不同氧浓度下结肠癌细胞缺氧诱导因子-1α表达及糖酵解的差异

目的观察不同氧浓度下结肠癌细胞株SW480中缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor HIF)-1α、糖酵解限速酶表达的差异及细胞培养上清液中乳酸浓度的变化。方法将传代培养的结肠癌细胞置于不同氧浓度的环境中培养12小时,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和western-blot法检测HIF-1αmRNA和蛋白表达水平;RT-PCR和western-blot法检测常氧和缺氧状态下结肠癌细胞糖酵解限速酶葡萄糖转运蛋白(glucose transporter 1,GLUT-1)、乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A,LDH-A)基因的表达。比色法测定结肠癌细胞上清液中的乳酸浓度。结果随着培养环境氧浓度下降,结肠癌细胞中HIF-1α表达逐步增加(P0.05),糖酵解限速酶GLUT-1和LDH-A表达逐步增加(P0.05),结肠癌细胞培养上清液中乳酸浓度逐步增高(P0.05)。结论低氧环境可以上调结肠癌细胞中HIF-1α和GLUT-1、LDH-A的表达,以及细胞培养上清液中乳酸浓度。随着氧浓度下降,差异有统计学意义(P0.05)。低氧环境下HIF-1α上调可促进结肠癌细胞的增殖。     

缺氧诱导对人结肠癌SW480细胞缺氧诱导因子-1α和Survivin基因表达的影响

目的 构建缺氧诱导模型和观察缺氧对人结肠癌SW480细胞系缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和Survivin基因表达的影响。方法 利用氯化钴（CoCl2）构建缺氧诱导模型；利用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）分别测定CoCl2缺氧诱导与SW480细胞HIF—1α和Survivin基因mRNA表达的时效关系（0、2、4、8、24h）和量效关系（0、50、100、150、200／μmol／L）。结果HIF-1α和Survivin基因mRNA表达与氯化钴浓度呈明显的剂量依赖关系；HIF-1α基因表达随诱导时间的延长而逐渐增强，4h亚组出现一个表达高峰，Survivin基因在缺氧诱导4h呈现表达最高峰；HIF-1α与survivin基因mRNA的表达在缺氧诱导量效关系（r=0．521，P＜0．05）和时效关系（r=0．693，P＜0．05）中均呈显著正相关。结论 缺氧可以诱导HIF—1α和Survivin基因的表达增加；HIF—1α与Survivin基因的表达均呈显著相关，提示Survivin基因可能与HIF—1α存在某种调控关系并在缺氧抗凋亡机制中发挥作用。     

薯蓣皂甙元通过miR-145-5p/KLF5/HIF-1α轴抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的探究薯蓣皂甙元对结直肠癌细胞的影响及其可能的作用机制。方法体外培养人结直肠癌细胞SW480和人正常结肠上皮细胞CCD-841CoN,对数期生长的SW480细胞分组进行转染和慢病毒感染;RT-PCR检测SW480细胞中miR-145-5p表达、KLF5和HIF-1α mRNA表达;Western blotting检测细胞中KLF5和HIF-1α蛋白表达;CCK-8检测细胞活力;细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;荧光素酶报告实验检测miR-145-5p对KLF5表达的调控作用。结果与正常组相比,癌细胞组中KLF5和HIF-1α的mRNA和蛋白表达均显著上调(P0.05),miR-145-5p 表达显著下调(P0.05);与常氧组相比,缺氧组细胞中KLF5、HIF-1α的mRNA和蛋白表达均显著上调(P0.05);薯蓣皂甙元(10、20、40、80、160 μmol/L)可抑制SW480细胞活力(P0.05);与对照组相比,薯蓣皂甙元组SW480细胞中KLF5和HIF-1α的mRNA和蛋白表达、细胞克隆数、迁移和侵袭细胞数均显著下调(P0.05),上调KLF5可逆转薯蓣皂甙元对SW480细胞的作用,上调HIF-1α的表达(P0.05);miR-145-5p靶向调控KLF5;与对照组相比,薯蓣皂甙元组miR-145-5p 表达显著上调(P0.05),KLF5蛋白表达下调(P0.05);与薯蓣皂甙元组相比,薯蓣皂甙元组+miR-145-5p抑制物组miR-145-5p 表达显著下调(P0.05),KLF5蛋白表达上调(P0.05)。结论薯蓣皂甙元通过miR-145-5p/KLF5/HIF-1α轴抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭。     

