体外培养人骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化及表皮细胞角蛋白的表达

背景：动物实验已经证实骨髓间充质干细胞体外诱导可分化为表皮细胞。目的：观察体外培养条件下人骨髓间充质干细胞向表皮细胞的分化及表皮细胞角蛋白表达。方法：采用Ficoll-Paque密度梯度离心法提取人胚胎骨髓间充质干细胞,以免疫细胞化学及流式细胞仪测定细胞表面CD33、CD34标记物进行鉴定。取第3代骨髓间充质干细胞以30%条件培养基诱导其向表皮细胞分化,免疫细胞化学染色观察诱导后细胞形态与细胞角蛋白水平变化。结果与结论：采用密度梯度离心法从人胚胎骨髓中分离培养得到细胞成分均一的骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞经体外诱导后,出现细胞角蛋白19表达阳性细胞,说明骨髓间充质干细胞在体外诱导后可能发生向表皮细胞分化。     

人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景:国内外的研究多采用细胞因子诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞,而较少用人羊膜与骨髓间充质干细胞共培养的方法进行诱导分化。目的:观察人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的可行性。方法:体外分离培养、扩增人骨髓间充质干细胞,选用第5代人骨髓间充质干细胞与健康人羊膜共培养12d进行诱导分化。结果与结论:人骨髓间充质干细胞贴壁生长,呈长梭形,流式细胞仪检测表达CD29,CD44的阳性细胞数分别为96.6%,94.6%。人羊膜与人骨髓间充质干细胞共培养12d,人骨髓间充质干细胞渐变为扁平的表皮样细胞,免疫组化染色显示CK19散在阳性,广谱CK为弥漫阳性。说明人羊膜可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。     

人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景：国内外的研究多采用细胞因子诱导骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞,而较少用人羊膜与骨髓间充质干细胞共培养的方法进行诱导分化。目的：观察人羊膜诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的可行性。方法：体外分离培养、扩增人骨髓间充质干细胞,选用第5代人骨髓间充质干细胞与健康人羊膜共培养12d进行诱导分化。结果与结论：人骨髓间充质干细胞贴壁生长,呈长梭形,流式细胞仪检测表达CD29,CD44的阳性细胞数分别为96.6%,94.6%。人羊膜与人骨髓间充质干细胞共培养12d,人骨髓间充质干细胞渐变为扁平的表皮样细胞,免疫组化染色显示CK19散在阳性,广谱CK为弥漫阳性。说明人羊膜可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞。     

骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的研究进展

骨髓间充质干细胞是一类非造血性的细胞,在不同诱导条件下可分化为表皮细胞、软骨细胞、骨细胞、神经元细胞、类髓核细胞等。因其来源广泛,具有较高的分化再造潜能,无特异抗原标记,具有归巢潜能,使其具有良好的应用前景。骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化在创面修复的实验研究与临床应用上均有积极意义。本文就骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的研究现状、分化条件、机制与意义等方面作一综述。     

体外诱导胎盘间充质干细胞向表皮细胞的分化

背景:以往研究证明胎盘间充质干细胞经诱导可以向骨、软骨、肌肉、脂肪等间充质细胞分化。目的:探讨体外诱导胎盘间充质干细胞分化为表皮细胞的可行性。方法:分离培养胎盘间充质干细胞,流式细胞仪鉴定其表面抗原,用含体积分数为2%胎牛血清以及20μg/L表皮生长因条件培养基诱导,诱导后细胞通过表皮细胞标志物CK19以及CK10染色鉴定。结果与结论:胎盘间充质干细胞表面抗原CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45、CD106以及HLA-DR阴性。诱后细胞形态明显改变,表皮细胞标志物CK19以及CK10免疫荧光染色阳性,提示胎盘间充质干细胞在体外具有分化为皮细胞的能力,可以作为皮肤组织工程和干细胞研究的一种有效来源。     

