骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血单个核细胞表面抗原表达的影响

背景：课题组已建立胎儿骨髓基质细胞联合细胞因子的造血细胞体外培养体系,该培养体系能否有效扩增各个发育阶段的造血细胞有待验证。目的：观察骨髓基质细胞联合细胞因子培养体系对脐血单个核细胞表面抗原CD133、CD34表达的影响。方法：将从脐血标本中分离出来的单个核细胞接种于无血清培养体系,实验分为3组：①F组：干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。②S组：基质细胞＋单个核细胞。③SF组：基质细胞＋干细胞因子＋Flt3配体＋促血小板生成素＋单个核细胞。在第0,6,10,14天检测有核细胞总数、CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞数以及集落形成单位数。结果与结论：SF组有核细胞总数在各个检测时间点均比其他两组高;除了第14天外,第6、10天两个时间点SF组中CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞及集落形成单位数均高于其他组;含骨髓基质细胞的S组和SF组中CD133＋细胞/有核细胞、CD34＋细胞/有核细胞、CD133＋CD34＋细胞/有核细胞的比例保持在较高的水平。结果说明骨髓基质细胞联合细胞因子能有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133^＋、CD34^＋、CD133^＋CD34^＋细胞,基质细胞对维持造血干细胞的原始性具有重要的作用。     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133+细胞体外扩增作用的研究

为了探讨胚胎骨髓基质细胞(FBMSC)联合细胞因子对脐血单个核细胞(MNC)中CD133+细胞的体外扩增作用,将新鲜脐血(CB)中分离出来的MNC接种于无血清培养体系中培养14天.实验分为4组:C组为空白对照组,不含基质细胞和细胞因子;S组为单用基质细胞组;F组为单用细胞因子组;SF组为联合使用基质细胞和细胞因子组.在第0,6,10及14天检测有核细胞总数、CD133+细胞数及集落形成单位(CFU)数.结果表明:各时间点SF组有核细胞总数的扩增倍数均高于其它组;除了第14天外,SF组在第6、10天时CD133+细胞数、CFU数的扩增倍数均高于其它组.结论:胚胎骨髓基质细胞对延缓造血细胞的分化具有重要的作用,基质细胞联合细胞因子可以有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133+细胞,这是一种比较接近于临床移植要求的造血细胞体外扩增方法.     

骨髓基质细胞联合细胞因子对脐血CD133+细胞体外扩增作用的研究

为了探讨胚胎骨髓基质细胞（FBMSC）联合细胞因子对脐血单个核细胞（MNC）中CD133＋细胞的体外扩增作用,将新鲜脐血（CB）中分离出来的MNC接种于无血清培养体系中培养14天。实验分为4组：C组为空白对照组,不含基质细胞和细胞因子;S组为单用基质细胞组;F组为单用细胞因子组;SF组为联合使用基质细胞和细胞因子组。在第0,6,10及14天检测有核细胞总数、CD133＋细胞数及集落形成单位（CFU）数。结果表明：各时间点SF组有核细胞总数的扩增倍数均高于其它组;除了第14天外,SF组在第6、10天时CD133＋细胞数、CFU数的扩增倍数均高于其它组。结论：胚胎骨髓基质细胞对延缓造血细胞的分化具有重要的作用,基质细胞联合细胞因子可以有效的扩增脐血单个核细胞及其中的CD133＋细胞,这是一种比较接近于临床移植要求的造血细胞体外扩增方法。     

骨髓基质细胞对多细胞因子介导人脐血单个核细胞体外扩增的影响

背景:体外扩增脐血造血细胞的目的是促进脐血造血细胞的植入能力,细胞因子介导的脐血造血细胞能使细胞数有效扩增,但同时也耗竭了具有分化潜能的造血干细胞.目的:观察骨髓基质细胞对多细胞因子组合介导人脐血单个核细胞体外扩增及扩增后黏附分子和CXCR4表达的影响.方法:将分离的人脐血单个核细胞接种在预先建立的人骨髓基质细胞层上,分组培养:对照组仅含有脐血单个核细胞;多种细胞因子+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+多种细胞因子+脐血单个核细胞组.培养0,7 d检测有核细胞数, CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数.结果与结论:单纯骨髓基质细胞和单用细胞因子组均可有效地扩增脐血造血细胞,并提高造血细胞上CD49d,CD62L及 CXCR4表达.而单用细胞因子组促进脐血造血细胞扩增能力较单纯骨髓基质细胞强,提高造血细胞CD49d,CD62L及 CXCR4表达能力较单纯骨髓基质细胞差.提示骨髓基质细胞虽可支持脐血造血细胞扩增,但难以实现造血细胞的大量扩增,但在骨髓基质细胞层的支持下,多细胞因子可有效地促进脐血造血细胞的扩增,并优于单用细胞因子及骨髓基质细胞,证实骨髓基质细胞可协同多细胞因子有效地促进脐血单个核细胞的扩增,促进造血干细胞的黏附和趋化能力.     

