人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体基因的克隆与表达

目的：克隆和表达人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体。方法：首先依照人源化单链抗体的蛋白序鲁设计并优化人源化单链抗体的核苷酸序列，然后在化学合成１４条人源化单链抗体基因片段的基础上，利用二次ＰＣＲ方法构建完整的人源化单链抗体基因，并把构建的全长人源化单链抗体基因直接克隆到表达载体上，利用表达筛选和测序验证相结合的方法挑选正确的基因，并在大肠杆菌中进行了人源化单链抗体基因的ＩＰＴＧ诱导表达。结果：构建     

小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体的表达与纯化

目的：表达并纯化小鼠及人源化鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体,并初步分析比较两者的体外生物活性。方法;经ＤＮＡ重组的构建重组表达质粒,经ＩＰＴＧ诱导,在大肠杆菌中高表达两种单链抗体,用８ｍｏｌ／Ｌ尿素溶解包涵体后经ＩＭＡＣ纯化表达产物,并用凝血酶切除Ｎ端融合的（Ｈｉｓ）６,纯化的表达产物经复性后ＥＬＩＳＡ检测其活性,结果：两种单链抗体在大肠杆菌中表达量占全菌蛋白的５０％以上,经变性,纯化后纯度可达９７％     

抗A型肉毒毒素人源单链抗体的表达、纯化及结合活性分析

目的：实现特异性抗A型肉毒毒素人源单链抗体(ScFv)的表达与纯化，并进行结合活性分析．。方法：克隆单链抗体基因ScFv(VH-Linker-Vk)，利用pET22b表达载体构建重组表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG化学诱导，固相亲和层析纯化蛋白，ELISA测定其特异结合活性。结果：pET22b可稳定表达人源单链抗体基因，表达产物占全茵蛋白的25％，表达蛋白全部以包涵体形式存在于胞内。经IMAC纯化，蛋白纯度大于95％。竞争性ELISA测定结果表明，重组抗毒素在体外具有良好的活性，可竞争肉毒马血清与肉毒毒素结合。结论：采用原核表达系统可实现抗A型肉毒毒素人源单链抗体的高效表达，重组人源单链抗体具有抗原特异结合活性。     

人源抗HIV—1整合酶单链抗体基因的构建及表达

获得人源抗ＨＩＶ－１整合酶单链抗体基因并在大肠杆菌及细胞中进行表达。方法：从人的抗ＨＩＶ－１整合酶的Ｆａｂ抗体基因片段中通过ＰＣＲ扩出此抗体的重链可变区和轻链可变区基因,经一弹性连接肽连接构建成人源抗ＨＩＶ－１整合酶的单链抗体基因。     

抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究

目的 制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究。方法以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白为固相抗原,利用抗原抗体亲和性结合的原理,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过3轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验(ELISA)和DNA序列分析,获得HCV核心蛋白的人源单链抗体;用该抗体对7721转染全长HCV cDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明,制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合;免疫组化结果表明,该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原,与正常肝细胞无交叉反应。结论此法制备单链抗体方法简便,周期短,可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段。     

抗地高辛人源小分子抗体的获取

目的 从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛抗体,并构建双体抗体.方法 以固相化的地高辛对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,3～4轮后挑取克隆用酶联免疫吸附测定方法鉴定其特异性,对抗地高辛阳性抗体克隆进行DNA指纹分析及测序分析.选取活性好的克隆进行改造,构建双体抗体.结果 在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象,获得了4株可与地高辛特异性结合的人源抗体,经DNA指纹分析及测序分析证明为不同克隆基因,阳性克隆的可变区基因轻链均属于λ第一亚群,重链分别属于第三和第四亚群.选取4号克隆进行基因改造,构建双体抗体表达载体,获得了活性较好的双体抗体.结论 利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗地高辛抗体,并改造成应用前景较好的双体抗体,可能为临床诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源抗体.     

