全反式维甲酸对人结肠癌LoVo细胞化疗药物敏感性及Survivin基因表达的影响

Objective To study the effects of all-trans-retinoic acid (ATRA) on chemotherapeutics sensibility and expression of Survivin in human LoVo colon cancer cell line, and to provide a theoretical basis for clinical application of ATRA.Methods Flow cytometer (FCM) was used to detect the cell cycle of LoVo colon cancer cell line after treated with various dose of ATRA (10-5 mol/L, 10-6 mol/L and 10-7 mol/L)for 24 h, 48 h, 72 h, 5 d, 9 d and 15 d respectively.The cells were divided into ATRA group (10-6 mol/L)and control group (cultured in routine medium RPMI1640).Meanwhile, each group were divided into subgroups respectively treated with 0 g/L, 2 g/L, 4 g/L and 6 g/L 5-fluorouracil(5-FU) , or with 0 mg/L, 200 mg/L, 400 mg/L and 600 mg/L mitomycin (MMC).MTT assay was used to detect the viability of cells so as to analyze the change in chemotherapeutics sensibility.Drug interactions were analyzed according to the interaction effects.Staining with acridine orange (AO) and ethidium bromide (EB) was used to study the apoptosis in control group(RPMI1640) , ATRA group (10-6 mol/L), 5-FU group (4 g/L), MMC group (400 mg/L), ATRA (10-6 mol/L) + 5-FU (4 g/L) group and ATRA (10-6 mol/L) + MMC (400 mg/L) group.The expression of Survivin in the LoVo cell line was investigated by immunofluorescence technique.Results Compared with the control group, the percentage of cell in Go-G1 phase increased after interference with various doses of ATRA for 24 hours, peaked at 48 h, and gradually decreased afterwards, while the percentage of cells in stages S and G2-M decreased, reach the trough at 48 h, and then increased gradually.Effects of 10-6 mol/L ATRA were most significant at all time spots.Compared with control group, 10-6 mol/L ATRA reduced cell survival rate (P＜0.05),and the survival rates in control subgroups treated with various doses of 5-FU were significantly higher than those in ATRA group (all P＜0.05).In MMC-treated control group, cell survival rate with 200 mg/L MMC was lower than that in ATRA group (0.72±0.02 vs 1.03±0.13, P＜0.05) , while treatment with 400 mg/L or 600 mg/L MMC did not result in lower cell survival compared with the ATRA group (0.52±0.05 vs 0.39±0.02, 0.36±0.02 vs 0.36±0.01, all P>0.05).Positive interactions of 10-6 mol/L ATRA with 5-FU (2 g/L, 4 g/L, 6 g/L) or MMC (200 mg/L, 400 mg/L) were found.Under fluorescence microscope, cells in ATRA + 5-FU group and ATRA + MMC group showed significantly small size, pyknosis and chromatin condensation and formation of apoptotic bodies when compared with control group, ATRA group, 5-FU group and MMC group.Expression of Survivin was inhibited after 10-6 mol/L ATRA treatment for 48 h compared with control group (33.33% vs 27.96% , P＜0.05).Conclusion ATRA enhances the chemosensibility of LoVo colon cancer cell line to 5-FU and MMC,and induces cell apoptosis, potentially through inhibition of Survivin gene expression.     

全反式维甲酸对结肠癌不同增殖潜能细胞株VEGF表达的影响

目的:探讨全反式维甲酸对结肠癌不同增殖潜能细胞株VEGF表达的作用；研究VEGF在结肠癌侵袭和转移中的作用。 方法:采用细胞培养观察、ATRA干预、MTT和FACS方法确定结肠癌细胞株CW-2和LS174T的生长增殖状况，用Northern blotting方法检测结肠癌中VEGF mRNA的表达量，用免疫细胞化学观察细胞VEGF蛋白的表达。 结果:MTT生长曲线显示结肠癌细胞株LS174T的生长增殖比CW-2快;FACS结果显示LS174T细胞的S期细胞较CW-2细胞数多；Northern blotting和免疫细胞化学检测在CW-2中有明显的VEGF表达，但在高增殖细胞株LS174T中VEGF的表达更明显。 结论:VEGF在结肠癌细胞株中有较高的表达。在高增殖结肠癌细胞株VEGF表达更明显。ATRA可能通过抑制VEGF表达，而抑制结肠癌细胞的增生。     