胎儿骨髓基质细胞与细胞因子支持人脐血单个核细胞体外扩增的研究

为了探讨胎儿骨髓基质细胞(FBMSC)联合细胞因子对脐血单个核细胞(MNC)体外扩增作用的影响及比较扩增前后脐血(CB)CD34 细胞上细胞表面趋化因子受体CXCR4和黏附分子CD49d (VLA4)的表达情况,将从新鲜CB标本中分离出的MNC分别接种于已建立的无血清培养体系,该体系分4组:A组为培养过程中不加细胞因子和基质细胞;B组为单用胚胎骨髓基质细胞支持;C组为单用细胞因子支持;D组为细胞因子和胚胎骨髓基质细胞联合支持。在0、6、10及14天检测细胞总数、CD34 细胞数及集落形成单位(CFU)数,同时检测CD34 细胞上CD49d 及CXCR4的表达数。结果表明:在体外14天培养过程中,各时间点D组CD34 细胞、CFU数及CD34 CXCR4 细胞和CD34 CD49d 细胞扩增数均高于A、B、C组(P<0.05);B、C和D组在各时间点各测量指标与A组比较具显著性差异(P<0.05);6天后,B组各测量指标与C组比较具显著性差异(P<0.05)。结论:胚胎骨髓基质细胞联合外源性细胞因子不仅可以支持脐血MNC的有效扩增,而且扩增后与趋化作用和与粘附作用相关的造血细胞亦较扩增前明显增加。单用细胞因子扩增会造成造血细胞的耗竭,单用基质细胞支持可扩增或维持造血细胞的量,但难以实现造血细胞的大量扩增,FBMSC联合外源性细胞因子可能是扩增造血干祖细胞的较理想方案。     

胎儿骨髓间质干细胞与细胞因子对脐血CD34+细胞扩增作用

目的　探讨胎儿骨髓间质干细胞对CD34 细胞体外扩增的造血支持作用。方法　体外分离、纯化胎儿骨髓间质干细胞 ;Mini MACS免疫磁珠分选 3份脐血CD34 细胞 ;建立胎儿骨髓间质干细胞与CD34 细胞共培养体系 :第 1组为单独CD34 细胞培养 ,第 2组为胎儿骨髓间质干细胞 CD34 细胞共培养 ,第 3组为细胞因子 (干细胞因子 ,白细胞介素 3,Flt3配体 ,血小板生成素 ) CD34 细胞共培养 ,第 4组为胎儿骨髓间质干细胞 细胞因子 CD34 细胞共培养。用流式细胞仪检测不同培养时间的CD34 细胞。结果　胎儿骨髓间质干细胞表达CD2 9,CD4 4 ;免疫磁珠分选CD34 细胞的平均纯度为 97.4 % ;胎儿骨髓间质干细胞 CD34 细胞共培养 2 8d ,有核CD34 细胞仍占有核细胞的 6 .4 3% ;CD34 细胞在胎儿骨髓间质干细胞、细胞因子作用下培养 2 8d ,有核细胞总数、CD34 细胞数分别被扩增 1.6 5× 10 5倍、788倍。结论　胎儿骨髓间质干细胞可有效扩增脐血造血干 /祖细胞。     

