应用单一和双重荧光定量PCR法快速检测军团菌

目的 建立单一和双重荧光定量PCR方法分别和同时进行军团菌属及嗜肺军团菌的检测.方法 利用军团菌属16 S rRNA基因和嗜肺军团菌mip基因设计引物和探针,两条基因探针分别标记FAM和HEX,并将相关反应体系和条件进行优化.分别应用单一基因探针(单一荧光定量PCR)和双重基因探针(双重荧光定量PCR)对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及非军团菌进行检测,并验证两种方法的特异度、敏感度.应用双重荧光定量PCR检测空调水样滤膜样品和DNA提取样品,比较两者结果的一致性.结果 针对军团菌属及嗜肺军团菌,应用荧光定量PCR,16 S rRNA基因和mip基因均能较好的检出,16S rRNA和mip的最低检出限分别为8和10个拷贝.经优化得到了最佳反应体系.单一荧光定量PCR方法所检的8株嗜肺军用菌及4株非嗜肺军团菌16 S rRNA基因均为阳性,嗜肺军团菌mip基因阳性,非嗜肺军团菌mip基因阴性.双重荧光定量PCR方法所检的23株嗜肺军团菌中有2株为假阴性,9株非嗜肺军团菌和非军团菌属中有1株为假阳性.49份空调水样滤膜直接检测和提取DNA后检测的结果一致,其中26份水样军团菌阳性,20份为嗜肺军团菌,6份为非嗜肺军团菌;1份弗朗西斯菌检测HEX阳性(假阳性),占实际培养分离的1/26.结论 单一及双重荧光定量PCR法特异、快速、敏感,一次同时检测嗜肺与非嗜肺军团菌,满足对空调和环境水样军团菌监测的要求.     

实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌的研究

目的 建立TaqMan-MGB探针实时荧光PCR快速检测嗜肺军团菌技术,为临床和环境样品检测嗜肺军团菌提供可实用工具.方法 在对嗜肺军团菌mip序列进行分析、比较基础上,设计一对特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过实时荧光PCR反应条件和反应体系的优化,实现对嗜肺军团菌的快速检测;用克隆到pMD-19T载体上的嗜肺军团菌mip基因阳参片段和不同菌株验证方法的敏感性和特异性.结果 当用热裂解法提取DNA,25μl的反应体系中包括上、下游引物(20μmol/L)各0.6μl,探针(20μmol/L)0.4μl,模板DNA 6.0μl,反应条件为预变95℃20 S,变性95℃10 s,退火50℃ 40 s,40个循环时,TaqMan-MGB探针实时荧光PCR技术对嗜肺军团菌mip基因阳参片段最低检测浓度为0.71拷贝/μl,其循环阈值(Ct值)与模板浓度具有极好的对应关系(r=0.999);1株嗜肺军团菌标准株、12株嗜肺军团菌分离株的Ct值在13.23～16.04之间,而包括金黄葡萄球菌、鼠伤寒沙门菌、副溶血性弧菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、痢疾志贺菌共计76株其他菌PCR Ct值均大于30;整个检测过程仅需1.5 h.结论 TaqMan-MGB探针的嗜肺军团菌实时荧光PCR检测方法具有特异性和敏感性、易操作、结果准确可靠等优点,可用于嗜肺军团菌检测.     

荧光定量PCR技术及其应用

荧光定量ＰＣＲ是新研制出的一种核酸定量技术。该技术在ＰＣＲ反应系统中引入了荧光标记探针,具有高灵敏性、高特异性和高精确性的特点。目前已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、基因表达、突变和多态性研究等多个领域。     

荧光定量PCR检测查菲埃立克体

依据查菲埃立克体16SrRNA基因序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,以克隆的查菲埃立克体16SrRNA基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度是其30倍;用荧光定量PCR检测其他相关立克次体和细菌DNA样本,检出结果为0;对荧光定量PCR检测重复性进行分析,变异系数(CV)批内和批间误差在0·2%~2·0%之间。结果证明本研究建立的荧光定量PCR方法具有种特异性和良好的重复性,可用于检测感染样本中的微量查菲埃立克体DNA。     