微环境乏氧上调胰腺癌细胞HIF-1α表达并诱导凋亡

目的 探讨CoCl2诱导缺氧对体外培养的胰腺癌PC-2细胞缺氧诱导因子-1(HIF-1α)表达变化及诱导凋亡作用.方法 以50、100、150、200μmol/L不同浓度CoCl2处理PC-2细胞模拟肿瘤体内乏氧模型,MTT法检测不同浓度、不同时间CoCl2处理后的PC-2细胞生长情况;透射电镜下观察乏氧微环境作用下的PC-2细胞超微结构的改变;免疫细胞化学和RT-PCR方法 检测乏氧微环境对PC-2细胞HIF-1α基因表达的影响;AnnexinV-FITC/PI双标记染色,流式细胞术检测肿瘤细胞凋亡情况.结果 不同浓度CoCl2对胰腺癌PC-2细胞生长曲线有不同程度的改变,对数生长期和平台期提前,对数期缩短.随着CoCl2浓度增加,曲线越趋于低平.透射电镜下可见线粒体肿胀,染色质边集等凋亡早期表现,少见凋亡小体.免疫细胞化学和RT-PCR结果 显示,化学缺氧剂COCl2模拟的乏氧微环境可引起胰腺癌PC-2细胞HIF-1α表达的上调;流式细胞仪检测结果 显示,正常对照组、100、150、200 μmol/L CoCl2不同浓度组PC-2细胞凋亡率分别为10.77%、34.32%、40.17%和52.30%.结论 CoCl2对胰腺癌PC-2细胞具有一定的凋亡诱导作用,同时也缩短了细胞正常的生长期,细胞形态发生相应改变,可能与上调HIF-1α的表达有关.     

BMI-1和MMP-9在结肠癌细胞中的表达及意义

目的探讨BMI-1mRNA和MMP-9mRNA在结肠癌细胞中的表达及其意义。方法采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测结肠癌细胞和人正常结肠平滑肌细胞中BMI-1mRNA和MMP-9mRNA的表达,分析二者的关系。结果在结肠癌SW620和LoVo细胞株中,BMI-1mRNA的表达量明显高于结肠癌细胞株SW480细胞和人正常结肠平滑肌细胞(P0.05);SW620和LoVo结肠癌细胞中MMP-9mRNA的表达亦明显高于SW480细胞和人正常结肠平滑肌细胞(P0.05)。在结肠癌细胞中BMI-1mRNA的表达与MMP-9mRNA的表达呈正相关(r=0.966,P0.05)。结论作为原癌基因,BMI-1可用作反映结肠癌细胞侵袭力的生物学指标。     

结直肠癌中缺氧诱导因子-1α与Survivin表达的关系

目的 探讨结肠癌LS174T细胞及结直肠腺癌组织中缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达及与Survivin的关系.方法 构建靶向HIF-1α的质粒pSilence-2.1-U6-siRNA并鉴定,采用阳离子脂质体转染法将其转染LS174T细胞,低氧培养24h,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测siRNA对HIF-1α的抑制作用.Western blot检测Survivin蛋白表达.应用免疫组织化学方法检测69例人结直肠腺癌组织中HIF-1α、Survivin蛋白的表达.结果 LS174T细胞转染靶向HIF-1α的siRNA表达载体后,HIF-1α、Survivin表达显著下降.69例结直肠腺癌组织中,HIF-1α、Survivin蛋白的阳性表达率为66.7％ (46/69)和56.5％ (39/69).腺癌组HIF-1α蛋白阳性表达率显著高于腺瘤组(P＜0.01).Ⅲ期腺癌HIF-1α蛋白表达显著高于Ⅰ～Ⅱ患者(P＜0.05).结直肠腺癌中HIF-1α表达与Survivin显著正相关.结论 结直肠腺癌发展过程中HIF-1α与Survivin表达密切相关.     

