醛固酮及其受体拮抗剂对肾小球系膜细胞增殖的影响

目的 研究醛固酮(ALD)及其受体拮抗剂螺内酯(SPI)对大鼠肾小球系膜细胞增殖和细胞周期的影响.方法 应用MTT法检测系膜细胞增殖,用流式细胞术检测细胞周期各时相的百分比.结果 MTT结果显示,ALD抑制肾小球系膜细胞增殖(与对照组比较P＜0.01),并具有一定的剂量依赖和时间依赖性,SPI能拮抗其作用.流式细胞术结果显示,ALD作用于系膜细胞24 h,G1期细胞数增多,S期细胞数减少(与对照组比较,P＜0.01).结论 ALD通过调控细胞周期抑制肾小球系膜细胞增殖.     

重组人红细胞生成素影响系膜细胞生长与纤维连接蛋白表达的实验研究

目的通过观察重组人红细胞生成素(rhEPO)影响肾小球系膜细胞生长,以及表达纤维连接蛋白(FN)的作用,探讨应用rhEPO后对肾组织可能产生的生物学效应。方法培养的大鼠肾小球系膜细胞在不同剂量(1、10、100和1000U.ml-1)rhEPO的作用下,细胞计数和蛋白浓度测定评价细胞是否肥大;蛋白免疫印迹法检测FN蛋白表达的变化。♂CD-1小鼠接受单次(n=8)腹腔注射rhEPO(1000 U.kg-1体重),注射后24 h处死并分离肾小球以检测其FN表达量的变化。结果①rhEPO能够增加系膜细胞蛋白质的含量,以100 U.ml-1工作浓度rhEPO的作用效果最为明显[(1.269±0.382)μg.10-3cellsvs(0.247±0.058)μg.10-3cells;P<0.01)];②rhEPO能够刺激系膜细胞上调FN蛋白的表达,与对照组相比,100 U.ml-1的rhEPO明显增加系膜细胞FN蛋白的表达,随着rhEPO浓度的增加,系膜细胞FN的表达进一步增多,呈剂量依赖性;③间接免疫荧光检测可见rhEPO作用系膜细胞24 h后,可见大量呈网状、条索状,甚至板块状FN蛋白分布于细胞间隙;④单次腹腔注射rhEPO后24 h的肾小球FN增加。结论rhEPO可以造成系膜细胞的肥大,同时诱导系膜细胞增加FN合成,提示rhEPO可以通过影响系膜细胞的功能造成肾小球功能的异常。     

螺内酯对高糖及醛固酮诱导的肾小球系膜细胞CTGF表达的影响

目的通过研究螺内酯(SPI)对高糖(HG)和醛固酮(ALD)刺激的体外培养的大鼠肾小球系膜细胞(MsC)结缔组织生长因子(CTGF)mRNA和蛋白表达的影响,探讨SPI的肾脏保护机制。方法将大鼠MsC分为:A组,正常对照组(5.6 mmol.L-1)、B组,高糖组(30 mmol.L-1)、C组,HG+SPI干预组(10-9,10-8,10-7mol.L-1)、D组,ALD组(5.6 mmol.L-1葡萄糖+10-7mol.L-1ALD)、E组,ALD+SPI干预组(10-9,10-8,10-7mol.L-1)。酶联免疫法检测上清液中CTGF蛋白的含量,RT-RCR法检测MsC CTGFmRNA表达。结果①正常糖浓度的培养基中可测到MsCCTGF mRNA和蛋白表达;②与A组比较,B组和D组MsCCTGF mRNA表达和上清液CTGF水平明显升高,差异有显著性;③与B组比较,C组中经10-8,10-7mol.L-1SPI干预MsC CTGF mRNA表达和上清液CTGF水平明显降低,P<0.05,但10-9mol.L-1SPI干预MsC CTGF mRNA表达和上清液CTGF水平无变化,P>0.05;④与D组比较,E组MsCCTGFmRNA表达和上清液CTGF水平明显降低,P<0.05。结论 SPI可抑制HG和ALD刺激的大鼠MsC CTGFmRNA表达和蛋白合成,该作用可能是其抗纤维化和防治肾损害的机制之一。     

LOX-1在ox-LDL诱导人肾小球系膜细胞表达TGF-β1中的作用

为探讨血凝素样氧化低密度氧化脂蛋白受体(LOX-1)在氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人肾小球系膜细胞(HGMCs)表达TGF-β1中的作用,在体外培养人肾小球系膜细胞,在不同的时间加入不同浓度的ox-LDL及LOX-1阻滞性抗体JTX92,以酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养液中转化生长因子(TGF-β1)浓度,用半定量RT-PCR检测细胞LOX-1和TGF-β1mRNA表达,用Western印迹检测细胞LOX-1和TGF-β1蛋白合成。结果表明,ox-LDL以时间和浓度依赖的方式增加LOX-1表达的同时,也以时间和浓度依赖的方式增加细胞内TGF-β1mRNA表达、蛋白合成及培养液中TGF-β1的含量;JTX92(10μg/ml)可以明显抑制LOX-1和TGF-β1的表达(两者P<0·01)。结论:ox-LDL通过激活LOX-1调节HGMCs TGF-β1基因表达、蛋白的合成与分泌。     