黄芪诱导人骨髓间充质干细胞向表皮样细胞的分化

背景:课题组以往的研究证实黄芪对体外培养的人表皮体外扩展生长和表皮干细胞增殖均具有促进作用,但它对人骨髓间充质干细胞的体外作用如何特别是是否具有诱导骨髓间充质干细胞向表皮样细胞分化的效应,仍不清楚.目的:观察黄芪体外定向诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的可行性.设计、时间及地点;细胞学体外对比观察,于2006-09/2008-06在南昌大学第一附属医院完成.材料:骨髓来源于临床骨髓穿刺检查正常患者,无血液系统疾病和家族遗传病史.方法:用密度梯度离心结合贴壁法分离纯化培养人骨髓间充质干细胞,以含黄芪、胎牛血清、角质细胞无血清培养基组成的诱导培养液进行体外培养,以不含黄芪的上述培养液作为对照.主要观察指标:倒置显微镜下观察细胞形态学变化,免疫细胞化学染色法检测D63和广谱细胞角蛋白的表达.结果:经黄芪诱导后部分细胞由长梭形转变为扁园形,呈表皮样细胞形态特征;免疫细胞化学染色显示部分诱导细胞p63、广谱细胞角蛋白表达均呈阳性.结论:黄芪可诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞.     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

背景：常规诱导方法诱导的细胞生长缓慢，数量少，使用生长因子可加快诱导速度，但生长因子价格昂贵限制了它的使用。目的：验证未加生长因子的诱导液体外诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的效率。设计、时间及地点：对比细胞学观察，于2007-07／2008-02在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。材料：骨髓来源自体干细胞移植治疗糖尿病患者，均征得患者同意。方法：采用密度梯度法分离培养骨髓间充质干细胞，应用0．1μmol／L地塞米松、10mmol／L β-甘油磷酸钠、50μmol／L维生素C对第3代骨髓间充质于细胞进行诱导，同时设立对照组，不加入诱导剂。主要观察指标：相差强微镜观察骨髓间充质干细胞的形态变化，诱导后经碱性磷酸酶染色和钙结节染色观察细胞形态变化。结果：第3代骨髓间充质干细胞在相差显做镜下呈均匀分布生长，形态为长梭形。经成骨诱导7d后培养细胞逐渐汇合呈铺路石状，随着诱导时间的延艮，局部细胞呈重叠牛长，间充质逐渐堆积、间充质中矿盐沉积，形成多个结节，并逐渐融合。培养14d可形成倒置显做镜下可见的褐色点状矿化结节中心；培养21d形成小片状矿化结节，von Kossa法测定可见钙结节争黑色，碱性磷酸酶活性测定为阳性。结论：骨髓间充质干细胞易诱导分化为成骨细胞，且增殖快，成骨能力强。     

体外诱导人骨髓间充质干细胞向造血细胞分化的研究

目的探讨体外诱导人骨髓间充质干细胞（hMSC）向造血细胞分化的可行性及分化条件。方法首先建立hMSC的分离培养扩增体系，制备小鼠胎肝基质细胞条件培养液（FLSC-CM），将hMSC接种在分别含FLSC-CM和IL-6、SCF组合的培养体系中，通过形态学、直接免疫荧光染色检测法、粒-单／巨噬系集落形成细胞培养（CFU-GM）对分化细胞进行鉴定。结果hMSC经FISC—CM诱导培养9天后，产生较多的悬浮细胞，悬浮细胞瑞士染色后形态类似于单核或小淋巴细胞，表达人CD34和人CD45表面抗原。且能够形成造血祖细胞集落（CFU-GM）。结论FLSC-CM可诱导hMSC分化为具有造血干／祖细胞特性的前体细胞。     