转染胸苷磷酸化酶基因对5'-脱氧氟脲苷抗结肠癌细胞株活性的影响

目的 探讨人结肠癌细胞系SW480和LOVO细胞株转染胸苷磷酸化酶(TP)基因后转化5′-脱氧氟脲苷(5′-DFUR)为氟尿嘧啶(5-FU)能力的变化及5′-DFUR抗癌细胞株活性的变化.方法 构建包含TP cDNA的真核表达载体,用慢病毒包装后转染结肠癌细胞株SW480和LOVO.转染5代后以免疫荧光法和流式细胞技术检测转染效率;RT-PCR和Western blot法分别检测2株细胞的TP mRNA和TP蛋白表达.然后以高效液相色谱法(HPLC)检测2株细胞转染前后转化5′-DFUR为5-FU的量;MTT法检测5′-DFUR对2株细胞转染前后半数抑制浓度(IC50).结果 转染TP基因后SW480-TP与LOVO-TP 5代细胞转染效率稳定在95％左右.2株转染细胞的TP mRNA表达分别比野生型细胞增加(695±172)倍(t=-7.00,P=0.002)和(282±87)倍(t=-5.61,P=0.030),Western blot显示TP蛋白表达也明显增强.转染后的SW480-TP与LOVO-TP在培养基中分别使5′-DFUR转化为5-FU的量增加(t=19.406 ～66.921,P＜0.01).5′-DFUR对SW480的IC50由(1641±53) μmol/L降至(587±17) μmol/L(t=-32.59,P＜0.01);对LOVO的IC50由(1607±57) μmol/L降至(1088±89) μmol/L(t=-8.52,P＜0.01).结论 慢病毒载体能够高效地将TP cDNA转染至人结肠癌细胞SW480和LOVO并稳定传代,转染后2株细胞的TP mRNA和TP蛋白表达明显增高,使5′-DFUR转化为5-FU的量增加,对结肠癌细胞株SW480和LOVO的抑制作用增强.     

干扰素α2a对人结肠癌细胞胸苷磷酸化酶表达和5′-脱氧氟尿苷抗癌活性的影响

目的 探讨干扰素-α2a(IFN-α2a)对人结肠癌细胞胸苷磷酸化酶(TP)mRNA表达水平以及5′-脱氧氟尿苷(5′-DFUR)和氟尿嘧啶(5-FU)抗癌效应的影响.方法 不同剂量IFN-α2a分别处理人结肠癌细胞LOVO和SW480,荧光定量PCR检测TP mRNA表达水平;MTT法检测联合应用IFN-α2a前后5-FU和5′-DFUR对LOVO和SW480抑制作用的半数有效浓度(IC50)变化情况.结果 与0 U/ml IFN-α2a浓度组相比,500 U/ml及5000 U/ml组可明显上调LOVO和SW480细胞TPmRNA表达(P＜0.01),而50 U/ml则对上述两种细胞TPmRNA表达水平无明显影响(P＞0.05).联合应用浓度为20 U/ml的IFN-α2a后,5-FU对LOVO和SW480细胞的IC50无明显改变(P＞0.05),但5′-DFUR的IC50则明显降低(P＜0.05).结论 IFN-α2a能上调结肠癌细胞TP mRNA的表达水平,并可使5′-DFUR对结肠癌细胞的IC50明显下降,而对5-FU则无明显影响.     