鼠抗人纤维蛋白单链抗体—低分子量尿激酶融合蛋白在？…

目的;构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶融合蛋白,并在中国仓鼠卵巢细胞（ＣＨＯ）中高效表达。方法：应用重组ＤＮＡ技术,将编码尿激酶原信号肽的ＤＮＡ片段,与鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶基因融合在一起,并插入真核表达载体ｐＭＪＫ３中,构建成重组质粒ｐＭＪＫ３Ｄ。通过细胞电击穿孔法,将该重组质中粒转染到中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶基因缺陷株中,转染细胞经选择培养基筛选。     

新型重组人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体的制备及活性分析

目的：利用大肠杆菌表达新型人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体ScFv,并验证其活性。方法：采用基因融合获得ScFv基因,构建重组表达质粒pET-22b（＋）-ScFv,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达。结果：Western印迹显示目的蛋白表达正确,表达产物以包涵体形式存在,经Ni-NTA柱纯化和体外复性,获得纯度达90%的ScFv蛋白。ELISA结果显示在PBS及人血清中ScFv的结合稳定性有所提高,流式细胞术证明目的蛋白能靶向结合狂犬病毒,通过中和效价测定实验测得ScFv的中和效价为40 U/mg。结论：成功利用原核表达系统实现了对人源抗GPRV ScFv的表达,并且具有一定的中和活性。     

PE38与人源化抗肝癌单链抗体重组免疫毒素的构建及表达

目的：构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体（hscFv)原核表达载体，对其产物作初步鉴定，为肝癌的导向治疗奠定基础。方法：采用分子克隆技术，PCR法扩增PE38基因片段，克隆人GST－融合蛋白表达载体pGEX-4T-1-hscFv中，重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确，受IPTG诱导表达后，SDS－PAGE及Westem blot分析GST融合蛋白结果。结果：成功构建免疫毒素表达载体pGEX-4T-1-hscFv-PE38（以下简称pGEXh-PE38);SDS-PAGE清晰显示Mr为90000的目的蛋白条带，光密度薄层扫描提示表达量为11％，Western blot在相同位置显示蛋白印迹，证实载体构建及表达均正确。结论：利用基因重组技术，在原核细胞中表达重组免疫毒素hscFv-PE38，为尝试肝癌治疗试验的一条有效途径。     

二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体-突变体人论著TNFα融合基因在CHO(dhf)细胞中的表达

目的 :提高抗肝癌靶向人肿瘤坏死因子 (hScFv2 5 hTNFα)的稳定性和杀伤活性 ,构建二硫键稳定的抗肝癌人源化单链抗体 突变体人TNFα融合基因 (ds ScFv hTNFα) ,并在CHO细胞中表达。方法 :常规构建ds ScFv hTNFα融合基因 ,并克隆入真核表达载体pCI(dhfr1) ,磷酸钙共沉淀法转染中国仓鼠卵巢细胞株 (CHO dhfr ) ,甲氨蝶呤 (MTX)高压筛选高表达细胞株 ,免疫荧光染色和MTT法检测重组蛋白的抗体和突变体hTNFα的双重活性。结果 :目的基因在CHO(dhfr )中获得了表达 ,表达产物具有抗体和突变体hTNFα的双重活性 ,且稳定性得到大幅度提高 ,达到 4℃放置 4个月活性无明显下降。结论 :抗肝癌人源化ds ScFv hTNFα融合基因在CHO细胞中获得功能性表达 ,为进一步的临床应用研究奠定了基础。     