人骨髓间充质干细胞的分离和体外培养

目的：分离培养人骨髓间充质干细胞，研究其在体外生长增殖的生物特性。方法：冲洗手术弃骨骨髓，获取骨髓闯充质干细胞进行培养，倒置相差显微镜观察细胞生长情况，绘制生长曲线，免疫细胞化学法鉴定细胞表面抗原，进行染色体核型分析。观察冷冻保存细胞复苏后的生长状况。在地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的作用下，进行成骨诱导分化。结果：原代和传代培养的细胞呈现梭形外观，具有较强的生长增殖能力；细胞CD44，CD54抗原表达阳性，CD34表达阴性。进行染色体核型分析表明是正常的人二倍体细胞。复苏细胞生物学特性无明显改变。分化细胞表现成骨细胞特性，合成碱性磷酸酶能力增强，矿化结节逐渐出现。结论：建立分离培养人骨髓间充质干细胞和研究其体外培养生物特性的方法，为通过组织工程学方法修复组织损伤奠定基础。     

细胞密度与骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:细胞种植密度是影响干细胞分化的因素之一,对于细胞种植密度在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用尚缺乏深入研究.目的:观察细胞种植密度对骨髓间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的影响.方法:采用贴壁培养法分离大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代后将其按2×102,2×103,4×103,8×103,2×104,4×104/cm2种植于六孔板,每组均加入碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子+维甲酸诱导向神经元样细胞分化,并通过免疫组织化学染色鉴定,计算每组细胞出现神经元样细胞的比例,比较各组的分化率.结果与结论:各组骨髓间充质干细胞加入诱导剂后均出现神经元样细胞,Nestin、NSE、GFAP细胞化学染色呈阳性.不同种植密度组出现神经元样细胞比例不同,以8×103/cm2组神经元样细胞比例最高,且神经元样存活时间最长,达7 d.结果说明骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化与细胞接种密度有关,过高或过低细胞密度均不利分化.     

Mesenchymal stem cells from rat olfactory bulbs can differentiate into cells with cardiomyocyte characteristics

Mesenchymal stromal/stem cells (MSCs) are widely distributed in different tissues such as bone marrow, adipose tissues, peripheral blood, umbilical cord and amnionic fluid. Recently, MSC‐like cells were also found to exist in rat olfactory bulb and are capable of inducing differentiation into mesenchymal lineages – osteocytes, chondrocytes and adipocytes. However, whether these cells can differentiate into myocardial cells is not known. In this study, we examined whether olfactory bulb‐derived MSCs could differentiate into myocardial cells in vitro. Fibroblast‐like cells isolated from the olfactory bulb of neonatal rats were grown under four conditions: no treatment; in the presence of growth factors (neuregulin‐1, bFGF and forskolin); co‐cultured with cardiomyocytes; and co‐cultured with cardiomyocytes plus neuregulin‐1, bFGF and forskolin. Cell differentiation into myocardial cells was monitored by RT–PCR, light microscopy immunofluorescence, western blot analysis and contractile response to pharmacological treatments. The isolated olfactory bulb‐derived fibroblast‐like cells expressed CD29, CD44, CD90, CD105, CD166 but not CD34 and CD45, consistent with the characteristics of MSCs. Long cylindical cells that spontaneously contracted were only observed following 7 days of co‐culture of MSCs with rat cardiomyocytes plus neuregulin‐1, bFGF and forskolin. RT–PCR and western blot analysis indicated that the cylindrical cells expressed myocardial markers, such as Nkx2.5, GATA4, sarcomeric α‐actinin, cardiac troponin I, cardiac myosin heavy chain, atrial natriuretic peptide and connexin 43. They also contained sarcomeres and gap junction and were sensitive to pharmacological treatments (adrenal and cholinergic agonists and antagonists). These findings indicate that rat olfactory bulb‐derived fibroblast‐like cells with MSC characteristics can differentiate into myocardial‐like cells. Copyright © 2013 John Wiley & Sons, Ltd.     