全反式维甲酸增加胃癌细胞对放射的敏感性

目的:研究全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)对胃癌细胞SGC-7901存活率与放射敏感性的影响,并讨论其可能的机制。方法:MTT法检测细胞存活率;平板克隆形成实验和流式细胞术分别检测细胞的放射敏感性和细胞周期;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测细胞中Bax、Bcl-2、survivin与NF-κB的m RNA表达。结果:ATRA可降低SGC-7901细胞存活率,当浓度到达8μmol/L时,抑制作用达到最大;ATRA联合X射线处理后,与单纯放射处理相比,平均致死剂量(D0)和准阈剂量(Dq)显著变小(P0.05),且拟合的生存曲线明显下移;ATRA能显著降低放射诱导的细胞G_2/M期阻滞,下调SGC-7901细胞Bcl-2与survivin的m RNA表达(P0.05),上调Bax与NF-κB的m RNA表达(P0.05)。结论:ATRA能够增加胃癌细胞SGC-7901的凋亡及放射敏感性,可能与抑制细胞周期G_2/M期的阻滞作用、下调Bcl-2与survivin m RNA表达和上调NF-κB与Bax mRNA表达有关。     

不同化疗药物对结肠癌细胞获得性TRAIL基因耐药的逆转作用

目的：探讨不同化疗药物对结肠癌DLD1细胞获得性TRAIL基因耐药的逆转作用及其可能的机制。 方法：将不同化疗药物联合重组腺病毒载体（Ad）介导的TRAIL基因处理对Ad/gTRAIL耐药的结肠癌DLD1-TRAIL/R细胞，通过MTT法检测治疗后肿瘤细胞的存活率，以评价化疗药物对TRAIL基因耐药的逆转作用；然后进一步在体内评价该逆转策略的有效性；接着通过Western免疫印迹等方法探讨逆转耐药的可能机制。结果：在体外检测了5-氟脲嘧啶、丝裂霉素、阿霉素、氟脲苷、依立替康以及顺铂6种化疗药物对DLD1-TRAIL/R细胞TRAIL基因耐药的逆转作用，结果发现只有5-氟脲嘧啶和丝裂霉素能够使DLD1-TRAIL/R细胞对Ad/gTRAIL重新敏感。进一步的结果表明联合5-氟脲嘧啶和Ad/gTRAIL能在体内有效地抑制DLD1-TRAIL/R细胞来源的肿瘤生长，且该抑制作用明显强于其它对照组。结论：联合使用Ad/gTRAIL和5-氟脲嘧啶或丝裂霉素能在体内外有效地逆转DLD1-TRAIL/R细胞对TRAIL基因的获得性耐药，其中丝裂霉素的逆转作用可能与其诱导的Bax过度表达有关。     

人乳腺癌细胞化疗敏感性与相关基因表达的关系

目的探讨人乳腺癌细胞化疗敏感性与多药耐药相关基因和凋亡调控基因表达的关系。方法MTT法检测5株人乳腺癌细胞株Bcap37、MCF-7、T47D、MDA-MB-231和MDA-MB-435对阿霉素(ADM)、顺铂(DDP)、丝裂霉素(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、卡氮芥(BCNU)的敏感性。流式细胞术检测多药耐药基因P-糖蛋白(P-GP)、谷胱甘肽-S-转移酶-π(GST-π)、肺耐药蛋白(LRP)、多药耐药相关蛋白(MRP)和甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT)等耐药相关基因和凋亡调控基因FAS、BCL-2、P53和P16的表达。结果不同人乳腺癌细胞株对同一药物敏感性差异较大。相关分析表明,细胞株对5-Fu的敏感性与P16表达呈正相关(P<0.01),对其余药物的敏感性与所检基因的表达水平无关。结论人乳腺癌细胞株对5-Fu的敏感性与P16表达有关。     

全反式维甲酸对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响及作用途径.方法:在人乳腺癌细胞株MCF-7培养基中加入一定浓度ATRA和PKC-δ的专一抑制剂rottlerin(RO)并分组,通过SubG1assay by FACS、琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA ladder来观察ATRA对MCF-7的影响.结果:在浓度为5μM的ATRA作用下,MCF-7的凋亡率显著高于其它各组(P＜0.01),并可观察到明显梯状DNA.结论:ATRA能够诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡,但受PKC-δ的专一抑制剂RO的抑制.     

