逆转肿瘤多药耐药的MRP1siRNA序列筛选研究

目的 筛选有效的MRP1 siRNA 序列,为RNAi 的体内外研究提供依据.方法 利用Dharmacon 公司的RNA 在线工具,设计了4 对针对MRP1 基因不同区域的siRNA 序列,分别转染至U251 等三种肿瘤细胞,采用荧光转染试剂观察转染效率;采用RT-PCR 和Western blot 检测MRP1 mR...     

胶质瘤多药耐药细胞株U251/TMZ的生物学特性

目的探讨胶质瘤U251／替莫唑胺（TMZ）多药耐药细胞株的生物学特性。方法采用TMZ间歇浓度梯度递增法诱导建立胶质瘤多药耐药细胞株U251／TMZ,光镜观察细胞形态,细胞计数计算倍增时间,四甲基偶氮唑蓝法检测耐药指数,流式细胞仪检测细胞周期,逆转录-PCR法检测多药耐药性1（MDRl）、Bcl-2、多药耐药相关蛋白5（MRP5）、肺耐药相关蛋白1（LRPl）等mRNA表达。结果胶质瘤耐药细胞株U251／TMZ对TMZ、依托泊苷、硫酸长春新碱、环磷酰胺、阿霉素的耐药指数分别为4．39、3．61、2．64、2．00、1．63;细胞周期结果显示U251／TMZ细胞系较U251亲本细胞系G0/G1期和s期明显减少（P〈0．05）,GfM期明显增多（P〈0．05）;U251／TMZ倍增时间[（14．64＋1．98）h1较亲本细胞系u251[（10．26＋1．03）h1明显延长（P〈0．05）;U251／TMZ耐药细胞株MDRl、Bcl-2、MRP5、LRPl等mRNA表达均较亲本细胞系U251明显上调。结论间歇TMZ浓度递增法可成功建立人脑胶质瘤U251多药耐药系,MDRl、Bcl-2、MRP5、LRPl的表达明显上调可能与耐药性形成有关。     

胶质瘤细胞多药耐药研究进展

肿瘤细胞产生的多药耐药性是胶质瘤化疗的主要障碍。本文重点探讨了胶质瘤多药耐药的发生机制,逆转方法以及近年来的研究进展。     

癫痫与多药耐药基因

在过去的20年中，尽管不断有新的抗癫痫药(AEDs)投入临床应用，但仍有30％左右的癫痫患者对AEDs不敏感，而成为难治性癫痫。耐人寻味的是，通常如果患者对一种AED耐受，他往往也对其它的AEDs不敏感，即使这些AEDs的作用途径、结构不同。这就使得认为患者对AEDs交叉耐药的原因是由于引起癫痫发作的机制不同的说法令人怀疑，而倾向于认为有一种共同的机制影响了AEDs的作用。因为这种现象与肿瘤化疗、部分感染性疾病以及器官移植中出现的多药耐药(multidrug resistance)现象相似，故而人们猜测引起肿瘤耐药的机制可能在癫痫的耐药中也有类似存在。     

原肌球蛋白1与胶质瘤放射敏感性的体外研究

目的 研究原肌球蛋白1(tropomyosin 1,TPM1)与胶质瘤U251细胞放射抵抗性之间的关系,为进一步寻找提高胶质瘤的放射敏感性的可能靶点提供理论依据。方法 转染shRNA-TPM1(pc DNA3. 1-TPM1)抑制(诱导) U251和RR-U251细胞的TPM1表达。各组细胞进行放射治疗后,采用MTT法、划痕实验、侵袭实验、流式细胞术分别检测U251(RR-U251)细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡能力。用Western Blot检测TPM1蛋白表达水平,进而观察各组细胞放射敏感性的变化。结果 与U251细胞相比,RR-U251细胞的TPM1蛋白表达水平明显下降(P 0. 01)。各组细胞进行放射治疗后,与对照组相比,沉默TPM1的RR-U251和U251细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著提高,细胞凋亡率降低(均P 0. 05)。TPM1基因过表达时逆转了这一现象。结论 TPM1可提高胶质瘤U251细胞的放射敏感性。TPM1与胶质瘤细胞的放射抵抗机制有关,其可能是改善胶质瘤放射敏感性的潜在靶点。     

脑胶质瘤多药耐药与逆转问题研究进展

肿瘤细胞对化疗药物的内在性和获得性多药耐药(multidrug resistance,MDR)是化疗失败的主要原因。研究和克服肿瘤的耐药,即逆转MDR的方法是当前肿瘤研究中的热点,也是临床化疗中亟待解决的问题。本文就近年来,有关MDR机制及逆转问题的研究文献综述如下。     