Fetal human hematopoietic stem cells can differentiate sequentially into neural stem cells and then astrocytes in vitro

In some rodent models, there is evidence that hematopoietic stem cells (HSC) can differentiate into neural cells. However, it is not known whether humans share this potential, and, if so, what conditions are sufficient for this transdifferentiation to occur. We addressed this question by assessing the ability of fetal human liver CD34(+)/CD133(+)/CD3(-) hematopoietic stem cells to generate neural cells and astrocytes in culture. We cultured fetal liver-derived hematopoietic stem cells in human astrocyte culture-conditioned medium or using a method wherein growing human astrocytes were separated from cultured, nonadherent hematopoietic stem cells by a semipermeable membrane in a double-chamber co-culture system. Hematopoietic stem cell cultures were probed for neural progenitor cell marker expression (nestin and bone morphogenic protein-2 [BMP-2]) during growth in both culture conditions. RT-PCR, western blotting, and immunocytochemistry assays showed that cells cultured in either condition expressed nestin mRNA and protein and BMP-2 mRNA. HSC similarly cultured in nonconditioned medium or in the absence of astrocytes did not express either marker. Cells expressing these neural markers were transferred and cultured on poly-D-lysine-coated dishes with nonconditioned growth medium for further study. Immunocytochemistry demonstrated that these cells differentiated into astrocytes after 8 days in culture as indicated by their morphology and expression of the astrocytic markers glial fibrillary acidic protein (GFAP) and S100, as well as by their rate of proliferation, which was identical to that of freshly isolated fetal brain astrocytes. These findings demonstrate that neural precursor gene expression can be induced when human hematopoietic stem cells are exposed to a suitable microenvironment. Furthermore, the neural stem cells generated in this environment can then differentiate into astrocytes. Therefore, human hematopoietic stem cells may be an alternative resource for generation of neural stem cells for therapy of central nervous system defects resulting from disease or trauma.     

胚胎干细胞体外定向诱导分化为胰岛细胞的相关研究

目的:了解胚胎干细胞作为种子细胞治疗糖尿病的应用前景以及诱导分化为胰岛细胞的相关研究概况。资料来源:应用计算机检索NCBI Pubmed数据库1980-01/2006-04关于胚胎干细胞诱导分化为胰岛细胞研究的文章,检索词为"embryonic stem cells,beta cells,insulin secreting cells",并限定文章语言种类为English。同时计算机检索CNKI数据库1980-01/2006-04关于胚胎干细胞定向诱导分化的文章,检索词为"胚胎干细胞,胰岛细胞,胰岛素分泌细胞",并限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:!论据可靠的实验文章。#观点明确、条理清晰、信息量好的综述性文章。$文献主题与本课题相关的文章。排除标准:论据不充分、设计不合理、结论不可靠的实验性文章,观点模糊的综述性文章。资料提炼:共检索到40篇相关文献,30篇文献符合纳入标准,排除的10篇为内容陈旧或重复。符合纳入标准的30篇文献中,分别涉及胚胎干细胞治疗糖尿病的应用前景、胰腺发育过程相关调控机制、应用各种诱导因子和基因方法对胚胎干细胞进行调控的实验方法、对诱导分化的胰岛细胞进行功能检测等内容。资料综合:糖尿病是严重威胁人类健康的疾病之一,胰岛细胞移植是治愈糖尿病的可能方法,但由于胰岛细胞数量有限,不能满足临床需要,人们开始寻找胰岛细胞的可替代资源。胚胎干细胞具有广泛的功能,可以被诱导分化为各种组织细胞,用于各种疾病的治疗,因此胚胎干细胞成为人们研究的首选种子细胞。首先对胚胎干细胞进行培养鉴定,然后通过各种方法对其进行诱导分化,主要有两种分化方案:①可以通过加入各种诱导因子,使其朝人们所期望的方向分化。②利用基因工程技术,将胰腺发育过程中调控其发育的各种基因转入细胞,可将胚胎干细胞定向诱导分化为胰岛细胞,提高了诱导分化的可调控性。除胰岛细胞外人们还对其他细胞进行了相关研究,以期能得到更多的可供利用的资源。结论:胚胎干细胞具有全能性,理论上可以发育为各种组织细胞,人们已经通过各种诱导因子和基因调控方法将其诱导为胰岛细胞,并且证明这种诱导的细胞可以维持糖尿病鼠血糖及体重的稳定,但由于微环境因素影响,要将起大量诱导分化为胰岛细胞仍需要更多的实验研究。     