CoCl2模拟缺氧环境下肝癌细胞生物钟基因表达的变化

目的：观察氯化钴（CoCl2）模拟缺氧环境下肝癌细胞生物钟基因表达的变化。 方法：以不同浓度（0,50,100,200 μmol/L）的CoCl2处理肝癌细胞系Huh7细胞24 h后,用Western blot检测细胞中缺氧诱导因子1α（HIF-1α）的蛋白表达,real-time PCR检测细胞中生物钟基因CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、CKIε的mRNA表达。 结果：Western blot结果显示,未处理Huh7细胞（0 μmol/L CoCl2）无HIF-1α表达,而各浓度的CoCl2处理后,Huh7细胞出现明显的HIF-1α的蛋白表达,且表达水平随CoCl2浓度增加而升高。real-time PCR结果显示,CoCl2处理后的Huh7细胞中Bmal1、Per1、Cry2的mRNA水平明显上调,而CLOCK、Cry1、Per2、Per3、CKIε的mRNA水平明显下调,且均呈CoCl2浓度依赖性（均P<0.05）。 结论：缺氧微环境可能是引起肝癌细胞生物钟基因表达异常的原因之一。

     

吉非替尼对结肠癌细胞的生长抑制作用与PTEN表达的关系

目的 观察表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼对人结肠癌细胞的生长抑制作用,探讨这种作用与结肠癌细胞PTEN表达的关系.方法 应用体外药物敏感实验检测吉非替尼对6种人结肠癌细胞系的生长抑制作用;应用RT-PCR检测不同结肠癌细胞中PTEN mRNA水平;应用Western blot 检测结肠癌细胞中PTEN蛋白表达水平.结果 吉非替尼在体外对6种结肠癌细胞系的生长抑制作用差异很大(F=325.51,P＜0.05).吉非替尼作用浓度为1 μmol/L时,Lovo细胞系抑制率达34%,对吉非替尼最为敏感,其半量抑制浓度(IC50)＜10 μmol/L;HT29和SW480为中度敏感(10μmol/L＜IC50＜100 μmol/L);而HCT116、LS174T和SW620不敏感,其IC50＞100 μmol/L.各个细胞系中PTEN mRNA和PTEN蛋白均有表达.结论 吉非替尼对结肠癌细胞的生长抑制作用与PTEN mRNA和PTEN蛋白表达水平无明显相关,即PTEN表达状态还不能作为预测结肠癌对吉非替尼敏感性的可靠生物学指标.     

Role of prolyl hydroxylases 2 in the cellular response to hypoxia activated autophagy in human renal epithelial cell model

Objective To test the hypothesis of autophagy that silencing PHD2 gene could increase hypoxia inducible factor (HIF)-1α levels in the renal medulla and attenuate hypoxia injury in cultured human renal proximal tubular epithelial cell (HK-2) under cobalt dichloride (CoCl2) exposure. Methods HK-2 cells were harvested at hour 0, 6, 12, 24, 36 and 48 after exposure to CoCl2 (200 μmol/L). The role of HIF/PHD pathway in CoCl2-induced cell apoptosis/autophagy was studied by employing small-interfering RNA (siRNA). Dynamic profiles of apoptosis markers (Bax, Bcl-xl) and autophagy marker (LC3) of HK-2 cells within 48 h after exposing to CoCl2 were recorded. Alamar Blue assay was used for quantitative analysis of cellular growth and viability. Electron microscopy analysis was employed to evaluate the changes in autophagic structures. Results The protein expressions of PHD2 were gradually increased after exposing to CoCl2 (200 μmol/L), with statistics significance at 24 h and reached the peak at 48 h (both P＜0.01). PHD2 siRNA reduced PHD2 levels by＞60% and significantly increased HIF-1α protein levels (P＜0.01), but had little effect on HIF-2α. The protein expression of Bcl-xl was significantly up-regulated, while the level of Bax and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ were down-regulated in PHD2 siRNA group (all P＜0.01), compared with the negative control group. Meanwhile, either 3-Methyladenine (an autophagy inhibitor) treatment or PHD2 knockdown rescued cell death and increased cell viability through autophagy inactivation. The ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰand the quantity of autophagosomes were decreased, and the cell ultrastructure was also relatively intacter than the negative control group. Of interest, co-administration of HIF-1α siRNA with PHD2 siRNA abrogated renoprotective effect conveyed by PHD2 siRNA alone, suggesting that activation of endogenous HIF-1α-dependent pathways mediated the autophagy inactivation effects of PHD2 silencing. Conclusions Direct inhibition of PHD2 promotes renal epithelia cell survival against CoCl2-induced cell apoptosis/autophagy. Activation of the HIF-1α signaling pathway is required to reduce apoptosis and autophagy via up-regulating the expression of Bcl-xl protein.     