不同细胞饲养层支持脐血CD34＋细胞体外扩增的效果比较

背景:成纤维细胞饲养层与基质细胞饲养层一样能分泌多种细胞因子,其中包括起正性作用和负性作用的细胞因子,它们对共培养体系内的干/祖细胞起双向调节作用,但何时表现为抑制性或促进性作用目前尚无定论.目的:分析比较骨髓基质细胞及皮肤成纤维细胞饲养层对脐血CD34+细胞体外扩增的影响,以了解共培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2003-08/2004-05在广东医学院附属医院中心实验室完成.材料:原代成纤维细胞、骨髓标本由广东医学院附属医院提供,脐血标本由广东医学院附属医院妇产科及湛江市妇幼保健院妇产科提供.方法:体外分离培养人脐血单个核细胞,应用免疫磁珠(阳性)分选法提取脐血CD34+细胞.设立3组:液体培养对照组为脐血CD34+细胞(3×108L-1)+RPMI 1640培养液(含体积分数为10%牛血清白蛋白、10 μg/L粒-巨噬细胞集落刺激因子、10 μg/L干细胞因子、10 μg/L白细胞介素3),接种于24扎培养板;骨髓基质细胞饲养层组、成纤维细胞饲养层组分别将体外分离培养的第4代人骨髓基质细胞,皮肤成纤维细胞接种于24孔培养板,70%融合时加入等量脐血CD34+细胞及相同成分的RPMI 1640培养液.主要观察指标:脐血CD34+细胞增殖情况与集落形成能力.结果:与骨髓基质细胞饲养层组比较,液体培养对照组、成纤维细胞饲养层组脐血CD34+细胞增殖率及集落形成能力均显著降低(P均＜0.01):后2组间比较差异无显著性意义(P＞0.05).结论:骨髓基质细胞饲养层培养体系能促进脐血CD34+细胞体外扩增,并可以较好地保持脐血CD34+细胞的干细胞特性,效果显著优于成纤维细胞饲养层及液体培养体系.     

人骨髓基质细胞协同外源性细胞因子对脐血CD34+细胞的体外扩增作用

目的探讨人骨髓基质细胞(hBMSC)协同以干细胞因子和FL为主的细胞因子对脐血CD34+细胞的体外扩增作用.方法采用免疫磁珠法分选脐血CD34+细胞,以SCF+IL-3+IL-6+FL+EPO组合高效扩增CD34+细胞[1],并结合该细胞因子组合接种到预先照射(20Gy)的hBMSC上,d10结束培养,收获细胞分别作细胞计数、集落培养和流式细胞术检测CD34+细胞数.结果本法获得的脐血CD34+细胞纯度较高(92±0.04)%,在hBMSC组培养的d2,造血细胞几乎都粘附到hBMSC上,随着培养时间的延长,CD34+细胞比例不断下降.hBMSC组与无hBMSC组相比,除细胞总数扩增倍数外,CFU-GM、BFU-E、CD34+细胞扩增倍数差异有显著性意义(P<0.05).结论①脐血来源的CD34+细胞粘附于滋养层上形成造血灶,且10d后造血细胞仍具有体外集落形成能力,表明骨髓基质细胞可支持并维系体外造血;②hBMSC协同外源性细胞因子可能是扩增造血干/祖细胞的较理想方案.     

不同细胞因子组合对人脐血单个核细胞体外扩增及CD49d和CXCR4表达的影响

为了探讨不同的细胞因子组合对脐血单个核细胞体外的扩增作用及扩增后CD49d和CXCR4的变化，将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7天，在0天，7天检测有核细胞数，CD34^＋细胞数及CD34^＋CXCR4^＋，CD34^＋CD49d^＋的细胞数和集落形成单位（CFU）数．根据不同细胞因子组合实验分组为：对照组；SF组（SCF＋FL）；SFT组（SCF＋FL＋TPO）和SFT6组（SCF＋FL＋TP0＋IL-6）。结果表明，和对照组相比，SF组合仅能低水平支持脐血造血细胞扩增，加入TPO后即SCF／FL／TPO组合能有效的扩增脐血细胞，但SFT和SFT6两组之间差异却无明显发生（P〉0．05）；SF，SFT和SFT63组的细胞因子组合均可提高脐血CD34^＋细胞CD49d，CXCR4的表达，但3组之间差异无显著性（P〉0．05）。结论：SF组合可协同扩增人造血细胞，但协同作用较弱；TPO在脐血造血干／祖细胞体外扩增中起重要调节作用，而IL-6作用不显著；SCF／FL／TPO 3种因子组合不仅可促进脐血造血祖细胞的扩增，而且可上调脐血造血细胞CD49d，CXCR4表达。     