逆转大鼠胶质瘤细胞耐药性MRP1-SiRNA的筛选实验

目的拟筛选出能逆转大鼠胶质瘤多药耐药细胞株C6／VP16对依托泊苷耐药性的多药耐药相关蛋白1基因小干扰RNA（MRP1-siRNA）。方法人工合成4对靶向MRP1的siRNA分别为siRNA1、siRNA2、siRNA3和siRNA4,以脂质体2000作为载体;以6-羧基荧光素标记转染siRNA的c6细胞评价转染效率;采用逆转录-PCR和免疫印迹分别检测MRP1mRNA和蛋白的表达。细胞计数盒-8试剂盒检测转染前后依托泊苷对肿瘤细胞的半生长抑制浓度（IC50）。结果与siRNA1、siRNA4相比,siRNA2、siRNA3对MRP1基因的抑制作用更明显。转染siRNA2前后,依托泊苷对C6细胞的半生长抑制浓度分别为（0．873±0．0462）、（0．0927±0．039）ug/ul,两者相较差异显著（P〈0．05）。结论siRNA2、siRNA3可以有效抑制MRP1基因的表达,并能逆转肿瘤细胞对依托泊苷的耐药性。     

sLRIG1与胶质瘤耐药细胞株化疗敏感性的关系

目的 探讨可溶性多亮氨酸重复区免疫球蛋白样蛋白1（sLRIG1）与胶质瘤耐药细胞株化疗敏感性之间的关系。方法 浓度梯度递增法建立多药耐药细胞株U251/VP16;CCK-8法检测sLRIG1对U251细胞的抑制率,确定sLRIG1对U251细胞的最佳作用时间及适宜浓度;CCK-8法检测加入sLRIG1前后三种化疗药（依托泊苷、硫酸长春新碱、替莫唑胺）作用于U251/VP16的抑制率变化。结果 成功建立多药耐药细胞株U251/VP16;sLRIG1对U251细胞的最佳作用时间为30 min,适宜浓度范围为100~200 ng/ml;sLRIG1对U251/VP16的抑制率为（23.76±0.02）%;依托泊苷、硫酸长春新碱、替莫唑胺对U251/VP16的抑制率分别为（9.79±0.08）%、（16.71±0.06）%、（27.14±0.09）%;而在加入sLRIG1后抑制率则分别为（20.34±0.03）%、（31.52±0.07）%、（35.21±0.05）%,加入sLRIG1前后三种化疗药的抑制率差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 sLRIG1不仅自身能抑制胶质瘤细胞生长,对耐药胶质瘤细胞的化疗也有增敏作用。     

神经胶质瘤C6/VP16多药耐药细胞株的建立

目的建立神经胶质瘤C6细胞对依托泊苷(VP16)耐药细胞株C6/VP16,探讨其耐药的可能机制。方法采用浓度递增和短期大剂量药物诱导相结合的方法建立大鼠C6/VP16耐药细胞株;光镜下观察C6/VP16细胞株的形态学变化;细胞计数试剂盒-8检测C6/VP16细胞株对VP16、阿霉素(ADM)、长春新碱(VCR)、环磷酰胺(CTX)、替莫唑胺(TMZ)的耐药敏感性;westernblot检测多药耐药相关蛋白1(MRP1)的表达量变化。结果经过65代诱导培养,成功建立可操作的、重复性好的C6/VP16耐药细胞株。C6亲代细胞形态规则、大小均一,生长迅速,紧密生长,每2～3d传代;C6/VP16细胞株,突起增多,生长周期受抑制,生长变缓,每10～12d传代。VP16、TMZ、CTX、ADM和VCR作用C6亲代细胞的半生长抑制浓度(IC50)分别为(0.105±0.043)、(27.284±0.529)、(5.800±0.317)、(6.636±0.315)和(19.146±0.526)μg/ml,而作用C6/VP16细胞株的IC50分别为(0.943±0.052)、(33.251±0.288)、(32.943±0.215)、(35.251±0.126)和(35.604±0.426)μg/ml;VP16、CTX和ADM作用C6/VP16细胞株IC50较C6亲代细胞差异显著(P<0.05)。C6/VP16细胞株MRP1的表达量较亲代C6细胞明显增加(P<0.05)。结论 C6/VP16细胞株对ADM和CTX存在明显交叉耐药,而对TMZ和VCR无明显交叉耐药;多药耐药性是多种机制相互作用的结果,MRP1可能参与其中。     