大鼠羊膜上皮细胞体外诱导可分化为类神经干细胞

背景：以往研究发现修复神经损伤的细胞来源主要有许旺细胞、嗅鞘细胞、神经干细胞、激活的巨噬细胞等,但这些细胞存在着来源困难、有成瘤性、异体排斥等缺点.而羊膜上皮细胞不存在以上缺陷,且具有多向分化潜能,经诱导后可向心肌样细胞、神经干细胞、肝细胞、成骨和软骨细胞等分化.目的：体外培养大鼠羊膜上皮细胞,并诱导其向类神经干细胞方向分化.方法：取妊娠晚期大鼠,采用胰酶消化法获得羊膜上皮细胞,用无血清的神经干细胞条件培养基对细胞进行诱导分化,并用免疫细胞化学法和RT-PCR对诱导前后的细胞相关标志物进行鉴定.结果与结论：形态学观察结果显示,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞胞体回缩,胞核部分折光性增强,出现类似于树突及轴突样结构,这些突起可交织成网状,细胞贴壁牢靠.免疫细胞化学检测结果显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞中巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白荧光强度较强,而特异性胚胎抗原4、波形蛋白荧光强度较弱.RT-PCR检测显示,与诱导前相比,条件培养基诱导后的羊膜上皮细胞的巢蛋白、胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白 mRNA 的表达增强,而平滑肌22α、Sox-2及Nanog mRNA的表达减弱.说明体外诱导的大鼠羊膜上皮细胞可成功分化为类神经干细胞.     

红景天苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

背景：前期实验证明红景天苷能诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞定向分化,但是具体的影响方式尚不清楚。目的：以骨髓间充质干细胞为研究对象,进一步探讨红景天苷诱导其向神经元样细胞定向分化的作用方式和分子机制。方法：选取第2代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞,按照不同的诱导剂分为维甲酸诱导组、红景天苷诱导组和对照组,通过不同的时间点对细胞进行观察。结果与结论：两诱导组细胞不同时间点神经干细胞标志物巢蛋白、神经细胞分化相关的兔抗微管蛋白和神经微管相关蛋白2表达阳性率均高于对照组（P〈0.01）;神经胶质纤维酸性蛋白阳性率维甲酸组显著高于红景天苷组（P〈0.01）。RealTime-PCR结果显示,维甲酸和红景天苷诱导不同时间,两组细胞均有神经细胞相关基因神经元特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2mRNA表达,与诱导时间有关且不完全相同,两组间神经胶质纤维酸性蛋白mRNA的高丰度出现于诱导早期;诱导后两组神经元特异性烯醇化酶蛋白的表达随时间延长显著增加,兔抗微管蛋白表达出现于诱导早期。说明红景天苷能促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化,其诱导效应与维甲酸相似,且向神经元样细胞定向分化方面优于维甲酸。     

