质量.方法:利用计算机在PubMed、CNKI、万方数据库和维普数据库中检索2000-01/2010-12关于自体骨髓干细胞移植相关文章,在标题和摘要中用"骨髓干细胞;自体骨髓干细胞移植;肝硬化"或"Bone marrow stem cell,autologous bone marrow stem cell,hepatic cirrhosis"为检索词进行检索.选择与骨髓干细胞移植相关的文章内容,同一领域文献选择近期发表或发表在权威杂志文章.初检得到235篇文献,根据纳入标准选择20篇文章进行综述.结果与结论:通过对自体骨髓干细胞移植从基础研究及临床研究方面的最新进展的了解,说明自体骨髓干细胞移植在对肝硬化的治疗方面前景广阔.     

Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells

We have derived from normal human, mouse, and rat postnatal bone marrow primitive, multipotent adult progenitor cells (MAPCs) that can differentiate into most mesodermal cells and neuroectodermal cells in vitro and into all embryonic lineages in vivo. Here, we show that MAPCs can also differentiate into hepatocyte-like cells in vitro. Human, mouse, and rat MAPCs, cultured on Matrigel with FGF-4 and HGF, differentiated into epithelioid cells that expressed hepatocyte nuclear factor-3beta (HNF-3beta), GATA4, cytokeratin 19 (CK19), transthyretin, and alpha-fetoprotein by day 7, and expressed CK18, HNF-4, and HNF-1alpha on days 14-28. Virtually all human, as well as a majority of rodent cells stained positive for albumin and CK18 on day 21; 5% (rodent) to 25% (human) cells were binucleated by day 21. These cells also acquired functional characteristics of hepatocytes: they secreted urea and albumin, had phenobarbital-inducible cytochrome p450, could take up LDL, and stored glycogen. MAPCs, which can be expanded in vitro and maintained in an undifferentiated state for more than 100 population doublings, can thus differentiate into cells with morphological, phenotypic, and functional characteristics of hepatocytes. MAPCs may therefore be an ideal cell for in vivo therapies for liver disorders or for use in bioartificial liver devices.