实时荧光定量PCR检测常见性传播疾病病原体基因

目的;用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)技术准确定量检测常见性病病原体基因,为临床治疗提供依据.方法采用实时FQ-PCR技术,检测了临床送检标本3641份.结果淋球菌(NGH)1416份、沙眼衣原体(CT)1165份、解脲支原体(UU)765份,人乳头瘤病毒(HPV6.11)214份、梅毒螺旋体(TP)81份,阳性率分别为26%(368/1416)、27%(315/1165)、36.5%(279/765)、77%(165/214)、21%(17/81).阳性率差异有高度显著性(P＜0.001).NGH、CT、UU、HPV6.11、TP阳性标本DNA平均拷贝数2.3×106、8.5×105、2.4×104、5.6×107、3.8×105.146例治疗后复查,其转阴率为NGH63.9%(39)、CT70%(33)、UU44.7%(17).治疗后复查转阴率差异有显著性(P＜0.05),其DNA拷贝平均数有明显下降.结论实时FQ-PCR技术检测常见性病病原体基因,具有简便、快捷、特异性高、定量准确等优点,对其诊断和治疗有指导意义.     

应用实时荧光定量PCR快速分子诊断唐氏综合征

目的探讨一种快速、准确诊断唐氏综合征的方法。方法采用实时荧光定量PCR技术，对25例唐氏患者、50名正常人外周血标本，扩增21号及1号、19号染色体上的多态位点，定量分析比较正常组及唐氏患者组的4对△Ct值。结果唐氏患者组△Ct值明显低于正常组，两组比较差异有统计学意义（P〈0．001）。初步建立了临床应用的参考值范围，可以有效区分出唐氏样本和正常样本。结论应用实时荧光定量PCR技术可快速、准确诊断唐氏综合征，为唐氏综合征的快速产前诊断开辟了新的途径。     

双重PCR检测气道肺泡灌洗液在军团菌肺炎早期诊断中的意义

为探讨采用双重PCR方法 (DPCR)检测支气管肺泡灌洗液 (BALF)标本中军团菌DNA在早期诊断军团菌肺炎方面的意义 ,采用DPCR方法对军团菌肺炎组 (8例 )、临床表现类似军团菌肺炎组 (15例 )、普通肺炎组 (16例 )、肺结核组 (10例 )和肺癌组 (15例 )五组患者留取的BALF标本进行检测。军团菌肺炎组的DPCR阳性检出率为 10 0 % ,明显高于其它四组 (分别为 13 33% ,0 % ,0 % ,0 % ) ,(均P <0 0 1)。模拟BALF标本DPCR的最低检出限为 1× 10 3cfu mL。采用DPCR方法检测BALF标本中的军团菌DNA具有较好的敏感性和特异性 ,此法在临床早期诊断军团菌肺炎方面具有一定的价值     

用实时荧光定量PCR方法检测母血中的胎儿SRY基因

目的　从孕妇外周血浆中分离出胎儿DNA ,并加以鉴定 ,预防X连锁遗传病患儿的出生。方法　从孕早期、中期共 3 0 0名孕妇外周血浆中分离胎儿DNA ,用实时荧光定量聚合酶链反应 (fluorescencequantitativepolymerasechainreaction ,FQ PCR)的方法检测其中的Y性别决定区 (sex determiningregionY ,SRY)基因。结果　孕早期怀男胎的孕妇 82名 ,70名SRY基因阳性 ,其平均浓度为 ( 5 8.82± 2 0 .90 )拷贝 /ml,中位数为 5 8.5 0拷贝 /ml。孕中期怀男胎的孕妇 90名 ,SRY基因均为阳性 ,平均为 ( 15 2 .0 8± 62 61)拷贝 /ml,中位数为 14 9.3 5拷贝 /ml。怀女胎的孕妇均为阴性。结论　用实时荧光定量PCR的方法最早在孕42天的孕妇外周血浆中就可以检测到胎儿SRY基因 ,随孕周的增加 ,母血中胎儿DNA的量也在逐渐增加。实时荧光定量PCR技术在进行无创伤性产前性别诊断中有重要的价值。     