全反式维甲酸对人肺癌细胞增殖和生物大分子物质合成的影响

在体外观察全反式维甲酸对人肺腺癌细胞株ＳＰＣ－Ａ１的增殖和ＤＮＡ，ＲＮＡ以及蛋白质合成的影响，当细胞在含有５μｍｏｌ／Ｌ１０μｍｏｌ／Ｌ和２０μｍｏｌ／Ｌ维甲酸的培养液中培养时，发现细胞生长均受到明显抑制，细胞在含有１０μｍｏｌ／Ｌ维甲酸的培养液中培养２天后，其＾３Ｈ－ＴｄＲ和＾３Ｈ－亮氨酸掺入率明显下降，而培养延长至４天后，＾３Ｈ－ＴｄＲ，＾３Ｈ－ＵｄＲ和＾３Ｈ－亮氨酸掺入率都明显下降，通过流式     

三氧化二砷诱导人结肠癌LoVo细胞凋亡的细胞生物学研究

目的：观察三氧化二砷（As2O3)对结肠癌LoVo细胞体外生长的影响,方法：选用不同剂量As2O3处理LoVo细胞后,通过光镜,电镜,MTT法,AO／EB荧光染色法和流式细胞术研究AsO3对LoVo细胞生长的影响,结果：As2O3具有抑制Lo-Vo细胞生长和其凋亡的作用,这种作用主要在低浓度（0．5－2．0μmol/L)产生,而在高浓度（5．0－10．0μmol/L)可引起细胞死亡,结论：As2O3有明显抑制LoVo细胞生长的作用,并诱导细胞凋亡,其作用机制尚不清楚。     

敲减NOB1基因表达对人结肠癌SW480细胞药物敏感性及侵袭和迁移能力的影响

目的:探讨通过小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)技术敲减NOB1基因表达对人结肠癌SW480细胞活力、药物敏感性、凋亡、细胞周期及侵袭和迁移能力的影响。方法:利用脂质体Lipofectamine 3000将NOB1 siRNA转染至SW480细胞,采用real-time PCR和Western blot检测转染后SW480细胞中NOB1 mRNA和蛋白表达的变化;采用MTT法检测敲减NOB1基因表达后SW480细胞活力及其对不同化疗药物(顺铂、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂和卡培他滨)敏感性的变化;流式细胞术检测敲减NOB1基因表达对SW480细胞凋亡和周期的影响;Transwell方法检测敲减NOB1基因表达对结肠癌SW480细胞侵袭和迁移能力的影响。结果:转染NOB1 siRNA后,SW480细胞中NOB1的mRNA和蛋白表达水平明显降低(P0.05);与对照组和阴性对照siRNA组相比,NOB1 siRNA转染组的SW480细胞在24～72 h的细胞活力显著降低,顺铂、5-氟尿嘧啶、奥沙利铂和卡培他滨对该细胞的半数抑制浓度均显著降低,细胞凋亡率显著增加,细胞周期受到阻滞,细胞侵袭和迁移能力显著降低(P0.05)。结论:NOB1 siRNA转染能够抑制结肠癌SW480细胞活力及侵袭和转移能力,并增强细胞对药物的敏感性,促进细胞凋亡。NOB1能够成为结肠癌诊断和治疗的新靶点。     

FAK基因沉默增强白血病细胞对化疗药物敏感性

目的: 本实验研究黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)基因沉默对白血病细胞化疗药物敏感性的影响。方法: 构建FAK shRNA慢病毒载体,转染至BCR/ABL-BaF3白血病细胞株,通过蛋白质印迹方法检测FAK蛋白表达情况。 体外应用不同浓度的化疗药物伊马替尼处理BCR/ABL-BaF3细胞,予Annexin V标记检测细胞凋亡情况。建立白血病动物模型,联合应用FAK shRNA及伊马替尼进行处理,观察小鼠生存情况,分析白血病细胞在小鼠骨髓及脾脏的分布情况。结果: 成功建立FAK shRNA慢病毒载体,该载体能有效沉默FAK基因表达。体外实验发现5 μmol/L 伊马替尼处理时,空白对照组与FAK基因沉默组中Annexin V阳性细胞百分比分别为(9.76±1.97%和(21.90±3.20%,差异显著(P<0.05);予50 μmol/L 伊马替尼处理时,2组中Annexin V阳性细胞百分比分别为(56.10±6.00)%和(82.10±5.70)％,差异显著(P<0.05)。白血病动物实验中,与空白对照组相比,生存分析结果显示FAK基因沉默组小鼠的生存时间明显延长。白血病细胞输注后第60 d,与空白对照组相比,白血病细胞在FAK基因沉默组小鼠骨髓和脾脏的分布明显减少。结论: FAK基因沉默能明显增强白血病细胞对化疗药物敏感性,提示FAK基因沉默有望成为白血病治疗的新策略。     