反义寡核苷酸逆转大鼠胶质瘤细胞多药耐药性的实验研究

目的探讨针对多药耐药基因(MDR-1)上特异位点的反义寡核苷酸对体外培养的大鼠胶质瘤细胞多药耐药性的逆转作用。方法根据MDR-1基因的碱基序列设计合成硫代修饰的寡核苷酸,通过阳离子脂质体介导转染胶质瘤耐药细胞,应用流式细胞仪、RT-PCR等方法,对转染后的耐药细胞进行P-170、MDR-1mRNA水平的检测;用MTT法对转染后的细胞进行化疗药物敏感性试验,评价寡核苷酸对多药耐药性的逆转效果。结果流式细胞结果显示转染后胶质瘤耐药细胞P-170表达明显低于转染前(P<0.05);RT-PCR可见转染后细胞的MDR-1mRNA水平减低;药物敏感性试验显示反义寡核苷酸转染后胶质瘤耐药细胞对化疗药物的敏感性增强(P<0.05),含有脂质体的转染体系组对化疗药物的敏感性显著高于不含脂质体的转染体系组(P<0.01)。结论特异序列的反义寡核苷酸能够明显抑制大鼠胶质瘤细胞的P-170表达和减低MDR-1mRNA水平,进而对胶质瘤细胞的多药耐药性产生明显的逆转作用;应用阳离子脂质体作为转染载体可显著提高转染效率。     

硼中子俘获疗法诱导U251胶质瘤细胞凋亡

目的研究硼中子俘获疗法（BNCT）能否诱导体外培养的U251细胞发生凋亡，并探讨其诱导细胞凋亡的机制。方法采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法绘制细胞生长曲线，应用光镜、荧光显微镜、透射电子显微镜观察BNCT后细胞形态改变；使用流式细胞仪检测细胞凋亡率；利用细胞克隆形成实验分析细胞存活分数；用免疫组织化学方法检测相关蛋白表达的变化。结果在体外试验中BNCT对U251细胞的杀伤力强，并观察到了典型的细胞凋亡改变，4、8Gy照射后48h流式细胞仪检测，细胞凋亡率分别为60．2％、80．6％。在凋亡过程中，p53蛋白表达明显增高，而bcl-2蛋白表达下调。结论BNCT可诱导U251细胞发生凋亡，其机制可能与p53基因表达上调及bcl-2基因表达下调有关。     

人脑胶质瘤细胞多药耐药性的形成及其耐药特性的研究

目的探讨人脑胶质瘤细胞多药耐药性（ＭＤＲ）的形成规律及其耐药特性。方法采用长春新碱（ＶＣＲ）在体外对人脑胶质瘤ＢＴ３２５细胞持续诱导获得了表现为ＭＤＲ特征的人脑胶质瘤细胞模型．以ＭＴＴ法测定胶质瘤细胞增殖,透射电镜行超微结构研究,通过流式细胞仪,检测培养的胶质瘤细胞与３２例术后胶质瘤新鲜组织标本中Ｐ－糖蛋白的表达。结果耐药的胶质瘤细胞ＢＴ３２５／ＶＣＲ对长春新碱的耐受程度为其亲本细胞的２４倍,对阿霉素、威猛交叉耐药,对５－氟脲嘧啶敏感。透射电镜下见ＢＴ３２５／ＶＣＲ细胞常染色质明显,线粒体丰富,粗面内质网增多。研究表明ＢＴ３２５／ＶＣＲ表现为Ｐ－糖蛋白介导的典型ＭＤＲ。胶质瘤新鲜组织标本中,Ｐ－糖蛋白表达阳性率为３７５％（１２／３２）,同肿瘤的恶性程度呈正相关（Ｐ＜０．０１）。结论长春新碱能够诱导人脑胶质瘤细胞产生Ｐ－糖蛋白介导的典型ＭＤＲ。胶质瘤中多药耐药基因产物Ｐ－糖蛋白表达的阳性率同肿瘤的恶性程度呈正相关。应用流式细胞仅能早期发现耐药细胞,具有临床推广价值。     