人源性热休克蛋白70在大肠杆菌中的表达及鉴定

为在大肠杆菌中表达人源性热休克蛋白70（HSP70）的基因，以质粒为模板，采用PCR方法进行扩增，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收大小约1.96kb的片段；回收片段经T－A克隆法克隆到pUCm-T载体上，并进行DNA测序；将目的基因片段从pUCm-T载体上酶切后，亚克隆到表达载体pET-21a( )上，将重组质粒pET-21a( )/HSP转化大肠杆菌，经IPTG诱导后，收集细菌，菌体裂解后进行SDS－PAGE及Western blot检测。结果表明，应用PCR方法扩增出约1.96kb的目的片段，序列测定结果证实，扩增的HSP70基因序列与GeneBank中HSP70 cDNA序列一致；经EcoR I Xho I酶切及PCR鉴定证实，HSP70基因成功地克隆到原核表达载体pET-21a( )上，转入重组质粒的大肠杆菌经IPTG诱导后，进行SDS－PAGE，发现在分子量为72000处有表达量明显增多的蛋白条带，Western blot证实其为目的的条带。表明在大肠杆菌中已成功地表达了HSP70基因。     

肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定

目的构建编码肿瘤相关抗原MART-1融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定。方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定。通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用。结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符。Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合。His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ。结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b-MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性。     

二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体与人嗜酸性细胞神经毒素重组免疫毒素融合基因的构建及表达

目的：构建二硫键稳定的人源化抗肝癌单链抗体(hdsFv)与人嗜酸性细胞神经毒素(hEnS)融合基因原核表达载体，并在大肠杆菌中表达。方法：利用RCR的方法扩增hEDN基因，克隆人含抗肝癌hdsFv基因的TIH原核表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)plyS后，以IPTG诱导融合蛋白表达。表达产物用SDS-PACE及Westen-blot分析及鉴定。结果：成功构建了抗肝癌HdsFv-hEDN融合基因原核表达载体；SDS-PACE和wbsten—blot分析显示，诱导表达产物出现一条Mr约为45．0KD的新生蛋白带，表达量占菌体总蛋白量的x％，主要以包涵体形式存在。结论：抗肝癌hdsFv—hEDN重组免疫毒素融合基因的成功构建及表达，为其进一步进行肝癌的导向治疗研究奠定了基础。     

人源性角质细胞生长因子(KGF)的克隆及其表达分析

目的：克隆出正确的人源性角质细胞生长因子（KGF）并探讨影响其表达的因素。方法：应用RT－PCR技术克隆出KGF基因，并用pBV220表达质粒对其进行表达，然后用RNAdraw对其RNA进行分析。结果：带有信号肽的KGF基因在pBV220中表达量为10％左右，而去掉信号肽的KGF基因在pBV220中表达量估计只有1％－2％；利用RNAdraw分析的结果表明前者RNA前端没有形成茎环结构，而后者则形成了茎环结构，结论：KGF基因在细菌中表达量较低，信号肽是影响其表达量的重要因素。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1的克隆及原核表达

目的 对应用酵母双杂交技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白1(HBEBP1)进行克隆,并诱导其在大肠埃希菌BL21中的表达.方法 应用反转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得HBEBP1基因片段,连接到pGEM-T载体,双酶切鉴定及测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达以获得HBEBP1融合蛋白,并通过SDS-PAGE及Western blot证实融合蛋白的特异性.结果 RT-PCR扩增获得大小为372bp的HBEBP1基因片段,插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导后,成功获得大小约为33kD的重组蛋白,Western blot证实其具有良好的特异性.结论 构建了pET-32a( )-HBEBP1原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21中诱导表达了HBEBP1融合蛋白,为研究HBEBP1蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.     

类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因的克隆表达及表达产物抗原性鉴定

目的：克隆表达类鼻疽伯克霍尔德菌外膜蛋白Omp38,并对重组Omp38（rOmp38）蛋白的抗原性进行鉴定。方法：应用PCR技术对类鼻疽伯克霍尔德菌Omp38基因进行特异性扩增,将扩增产物克隆入表达载体pET-28a（＋）。重组表达载体经鉴定后,对重组蛋白进行诱导表达纯化,利用Western印迹对重组蛋白的抗原性进行鉴定。结果与结论：构建了pET-28a/Omp38重组表达载体,Omp38基因得到高效表达,Western印迹显示rOmp38蛋白具有较好的抗原性。     