Stat5b/Survivin信号转导通路调控结肠癌细胞凋亡的机制

目的: 探讨Stat5b/Survivin信号转导通路调控结肠癌细胞凋亡的作用机制。方法: 用阳离子脂质体介导Stat5反义寡核苷酸转染人结肠癌HT29细胞，MTT法检测细胞增殖状态；流式细胞术检测细胞周期与凋亡；EMSA检测Stat5活性；Western blotting检测Stat5、p-Stat5、cyclin D1、Survivin与Bcl-2凋亡家族成员Bcl-2和Bcl-x_L的表达。结果: 转染Stat5反义寡核苷酸后HT29细胞增殖受抑制，凋亡细胞增多，Stat5、p-Stat5与Survivin表达下降，Bcl-2与Bcl-x_L变化不明显。结论: 阻断Stat5通路可以抑制靶基因Survivin表达并诱导结肠癌细胞凋亡。     

BCL-3基因沉默对BCL-3高表达的人大肠癌RKO细胞增殖和药物敏感性的影响

 目的：构建针对人BCL-3基因的RNA干扰（RNA interference,RNAi）慢病毒载体,观察其对大肠癌细胞株中BCL-3基因的沉默效应,以及基因沉默对细胞生物学行为及药物敏感性的影响。方法：运用RT-PCR及Western blotting方法检测5株大肠癌细胞株中BCL-3的表达状况;构建人BCL-3基因的RNAi慢病毒载体,并转染BCL-3高表达的大肠癌细胞株,运用Western  blotting方法鉴定其对BCL-3基因的沉默效果;BCL-3基因沉默后运用细胞增殖实验及软琼脂克隆形成实验检测其对细胞增殖能力的影响,运用MTT方法检测大肠癌细胞株对化疗药物敏感性的变化。结果：BCL-3高表达于大肠癌细胞株RKO中;成功构建了BCL-3　RNAi慢病毒载体,Western blotting实验显示其可抑制RKO细胞中BCL-3蛋白的表达;抑制BCL-3的表达后,增殖实验表明RKO细胞增殖能力下降,软琼脂克隆形成实验表明RKO细胞的克隆形成率下降;MTT实验表明BCL-3表达抑制后奥沙利铂对RKO细胞的半数抑制浓度（median inhibitory concentration, IC50）显著降低。结论: BCL-3表达抑制后,BCL-3高表达的大肠癌细胞株RKO的增殖能力下降,并且其对奥沙利铂的敏感性增强。     

bcl-3基因通过cyclin D1及Bax蛋白影响人结肠癌RKO细胞的凋亡

目的:研究bcl-3基因对人结肠癌RKO细胞迁移及凋亡的影响及机制。方法:采用人bcl-3基因的RNA干扰慢病毒载体沉默人结肠癌RKO细胞bcl-3基因的表达后,划痕实验观察bcl-3基因沉默前后RKO细胞迁移能力的变化,Annexin V/PI双染色法检测bcl-3基因沉默前后RKO细胞凋亡率的变化,Western blot法检测bcl-3基因沉默前后细胞周期蛋白cyclin D1及凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的变化。结果:划痕实验显示,划痕后36 h,bcl-3基因沉默前后RKO细胞划痕愈合率分别为84.00%及40.00%,差异具有统计学意义(P0.05)。Annexin V/PI双染色法流式细胞术分析显示,bcl-3基因沉默前后的RKO细胞均经5μmol/L顺铂处理24 h后,沉默前后的RKO细胞凋亡率分别为12.89%及59.67%,差异具有统计学意义(P0.05)。Western blot法检测显示bcl-3基因沉默后cyclin D1蛋白表达显著下降(P0.05),Bax蛋白表达显著上升(P0.05),但Bcl-2表达无明显变化(P0.05)。结论:沉默bcl-3基因后,RKO细胞迁移能力下降,凋亡率增加,并伴细胞周期蛋白cyclin D1及凋亡相关蛋白Bax表达的变化。bcl-3基因可能通过改变cyclin D1及Bax蛋白的表达而影响RKO细胞的凋亡。     

RNAi沉默Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的抑制

目的：研究Cripto基因对结肠癌细胞血管内皮生长因子的影响。方法:设计合成针对Cripto基因的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，转染结肠癌LS-174T细胞。细胞分4组：空载对照组（对照组）和不同浓度（3.125、6.25和12.5 nmol/L）的siRNA组。分别于转染24、48、72 h后收集细胞，以实时定量PCR检测结肠癌细胞Cripto mRNA，分别采用Northern blotting和免疫荧光标记法检测癌细胞VEGF mRNA和蛋白表达。分别收集转染72 h的12.5 nmol/L组和对照组细胞，接种于裸鼠背部。30 d后处死裸鼠，收集裸鼠肿瘤组织，对组织VEGF进行免疫组化染色，计算染色平均强度。结果:实时定量PCR检测显示，转染组Cripto mRNA被有效地抑制，且呈浓度和时间依赖性。转染组细胞VEGF 蛋白和mRNA明显低于对照组。裸鼠肿瘤免疫组化分析显示，转染组VEGF平均染色强度明显低于对照组。结论:Cripto基因参与了结肠癌组织血管生成的调控。采用siRNA下调Cripto基因表达，可抑制结肠癌组织血管生成。     