体外诱导人脐带间充质干细胞分化为许旺细胞

背景:人脐带Wharton’s Jelly源间充质干细胞避免了伦理的限制,来源丰富,可以作为种子细胞进行组织修复。目的:观察体外诱导脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞向许旺细胞分化的可行性。方法:分离、培养脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞,流式细胞术鉴定细胞表面标志。利用神经细胞培养基、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、维甲酸、血小板源性生长因子等采用两步法将脐带间充质干细胞诱导分化为许旺细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化。利用免疫细胞化学染色法检测巢蛋白、S-100、纤维酸性蛋白的表达,反转录-聚合酶链反应、免疫印记技术检测许旺细胞特异性蛋白产物表达。结果与结论:脐带细胞培养第7天形态发生变化,部分细胞变成梭形。原代细胞培养10d左右可达80%～90%融合,细胞呈梭形。分离培养的细胞表达具有间充质干细胞表面特有标志:CD44(91.4%),CD29(91.3%),CD105(99.2%),不表达CD34(0.2%),CD45(0.9%),CD14(0.6%)。脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞经第一阶段诱导后,细胞由短梭形变成长梭形或纺锤形,并出现聚集现象,由形状规则、表面圆滑的球形细胞团形成。第二阶段诱导后,有长梭形细胞从球形细胞团爬出,96h后细胞形态多为长梭形,伴有多极现象。免疫细胞化学染色结果示:长梭形多极细胞具有许旺细胞特异的纤维酸性蛋白、S100蛋白染色。结果表明脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞可在体外诱导分化为许旺细胞。     

体外诱导人脐带间充质干细胞分化为许旺细胞

背景：人脐带Wharton’s Jelly源间充质干细胞避免了伦理的限制,来源丰富,可以作为种子细胞进行组织修复。目的：观察体外诱导脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞向许旺细胞分化的可行性。方法：分离、培养脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞,流式细胞术鉴定细胞表面标志。利用神经细胞培养基、碱性成纤维生长因子、表皮生长因子、维甲酸、血小板源性生长因子等采用两步法将脐带间充质干细胞诱导分化为许旺细胞,倒置显微镜下观察细胞形态变化。利用免疫细胞化学染色法检测巢蛋白、S-100、纤维酸性蛋白的表达,反转录-聚合酶链反应、免疫印记技术检测许旺细胞特异性蛋白产物表达。结果与结论：脐带细胞培养第7天形态发生变化,部分细胞变成梭形。原代细胞培养10d左右可达80%～90%融合,细胞呈梭形。分离培养的细胞表达具有间充质干细胞表面特有标志：CD44（91.4%）,CD29（91.3%）,CD105（99.2%）,不表达CD34（0.2%）,CD45（0.9%）,CD14（0.6%）。脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞经第一阶段诱导后,细胞由短梭形变成长梭形或纺锤形,并出现聚集现象,由形状规则、表面圆滑的球形细胞团形成。第二阶段诱导后,有长梭形细胞从球形细胞团爬出,96h后细胞形态多为长梭形,伴有多极现象。免疫细胞化学染色结果示：长梭形多极细胞具有许旺细胞特异的纤维酸性蛋白、S100蛋白染色。结果表明脐带Wharton’s Jelly中间充质干细胞可在体外诱导分化为许旺细胞。     

Mesenchymal stem cells

About 40 years ago Friedenstein described stromal cells in the bone marrow that were spindle shaped and proliferate to form colonies. These cells attach to plastic and are able to differentiate under defined in vitro conditions into multiple cell types present in many different tissues, e.g. osteoblasts, chondroblasts, adipocytes, etc. Later on these cells, obtained from postnatal bone marrow, were called mesenchymal stem cells (MSC) or stromal stem cells. Recently the presence of somewhat similar cells has been demonstrated in many other tissues too. In spite of extensive attempts to characterize these cells we are still lacking definitive in vivo markers of MSC although retrospective functional data strongly support the existence of common adult stem cells that have the capacity to differentiate along various specific differentiation lineages. Since MSC can be rather easily isolated from the bone marrow and can also be expanded in vitro they have become a prime target for researchers of tissue regeneration. These cells have now been extensively used for transplantation experiments in animals and also for some therapeutic trials in humans. However, much new research is needed to learn enough on the molecular mechanisms of MSC differentiation to evaluate their full capacity for tissue regeneration.