细胞因子介导的人脐血单个核细胞体外扩增并重建NOD/SCID小鼠造血及免疫功能

背景:细胞因子介导的脐血造血细胞体外扩增有望能解决脐血移植数量不足的问题.目的:实验拟确立在无基质培养条件下体外扩增脐血单个核细胞最合适的细胞因子组合及干细胞因子、FLT3配基协同促聚核细胞生成因子对造血及免疫重建功能的影响.方法:将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d,根据不同细胞因子组合分组,将3因子干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子组合在无血清无基质条件下扩增培养7 d前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠.在扩增培养0,7 d检测脐血CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数.脐血移植6周后通过流式细胞仪,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞.结果与结论:移植6周后,存活小鼠体内均可检测到人源性CD45+细胞,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠存活率和人特异性基因捡出率均高于新鲜脐血移植组和高于生理盐水移植组(P<0.05).扩增脐血组存活NOD/SCID小鼠骨髓中可检测到人髓系细胞(CD33+),T淋巴细胞(CD4+),B淋巴细胞(CD19+)和人造血干细胞成分(CD34+)细胞的表达.结果提示干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子3因子组合脐血造血细胞体外扩增是最合适的细胞因子组合,其扩增的脐血单个核细胞能够植入并重建NOD/SCID小鼠的造血及免疫功能.     

脐血造血细胞体外扩增过程中DNA损伤的研究

本研究检测脐血(CB)单个核细胞(MNC)体外培养DNA损伤情况,以探讨体外培养的最佳收获时机。脐血MNC分别接种于含细胞因子无血清培养体系并进行集落接种,分别在0、7、14及21天收集细胞,用流式细胞仪检测CD34+及CD133+细胞数,采用单细胞凝胶电泳试验检测培养后不同时间点脐血造血细胞及集落细胞的DNA链断裂损伤情况。结果表明,体外短期培养(14天内)时,脐血CD34+及CD133+细胞数最多,脐血细胞DNA损伤率均低于5.0%,21天时CD34+及CD133+细胞数降到低于0天的比例,细胞DNA损伤率为28.2%,DNA损伤率比0天时高(p=0.000),损伤细胞彗星尾长度明显大于0天(p=0.000);而其余各培养时间点(7天和14天)损伤细胞彗星尾长度与培养0天组损伤细胞的彗星尾长度比较,差异无统计学意义(p=0.863及p=0.253);集落培养细胞DNA损伤率均低于5.0%。结论:利用本方法进行脐血造血细胞短期(14天)培养DNA损伤率均低于5.0%,但超过14天时DNA损伤明显增加,体外培养的最佳收获时机应在14天内。     

脐血间充质干细胞支持下脐血单个核细胞扩增的研究

目的 探讨脐血源间充质干细胞联合外源性细胞因子对脐血单个核细胞体外扩增的支持作用.方法 从脐血中分离、培养出间充质干细胞并检测其细胞表面抗原;以此间充质干细胞作为细胞滋养层.将脐血单个核细胞接种于无血清培养体系中培养18天,在第0、7、10、14及18天检测有核细胞总数、CD34+、CDl33+细胞数、集落形成单位数和(G2+M+S)期细胞含量变化.结果 ①从脐血中分离、培养出的间充质干细胞能稳定表达CD29、CD105和CD44,但不表达CD34和CD133;②外源性细胞因子及脐血源间充质下细胞均支持脐血间充质干细胞扩增,但以细胞因子联合脐血源间充质干细胞组效果最好,在第10天上述榆测指标达到峰值,分别为第0天的(6.91±1.91)、(7.75±1.24)、(6.49±1.33)、(15.62±1.29)和(28.26±6.58)倍,且维持造血至少18天.结论 ①从脐血巾能成功分离、培养出间充质下细胞,并完成细胞表型的初步鉴定;②外源性细胞因子联合脐血源间允质干细胞可有效扩增脐血单个核细胞.     