抗氧化剂和NF-κB对大肠癌细胞IL-8表达的作用及机制

目的：探讨NF-κB在大肠癌细胞IL-8诱导表达中的作用及抗氧化剂对大肠癌细胞IL-8诱导表达的影响及其机制。 方法： IL-8 mRNA表达采用逆转录/聚合酶链反应(RT/PCR)检测，培养上清IL-8蛋白含量用ELISA检测，EMSA法测定细胞核内NF-κB结合活性。 结果： 抗氧化剂可阻断大肠癌细胞培养体系TNF-α诱导的IL-8生成及IL-8 mRNA的表达, TNF-α可诱导大肠癌细胞NF-κB的激活并被抗氧化剂阻断。 结论： TNF-α诱导的大肠癌细胞IL-8基因和蛋白表达依赖于NF-κB的激活；抗氧化剂可通过抑制NF-κB的活化而阻断IL-8基因和蛋白的诱导表达。     

PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC作用的研究

目的：研究PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC细胞恶性表型及凋亡的影响。方法：将PTEN真核表达载体pBabe-PuroPTEN及空质粒pBabe-Puro，通过脂质体介导的基因转染方法，转入该基因表达缺失的HHCC细胞系中，嘌呤霉素筛选获得稳定表达PTEN基因的转染细胞。通过平板克隆形成试验、DNA凝胶电泳、相差显微镜和电镜，观察PTEN基因对人肝癌细胞系HHCC恶性表型及凋亡的影响。结果：转染后的细胞，经原位杂交、免疫组织化学检测证实，有PTEN mRNA及其蛋白的表达；平板克隆形成试验证实，转染PTEN基因后，细胞形成克隆的能力降低；转染PTEN的细胞在相差显微镜和电镜下可出现典型的凋亡形态学改变；DNA琼脂糖凝胶电泳呈现出明显的梯状条带。结论：外源性PTEN基因导入HHCC细胞后，可降低HHCC的细胞的恶性表型，并促进凋亡发生。     

抗癌生物活性肽对人乳腺癌nm231细胞的增殖抑制作用

 目的 探讨抗癌生物活性肽（ACBP）对人乳腺癌 nm231细胞的作用及其机制。 方法 nm231 细胞经不同浓度（0.05、0.10、0.20、 0.25 µg/ml）ACBP 作用 72 h，以噻唑蓝（MTT）法测定细胞增殖活性。以 0.25 µg/ml 的 ACBP 分别作用于 nm231 细胞 4、6、24、48、72 h，行光镜和透射电镜（作用 48 h 细胞）观察。应用 DNA 凝胶电泳和磷脂结合蛋白 V（Annexin V，AV）/碘化丙啶（PI）双标记染色流式细胞术等方法，观察 0.25 µg/ml 的 ACBP 作用不同时间对nm231 细胞凋亡发生及作用 48 h 对细胞周期的影响。以上各项检测均设以 RPMI 1640 培养液取代 ACBP 的对照组。 结果 浓度为 0.1 µg/ml 的 ACBP 即对 nm231 细胞的增殖有明显抑制作用，抑制率为 10.3%，抑制作用具有浓度依赖性，ACBP 浓度为 0.25 µg/ml 时抑制率达 35.1%。光镜观察显示，经 0.25 µg/ml 的 ACBP 作用 24 h，细胞出现凋亡特征；作用 48 h，光镜及电镜下均可见大量的典型凋亡细胞。DNA 凝胶电泳显示，经 0.25 µg/ml 的ACBP 作用 24 h 的细胞出现 DNA 断裂；作用 48 h 的细胞出现典型的梯形电泳图谱。流式细胞术分析显示，ACBP 作用后AV（+）/ PI（－）细胞和 AV（+）/ PI（+）细胞比例均随培养时间延长而增大；作用 48 h 的 nm231细胞 G0/1 期细胞比例高于对照组（P < 0.01），而细胞增殖指数低于对照组（P < 0.01）。 结论 ACBP 可抑制 nm231 细胞的增殖，其机制与抑制nm231 细胞的 DNA 合成和诱导细胞凋亡相关。