内皮抑素抑制胶质瘤多药耐药细胞株GL15细胞磷酸糖蛋白的表达及其意义

目的 研究内皮抑素对阿霉素(ADM)诱导的大鼠胶质瘤多药耐药细胞株GL15(GL15/ADM)细胞磷酸糖蛋白(P-gp)表达的抑制作用,探讨其对胶质瘤肿瘤耐药的影响.方法 将内皮抑素质粒转染胶质瘤耐药细胞,应用免疫印迹法、荧光分光光度计和流式细胞术分别检测转染后6,12,24,48 h不同时间段P-gp表达水平及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的活性和细胞凋亡率.结果 转染后6 h即可发现P-gp表达水平活性明显降低(P<0.05),且随转染后时间的延长而递减;转染后6h即可发现caspase-3活性明显上升(P<0.05),且随时间的延长而递增;转染后6、12、24、48 h肿瘤细胞凋亡率上升,并与非转染组间有极显著性差异(P<0.01).结论 内皮抑素能通过上调Caspase-3的活性,明显抑制胶质瘤耐药细胞中P-gp表达水平和促进肿瘤细胞凋亡,有助于提高胶质瘤的综合治疗效果.     

TRAIL腺病毒增强胶质瘤对顺铂的化疗敏感性研究

目的 探讨TRAIL腺病毒增强胶质瘤对顺铂的化疗敏感性.方法 制备TRAIL腺病毒,转染胶质瘤U251,流式细胞仪和MTT法检测顺铂作用于U251细胞后各组细胞的凋亡率和增殖率.结果 本研究成功将腺病毒转染进胶质瘤U251细胞,其转染率为82.1%.TRAIL腺病毒转染胶质瘤U251 后,细胞凋亡率增加为(34.2±5.8),%细胞生长缓慢,基本上处于抑制状态.结论 TRAIL腺病毒能显著增强U251细胞对顺铂的敏感性,为胶质瘤的基因治疗提供了理论依据.

Abstract：

Objective To investigate the effect of adenovirus TRAIL on the sensitivity of glioma cells to DDP chemotherapy. Method The adenovirus TRAIL was prepared and transduced into U251 glioma cells. After DDP treatment, the apoptosis and viability of glioma cells were analyzed by FCM and MTT assays. Results The adenovirus could transduce into U251 cell with the efficiency of 82. 1 %. After adenovirus TRAIL transduction, the apoptosis rate of glioma cells was increased to ( 34. 2 ± 5. 8) % , and the cell proliferation was inhibited after DDP treatment Conclusions Adenovirus TRAIL could increase the apoptosis and sensitivity of glioma cells to chemotherapy,which may povide an ideal strategy for glioma cell gene theray.     

Evidence for a constitutive, verapamil-sensitive, non-P-glycoprotein multidrug resistance phenotype in malignant glioma that is unaltered by radiochemotherapy in vivo

Human malignant gliomas are commonly resistant to chemotherapy. Here, we examined the role of the multidrug resistance (mdr) mechanism in the chemoresistance of these tumors, using a twofold approach: (i) by assessing a possible mdr phenotype before and after chronic drug exposure of glioma cells in vitro, and (ii) by assessing the modulation of expression of the mdr-associated P-glycoprotein (Pgp) using radiotherapy and serial cycles of chemotherapy in human glioblastoma patients in vivo. T98G, and to a lesser degree, LN-229 human malignant glioma cells exhibit a constitutive mdr phenotype as determined by the modulation of dye transport and by the augmentation of chemosensitivity by the mdr antagonist, verapamil. Thus, coexposure to verapamil enhances the cytotoxicity of vincristine, doxorubicin and VM26 in T98G cells and that of vincristine in LN-229 cells. Chronic exposure of the cells to low concentrations of vincristine and doxorubicin, but not VM26, topotecan or BCNU, moderately enhances the mdr-like phenotype, as assessed by drug expulsion assays. However, chronic exposure to increasing drug concentrations does not significantly alter the sensitivity to the respective drugs. These data are consistent with a constitutive, but not drug-inducible, mdr-like drug resistance in glioma cells in vitro. Immunocytochemical analysis of human malignant gliomas in vivo reveals that Pgp expression is more abundant in endothelial cells within the gliomas, than in the glioma cells proper. Importantly, Pgp expression is unaltered by radiochemotherapy, assessed by comparative immunocytochemistry of glioma specimens obtained serially before and after radiochemotherapy. We conclude that (i) glioma cells exhibit constitutive mdr-like drug resistance that is not significantly altered by chronic drug exposure in vitro; (ii) endothelial cells may play an important role in Pgp-mediated drug resistance of gliomas in vivo; (iii) radiotherapy and repeated chemotherapy cycles do not modulate Pgp expression in human malignant gliomas in vivo; (iv) there is preliminary evidence for a non-Pgp, verapamil-sensitive drug transport activity in glioma cells. Received: 17 May 1999 / Revised, accepted: 16 August 1999