双色竞争性荧光定量PCR检测唐氏综合征

目的 建立一种快速检测唐氏综合征(Down syndrome,DS)的双色竞争性荧光定量聚合酶链反应(dual-color competitive quantitative fluorescent polymerase chain reaction,DCC-QF-PCR)方法,并探讨其应用于DS产前诊断的可能性.方法 提取30例DS患者和60名正常人的外周血DNA,设计DSCR和USC2两基因的特异共用引物和双色特异性TaqMan探针,同一反应管中进行两基因的DCC-QF-PCR,并与DSCR和GAPDH两基因的QF-PCR实验结果进行比较.提取46份羊水胎儿细胞的DNA进行DSCR和USC2两基因的DCC-QF-PCR,并与染色体核型分析结果对比;克隆出DSCR和USC2的单克隆基因片段,定量后进行定量配比的DCC-QF-PCR,并计算DSCR∶USC2拷贝数的比值.结果 DCC-QF-PCR检测中,DS患者DSCR∶USC2拷贝数比值范围为1.41～1.74,显著高于正常人的0.93～1.15;而QF-PCR检测中,DSCR∶GAPDH拷贝数比值范围较DSCR∶USC2增大.46份羊水检测中,3份DSCR∶USC2拷贝数比值分别为1.61、1.64和1.54,为DS患儿,其余43份正常,与染色体核型分析结果一致;DSCR与USC2基因定量配比的DCC-QF-PCR所得DSCR∶USC2拷贝数比值范围与配比值差异无统计学意义(P＞0.05),检测结果较为稳定.结论 DCC-QF-PCR具有准确、快速、需模板量少和费用低廉等特点,该方法在DS的基因诊断和产前基因诊断中有较为广泛的应用前景.     

荧光定量PCR检测活检组织EB病毒感染的临床意义

目的　建立检测EBV感染的新方法并观察EBV与鼻咽癌的关系。方法　鼻咽部活检组织和石蜡包埋标本6 6例 ,采用荧光定量聚合酶链反应 (FQ -PCR)和原位杂交 (ISH)两种方法检测EBV ,其检测结果与病理诊断对照。结果 :FQ-PCR检测EBV -DNA阴性 5 2例 ,其中 5 1例为炎性病变 ,另 1例为腺癌 ;EBV -DNA阳性 14例 ,其中 13例为鳞状细胞癌 ,另 1例虽为炎症。但部分上皮细胞呈不典型增生。ISH检测EBV阳性 4 9例 ,其中 4 7例为炎性病变 2例为癌。EBV阳性 17例 ,其中 12例为癌 ,5例为炎性病变。FQ -PCR和ISH检测EBV结果 ,经卡方检测差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论　EBV感染与鼻咽癌有高度相关性。FQ -PCR检测EBV具有方法简单、快速、定量准确等优点。     

16SrRNA基因在快速诊断新生儿败血症的病原菌研究

目的探讨血液16SrRNA基因检测在新生儿败血症诊断中的应用价值。方法分析细菌16SrRNA基因保守区,设计一对通用引物扩增已知实验菌株,检测其特异性,用倍比稀释法检测其敏感性,同时进行血培养。结果已知实验菌株均获得920bp扩增产物,对照组中的人类基因组DNA、HBV—DNA和白色假丝酵母菌无相应产物。敏感性测试能达到lpg大肠杆菌DNA。PCR阳性率为31．7％（20／63）,血培养阳性率为14．3％（9／63）,两者比较有显著性差异（P〈0.05）。结论PCR检测血液细菌16SrRNA基因,具有特异性强,敏感度高等特点,能在临床推广应用。     

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

目的在传统产物增强性反转录酶（PERT）活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法。方法以噬菌体MS2RNA为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶（1×10-1～1×10-9U/μl）标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA。采用实时荧光定量PCR法检测底物cDNA模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性。同时应用传统PERT方法对cDNA进行扩增,测定该方法的灵敏度。结果将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cDNA,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值。不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl。结论成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标。     

Quantitative detection of cell culture Mycoplasmas by a one step polymerase chain reaction method

A rapid, sensitive assay was developed that can detect the six species of Mycoplasmas that account for the vast majority of cell culture infections. This assay, a modification of the method published by Wong-Lee & Lovett [1], allows direct evaluation of culture medium by a single-step PCR method that utilizes primers complementary to conserved 16S rRNA sequences. Extensive testing of medium from uninfected cultures spiked with purified Mycoplasma DNAs showed that the method described in this report can detect the equivalent of one Mycoplasma in 15 l culture medium; thus, evaluation of a single culture sample allows detection of Mycoplasmas in cultures infected with the equivalent of 10 or more Mycoplasmas per 15 l (or 6.7×10² Mycoplasma equivalents/ml) with greater than 99.99% confidence. Comparison of results obtained with this PCR-based assay and a standard biological colony-forming assay revealed that the PCR assay is capable of detecting 0.0015-0.015 colony forming units, suggesting that the PCR assay may also be detecting nonviable Mycoplasmas. The high level of amplification achieved with this method allows direct detection of amplification products by ethidium bromide staining of agarose gels, and thus allows rapid screening of cell cultures.Abbreviations CFU colony forming unit - PCR polymerase chain reaction     