脐血间充质干细胞的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用

目的探讨脐血间充质干细胞(MSC)的生物学特征及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用。方法用液体培养法分离脐血贴壁细胞,采用ELISA方法检测贴壁细胞条件培养液中细胞因子的表达;用流式细胞术分析其免疫表型特征;在成软骨细胞诱导培养条件下诱导细胞分化,并用RTPCR方法检测分化后细胞原胶原Ⅱ型基因的表达。采用分阶段共培养方法观察脐血贴壁细胞对CD34+细胞体外扩增的支持作用。结果脐血单个核细胞纤维样细胞集落形成率为(3.5±0.7)/106。脐血MSC体外至少可以扩增15代。没有分化的脐血MSC表型为CD13、CD29、CD90、CD105、CD166、SH2、SH3和SH4阳性,CD45、CD34和CD14阴性;脐血MSC培养上清中干细胞因子、IL6和肿瘤坏死因子α检测阳性。在成软骨细胞诱导培养基培养条件下,脐血MSC原胶原Ⅱ型基因mRNA表达阳性。脐血MSC与CD34+细胞共掊养14d,CD34+细胞扩增率高于未共培养组4倍。结论脐血MSC具有类似于成体骨髓MSC的特征,对造血干细胞增殖有明显的支持作用。     

人骨髓基质细胞支持脐血造血细胞扩增后脐血归巢相关特性变化的研究

目的探讨人骨髓基质细胞（HBMSC）联合细胞因子对脐血（CB）单个核细胞（MNC）体外培养后造血细胞归巢相关特性的变化以评价HBMSC及细胞因子支持的体外扩增对脐血归巢相关功能的影响。方法将从新鲜CB标本中分离出的MNC分别接种于已建立的无血清培养体系：A组：对照组；B组：单用HBMSC支持；C组：单用细胞因子支持；D组：细胞因子和HBMSC联合支持。分别在0d（d0）、10d（d10）及14d（d14）用流式细胞仪检测CD34^＋CXCR4细胞、CD34^＋VLA-4^＋细胞的变化情况。结果①在体外培养过程中，各时间点D组CD34^＋CXCR4^＋细胞扩增倍数均高于A、B、C组（P〈0.05）；②B、C和D组与A组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论HBMSC联合外源性细胞因子对脐血MNC进行体外培养，能有效扩增具归巢能力的造血干祖细胞数目。     

A large number of mature and functional dendritic cells can be efficiently generated from umbilical cord blood–derived mononuclear cells by a simple two‐step culture method

BACKGROUND: Advances in the past two decades in dendritic cell (DC) biology paved the way to exploit them as a promising tool in cancer immunotherapy. The prerequisite for DC vaccine preparations is large‐scale in vitro generations of homogeneous, mature, and functional DCs. Frequent improvements are being made in the existing in vitro DC production protocols to achieve this goal. In our previous study we reported a large‐scale generation of mature, functional DCs from umbilical cord blood (UCB) CD34+ cells. Here we report that this method can be used for the efficient generation of DCs from UCB mononuclear cells (MNCs) and thus the hematopoietic stem cell isolation step is not essential. STUDY DESIGN AND METHODS: MNCs or CD34+ cells isolated from the same cord blood (CB) samples were used for the generation of DCs. DCs were characterized for morphology, phenotype, and functional assays including antigen uptake, chemotaxis, and mixed leukocyte reaction. Similarly DCs generated from the MNCs of same fresh and frozen CB units were compared. RESULTS: The morphologic, phenotypic, and functional characterization of the DCs generated from various sets show that they were comparable in nature irrespective of the starting population used. CONCLUSION: We conclude that the CD34+ isolation step is not essential for the generation of mature, functional DCs and thus can be eliminated. More importantly, we show that DCs can be generated with equal efficiency from the MNCs of frozen CB units. Our culture method will be useful for exploiting the potential of UCB as an additional source for allogeneic DCs in the clinical settings.     