Effects of irbesartan on the expression of hypoxia-induced factor 1α and connective tissue growth factor in the kidney of unilateral ureteral ligation operation model rats

Objective To investigate the expression of hypoxia-induced factor 1α (HIF-1α)and connective tissue growth factor (CTGF) in the kidneys of unilateral ureteral ligation operation (UUO)model rats and the effect of irbesartan on the expression. Methods Thirty healthy adult male SD rats were randomly divided into 3 groups: sham operation group (n＝10), UUO group (n＝10) and irbesartan group (n＝10, UUO rats treated with irbesartan by lavage 2 days before operation). The rats in sham group and UUO group were treated with equal normal saline by lavage. Renal function, histopathological changes, urinary protein of 24 hours in rats at week 2 were measured. In situ hybridization and Western blotting were applied to measure the expression of HIF-1α and CTGF. Results At week 2, the levels of BUN, Scr and the expressions of HIF-1α and CTGF were significantly increased in UUO group compared with those in sham group (all P＜0.01). There was significant positive correlation between HIF-1α mRNA and CTGF mRNA (r＝0.697, P＜0.01). Compared with UUO group, the levels of urine protein and Scr were significantly decreased [(103.44±8.76) mg/24 h vs (278.23±26.15) mg/24 h, P＜0.01; (109.15±3.93) μmol/L vs (185.04±13.45) μmol/L P＜0.01], and renal tubulointerstitial lesion area became smaller (0.28±0.02 vs 0.51±0.05, P＜0.01) in irbesartan group. The expression of HIF-1α mRNA and protein was also significantly decreased after the treatment of irbesartan (all P＜0.01). Conclusions The expressions of HIF-1α and CTGF in UUO rats increase significantly. Irbesartan can improve renal fibrosis through down-regulating the expression of HIF-1α and CTGF.     

环氧化酶2抑制剂对结肠癌细胞中BCL-3及细胞周期蛋白D1表达的影响

目的 探讨环氧化酶2（COX-2）抑制剂对BCL-3基因及其靶向基因细胞周期蛋白1（cyclin D1）的转录和表达的影响.方法 实验组分别以25、50、100及200 μmol/L的NS398（COX-2抑制剂）处理结肠癌SW480细胞48 h或72 h;对照组以不含NS398的溶媒处理SW480细胞.采用RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学染色方法分别从mRNA和蛋白水平检测各组细胞中BCL-3和cyclin D1的表达情况.结果 各组细胞处理48 h后,与对照组相比,实验组BCL-3和cyclin D1 mRNA水平下降,呈剂量依赖性;而蛋白水平则无明显差异（P〉0.05）.处理72 h后,与对照组相比,实验组BCL-3和cyclin D1蛋白水平下降,亦呈现剂量依赖性.当NS398浓度达到100 μmol/L时,其BCL-3 mRNA及蛋白表达水平与对照组比较差异即有统计学意义（P〈0.01）：当NS398浓度达到50 μmol/L时,其cyclin D1 mRNA及蛋白表达水平与对照组比较差异即有统计学意义（P〈0.05）.结论 结肠癌细胞株SW480中有BCL-3的表达.COX-2抑制剂NS398可从基因及蛋白水平对BCL-3及cyclinD1进行抑制,并呈剂量依赖性.NS398可能通过BCL-3而抑制cyclinD1.     