慢性髓系白血病bcr—abl融合基因在真核细胞中的表达

克隆慢性髓系白血病（CML）融合基因bcr-abl融合位点周围的cDNA序列,构建重组真核表达载体并表达于p815细胞,探索bcr-abl基因免疫治疗CML的可行性,设计两条引物扩增bcr-abl融合位点周围468bp的cDNA,测序正确后,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1通过电穿法转染至p815细胞中,应用G418筛选阳性细胞克隆,在含10％FCS的RPMI1640中常规培养,收集细胞进行RT－PCR鉴定。结果PCR扩增出了可用于基因免疫的位于bcr-abl融合基因位点周围的468bp的cDNA,序列测定除第448位碱基C突变为T外其余序列均正确,构建了重组真核表达载体,并用电穿孔法将其转染p815细胞,RT－PCR法检测到该细胞系有bcr-ablmRNA水平的表达。     

纤连蛋白的分段表达及与乙肝表面抗原相互作用研究

目的:克隆纤连蛋白(fibronectin)各功能区域基因,在大肠杆菌中表达以筛选与HBsAg相互作用的区域.方法:将纤连蛋白分成7个片段,设计引物,利用RT-PCR从HepG2.2.15中扩增出相应的PCR产物,连接到表达载体pGEX4T-1中,用IPTG诱导目的蛋白在E.coli中表达,通过Western印迹分析对表达产物进行鉴定.融合蛋白纯化后制备蛋白芯片,与HBsAg杂交,筛选纤连蛋白中与HBsAg相互作用的区域.结果:经RT-PCR从HepG2.2.15中扩增到各结构域片段的cDNA,序列分析均正确;SDS-PAGE分析表明,各结构域片段的可溶性表达产物均占细菌可溶性蛋白的10%以上;Western印迹分析提示,诱导表达产物可与GST单抗发生特异性反应.经制备蛋白芯片并杂交,发现片段FN1、FN2信号最强.结论:成功地表达了纤连蛋白各片段,蛋白芯片杂交结果显示纤连蛋白可能是通过Ⅱ型肝素结合区及其羰基端(c端)与HBsAg相互作用.     

乳腺生长抑制因子mammastatin表位抗原的克隆表达及初步血清学测定

目的:获得重组乳腺生长抑制因子(mammastatin)表位抗原蛋白,制备抗血清,以测定正常人及乳腺癌患者血清中mammastatin存在水平.方法:用BioSun生物软件对 mammastatin氨基酸序列进行分析,确定表位序列,PCR逐步延伸法合成表位基因,构建pBVIL1-mammastatin和pBVIL6-mammastatin表达质粒,转化于大肠杆菌HB101中进行表达,经纯化后免疫大耳白兔,制备抗血清,用双抗体夹心法检测乳腺癌及正常人的血清.结果:重组 mammastatin抗原在大肠杆菌中获得了高效表达,并获得了兔多抗血清.用双抗体夹心法检测,显示95例正常对照血清mammastatin表达水平显著高于95例乳腺癌(平均D值,正常组0.261,乳腺癌组0.135,Wilcoxon秩和检验P=0.000<0.01,差异显著).结论:正常人血清中乳腺生长抑制因子mammastatin 存在水平显著高于乳腺癌患者.     

组蛋白甲基转移酶SET7的原核表达及纯化鉴定

目的：原核表达并纯化组蛋白甲基转移酶 SET7。方法以乳腺文库为模板,PCR 扩增 SET7基因,克隆到 pGEX-KG 载体,构建 pGEX-KG-SET7;经酶切鉴定后转化进行小量诱导,通过 SDS-PAGE 检测融合蛋白 GST-SET7的纯化效果。结果DNA 测序结果表明,pGEX-KG-SET7原核表达载体构建成功。SDS-PAGE 检测显示获得相对分子质量为72×103的融合蛋白。结论纯化得到原核表达的 GST-SET7融合蛋白,为进一步研究 SET7在乳腺癌中的功能奠定了基础。