人胎盘组织来源造血干/祖细胞及其特性

背景:近年来的研究表明,除已知的人骨髓、外周血和脐带血中存在造血干/祖细胞外,人胎盘组织中也有造血干/祖细胞存在.目前为止,还缺乏对人胎盘组织造血干/祖细胞的增殖分化特性及人胎盘组织淋巴细胞亚群组成和免疫原性等的深入研究.目的:探究人胎盘组织是否含有比脐带血更丰富的造血干/祖细胞,并对其造血祖细胞系增殖分化能力进行检测,同时对人胎盘组织淋巴细胞亚群组成及表型特征进行分析.设计、时间及地点:开放性实验,于2004-01/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成.材料:经产妇知情同意,无菌采集遵义医学院附属医院产科健康足月分娩新生儿胎盘和脐带血共12份.淋巴细胞亚群检测试剂盒,CD34绝对计数试剂盒(Becton Dickinson公司):CD34磁珠分选试剂盒,FITC标记的CD38单克隆抗体,抗FITC磁珠和MS/LS免疫磁式细胞分选柱(Miltenyi Biotec).方法:脐带血与RPMI-1640培养基(含体积分数为0.1的胎牛血清)按1:1的比例混合,采用Ficoll-Histopaque分离液离心30min,吸取界面层细胞,PBS洗涤一次,获得脐带血单个核细胞.采用机械法加0.25g/L胶原酶消化制备胎盘组织单个细胞悬液,之后同脐带血单个核细胞分离步骤分离胎盘单个核细胞.流式细胞仪检测胎盘单个核细胞中CD34 CD38-, CD34 CD38 造血干/祖细胞(HSPCs)和淋巴细胞亚群的组成比例.免疫磁珠分选法分选人胎盘CD34 CD38-,CD34 D38 造血干/祖细胞,并分别进行粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位系集落形成培养,以评价其造血祖细胞系增殖分化能力.实验全程用脐带血作平行比较分析.主要观察指标:胎盘和脐带血CD34 造血干/祖细胞组成百分率、祖细胞系集落形成能力、淋巴细胞亚群表型及组成特点.结果:[1]胎盘CD34 造血干/祖细胞百分率是脐带血的8.8倍,差异有显著性意义(P<0.01).[2]胎盘中的淋巴细胞总数、T细胞(CD3 CD2 )、B细胞(CD19 )、Th(CD3 CD4 )细胞及Th/Ts比值均明显低于脐带血,而CD8 CD28-T抑制细胞则明显高于脐带血,差异有显著性意义(P<0.01).[3]胎盘CD34 CD38 造血干/祖细胞亚群培养形成的粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位集落数明显高于CD34 CD38-造血干/祖细胞亚群(P<0.01);胎盘与脐带血造血干/祖细胞中相同表型细胞亚群形成的各系集落数比较,差异无显著性意义(P0.05).结论:人胎盘组织富含CD34 造血干/祖细胞,其CD34 CD38 、CD34 CD38-两个造血干/祖细胞亚群均具有增殖分化为粒细胞-单核细胞集落生成单位、红细胞爆裂型集落生成单位、混合集落生成单位的能力,并且人胎盘组织具有淋巴细胞亚群低比例和抑制性T细胞高比例的特点,使其有望成为造血干/祖细胞移植的新来源.     

Clinical isolation and functional characterization of cord blood CD133+ hematopoietic progenitor cells

BACKGROUND: Human cord blood is a relevant source of CD133+ HPCs. Clinical-scale isolation of human umbilical cord blood (UCB) CD133+ HPCs using immunomagnetic microbeads and the CliniMACS clinical cell isolator is reported. CD133+ HPCs isolated after large-scale processing were functionally characterized. STUDY DESIGN AND METHODS: Closed disposable sets were used to process nine different samples of RBC-reduced UCB nucleated cells. In-vitro hematopoietic assays and human xenografts in NOD/SCID mice were performed to assess the functional properties of isolated CD133+ cells. Different mixtures of human cytokines were tested for the ability to expand nascent CD133+ HPCs. Furthermore, freshly isolated CD133+ cells were conditioned in culture medium specifically tested to support in-vitro myogenesis or osteogenesis. RESULTS: Isolation procedures yielded the recovery of an average of 2.53 x 10(6) CD133+ HPCs with a mean recovery of 96 percent (referred to as RBC-reduced samples) and a final sample purity of 82 percent. Purified CD133+ cells had high cloning efficiency, had relevant long-term activity, and were capable of repopulating irradiated NOD/SCID mice. In 10-day stroma-free cultures, a 2-fold and 8.3-fold expansion of colony-forming cells (CFCs) and extended long-term culture-initiating cells, respectively, was obtained. Freshly isolated CD133+ cells differentiated into large nucleated cells expressing either myosin D or osteopontin (as revealed by RT-PCR and immuno-cytochemistry), with a protein/mRNA expression comparable to or even higher than that observed in UCB CD133- nucleated cells in identical culture conditions. CONCLUSION: Collectively, clinical-scale isolation of UCB CD133+ cells provides a relevant amount of primitive HPCs with high hematopoietic activity and in-vitro mesenchymal potential.