16S rRNA基因检测在儿童化脓性脑膜炎早期诊断中的研究

目的探讨儿童化脓性脑膜炎快速诊断方法。方法收集可疑化脓性脑膜炎患儿脑脊液标本85例,分别用16S rRNA基因PCR方法和细菌培养法进行检测,比较两种方法检测病原菌的敏感性。结果85例标本中,PCR方法检测出33例,阳性率为38.82%,培养法检出14例,阳性率为16.47%,PCR方法检出率明显高于培养法（P〈0.01）。结论PCR方法能特异、敏感、快速地检测脑脊液感染的常见病原菌。     

双重实时荧光定量PCR法鉴定克柔念珠菌和光滑念珠菌

目的 建立一种快速、灵敏、特异的鉴定克柔念珠菌和光滑念珠菌的双重实时荧光定量PCR方法.方法 以核糖体基因内转录间隔区Ⅱ(ITSⅡ)为靶目标,设计并合成分别针对克柔念珠菌、光滑念珠菌的种特异引物和探针.建立双重实时荧光定量PCR反应体系,并用该体系对呼吸道相关致病菌进行检测.鉴定结果与临床常规鉴定方法对照,评价其敏感度、特异度及重复性.结果 通过对100例样品的检测,结果显示该双重实时荧光定量PCR法检测标本的鉴定结果与常规鉴定方法的结果对照,特异度为100%,敏感度为100%;最小能检测到10个拷贝数的重组质粒;批内重复实验和批间重复实验结果均与常规鉴定方法结果相符.结论 双重荧光定量PCR法鉴定克柔念珠菌和光滑念珠菌,特异度和敏感度高,重复性好,且快速、简便,该方法将有助于念珠菌病的早期诊断和针对性治疗.     

Rapid Identification of Pathogenic Bacteria by means of TwoConservative Gene Loci′ Specific PCR-CE-RFLP

Molecular diagnosis is playing an increasingly importantrole in the rapid detection and identification of pathogenicorganisms in clinical samples. The genetic variation of ri bosomal genes in bacteria offers an alternative chance forthe detection and identification of these organisms. TherRNA genetic locus, rrn, is found in all prokaryotic or ganisms, and is highly conservative, although its relativelystable variation is found frequently in different bacteria.The utility of this lo…     

嗜肺军团菌lvgA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

本实验采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增得到军团菌毒力基因(L eg ionellav iru lence gene,lvg A gene),并将其定向连接入克隆载体pUC 18,构建重组质粒pU lvgA,重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后,再将lvgA基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pG lvgA,转化宿主菌JM 109,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印记分析鉴定。实验结果表明,成功扩增出627 bp的lvgA基因,构建了重组质粒pU lvgA及原核表达重组质粒pG lvgA,并使53.7 KD a的G ST-lvgA融合蛋白质在原核系统中得到了有效的表达。     

荧光定量PCR检测沙眼衣原体及临床应用

目的：用荧光定量聚合酶链反应（FQ－PCR）检测沙眼衣原体的含量,探讨FQ－PCR在衣原体性尿道炎诊断中的价值。方法：应用荧光探针标记引物的荧光定量聚合酶链反应对172例疑为沙眼衣原体感染患者标本进行检测,并与常规PCR（电泳－EB染色）进行比较。结果：FQ－PCR阳性率为19．8％,常规PCR法为20．9％,两法符合率为63．9％。女性宫颈分泌物标本FQ－PCR阳性为29．2％,常规PCR法为16．7％;男性分泌物FQ－PCR阳性率为16．9％,常规PCR法为13．8％。FQ－PCR特异性较常规PCR法高。结论;FQ－PCR在扩增中实时在线检测,并选择理想的标准曲线做出较精确的临值分析,具有较高的特异性和敏感性,对病原体的诊断有一定的临床意义。