尾型同源盒转录因子2 shRNA慢病毒表达载体的构建及其转染对结肠癌细胞生长的影响

目的:构建尾型同源盒转录因子2(CDX2)shRNA慢病毒表达载体,并观察下调CDX2基因其对结肠癌细胞生长的影响。方法:根据CDX2 m RNA序列设计shRNA,并合成shRNA的互补序列,通过连接酶链接到GV248载体上,用测序方法鉴定阳性克隆后,将构建好的慢病毒表达载体与慢病毒包装载体用Lpofectamine 2000共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒并用稀释法进行滴度测定。将CDX2 shRNA慢病毒表达载体转染人结肠癌细胞SW480、HT29后,分别用q RT-PCR和Western blot检测CDX2 m RNA及蛋白水平,CCK8实验及克隆形成实验检测细胞增殖能力。结果:DNA测序鉴定证实,CDX2 shRNA表达片段正确插入GV248载体中,包装后的病毒滴度为1×109TU/m L;SW480、HT29细胞转染CDX2-shRNA慢病毒表达载体后,CDX2 mRNA及蛋白表达水平均明显降低(均P0.05),但细胞的增殖与克隆形成能力无明显改变(均P0.05)。结论:成功构建shRNA慢病毒表达载体,其转染结肠癌细胞后能有效地抑制CDX2基因的表达;下调CDX2基因对人结肠癌细胞的增殖无明显影响。     

反义缺氧诱导因子-1α对胰腺癌细胞BxPC-3化疗敏感性的影响

目的： 观察反义缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)对胰腺癌细胞BxPC-3化疗敏感性的影响。方法：实验分组：（1）缺氧条件下(0.5% O2)体外培养4h，未转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3细胞设为缺氧对照组；（2）常氧条件下体外培养，未转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3 细胞设为常氧对照组；（3）缺氧条件下(0.5% O2)体外培养4h，稳定转染反义HIF-1α质粒的BxPC-3细胞设为实验组。采用逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)和免疫印迹(Western Blot)检测各组的HIF-1α和survivin表达情况。 流式细胞术和MTT比色法检测不同剂量的化疗药物(5-氟尿嘧啶、阿霉素、吉西他宾)对各组的凋亡率和生长抑制率的影响。 结果：实验组HIF-1α和survivin的表达明显降低 (P<0.05)，与对照组相比，实验组的凋亡率、抑制率与剂量成正比，高剂量引起高抑制(P<0.05)。 结论：反义HIF-1α可能通过阻断survivin的表达而增强胰腺癌对化疗的敏感性。据此可望通过阻断HIF-1α的表达为胰腺癌基因治疗提供一种新途径。     

Effect of telmisartan on the expression of urate transporter protein in the renal tubule epithelial cells

Objective To explore the protective effect and underlying mechanism of telmisartan on hyperuricemic nephropathy. Methods (1)High level of uric acid (600 μmol/L) and telmisartan in different concentrations (10nmol/L, 100 nmol/L, 1000 nmol/L, 10000 nmol/L) were added to renal tubule epithelial cells and cultured for 48 h, the expression of UAT, TGF-β1 and α-SMA were detected by Real-time PCR, RT-PCR, Western blotting or cell immunofluorescence. (2) Wister rats were randomly divided into normal control group(Con), high uric acid group (HU), and telmisartan treatment group (Tel). Four weeks later, Scr, BUN and serum uric acid of the rats were detected. The expression of UAT in rat kidney was detected by Western blotting. Results (1)In vitro, compared to control group, high uric acid (600 μmol/L) inhibited the expression of UAT (P＜0.01), and the inhibition could be alleviated by telmisartan; Telmisartan inhibited the upregulation of TGF-β1 and α-SMA induced by high uric acid(all P＜0.05); (2)In vivo, compared to high uric acid group rats, telmisartan group rats had significantly reduced serum uric acid levels (189.9 μmol/L vs 204.5 μmol/L, P＜0.05), upregulated UAT and downregulated TGF-β1 expression in rat kidney (all P＜0.05). Conclusion Telmisartan significantly inhibits the upregulation of TGF-β1 and α-SMA induced by uricemia, which may prevent kidney from fibrosis. The protect effect of telmisartan may be related to the upregulation of UAT.