大鼠肾小球系膜细胞合成分泌醛固酮并表达醛固酮受体研究

目的探讨培养的大鼠肾小球系膜细胞能够自身合成分泌醛固酮及存在醛固酮受体的可能性。方法应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测培养的大鼠肾小球系膜细胞表达醛固酮合成酶基因CYP11B2 mRNA及醛固酮受体mRNA;用放射免疫分析法测定肾小球系膜细胞培养上清中醛固酮的含量。结果大鼠肾小球系膜细胞表达醛固酮合成酶基因CYP11B2 mRNA及醛固酮受体mRNA,且细胞培养上清中能够检测到醛固酮。结论大鼠肾小球系膜细胞自身能够合成分泌醛固酮并存在醛固酮受体。     

缬沙坦对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞氧化应激水平的影响

目的观察缬沙坦对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞氧化应激水平的影响。方法高糖(20 mmol.L-1)体外培养大鼠肾小球系膜细胞,不同浓度缬沙坦(10-7,10-6,10-5和10-4mol.L-1)干预,以RT-PCR技术检测细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亚基p22phox的mRNA表达的变化,并以DCFH-DA和HE标记细胞内活性氧(ROS),流式细胞术检测细胞内ROS相对浓度。结果高糖时间相关性诱导系膜细胞超氧阴离子(.O2)与过氧化氢(H2O2)明显升高,并引起p22phox的mRNA表达显著上调,缬沙坦对高糖引起系膜细胞p22phox的mRNA表达增加有下调作用,明显降低细胞内.O2和H2O2浓度,并呈浓度依赖性。结论缬沙坦抑制高糖引起肾小球系膜细胞氧化应激可能和下调p22phox的mRNA表达有关。     

罗格列酮对高糖培养肾小球系膜细胞胞外基质产生及降解的影响

目的:探讨罗格列酮(rosiglitazone maleate)对糖尿病肾病的保护机制。方法:大鼠肾小球系膜细胞分别培养在正常糖浓度(5.5mmol/L),高糖浓度(25mmol/L)及25mmol/L葡萄糖+20μmol/L罗格列酮的培养液中。CCK-8测定系膜细胞增殖;ELISA法检测培养上清液Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)、纤维连接蛋白(FN)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1);明胶酶谱法检测培养上清液基质金属蛋白酶-2,9(MMP-2,9)的活性。结果:高糖组系膜细胞较正常对照组出现增殖增加,合成基质蛋白Col-Ⅳ、FN增多;MMP-2及MMP-9活性下降;TIMP-1含量增加;TGF-β1分泌增加。与高糖组比较,罗格列酮干预后能逆转上述变化。结论:罗格列酮能抑制高糖培养的系膜细胞增殖,减少胞外基质合成,增加胞外基质的降解。     

■牛儿基■牛儿醇转移酶抑制对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

目的研究1种牛儿基牛儿醇转移酶抑制(GGTI-286)对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响。方法用含有不同浓度的GGTI-286处理被10%胎牛血清(FCS)或血小板源生长因子(PDGF)刺激的大鼠肾小球系膜细胞,应用细胞增殖ELISA系统测定溴化脱氧尿嘧啶核苷进入细胞的量来评估DNA的合成,并测定细胞的数量。用蛋白质印迹法研究GGTI-286对原癌基因(Ras)蛋白和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化的影响。结果GGTI-286对10%FCS或PDGF刺激大鼠肾小球系膜细胞DNA的合成抑制是剂量依赖性,并且能够抑制细胞的生长,应用台盼蓝排除试验,GGTI-286并不改变系膜细胞的存活率。GGTI-286也能够抑制10%FCS或PDGF诱发的肾小球系膜细胞Ras蛋白活动和MAPK的激活。结论GGTI-286通过影响肾小球系膜细胞Ras蛋白活动和MAPK的激活而抑制肾小球系膜细胞增殖,这可能为治疗系膜增殖性肾小球疾病提供1种新的方法。     

极低密度脂蛋白对大鼠系膜细胞分泌FN以及TGFβ1mRNA转录的作用

目的观察极低密度脂蛋白对大鼠系膜细胞分泌FN以及对转化生长因子-β1(TGF-β1)基因转录的作用，进而探讨VLDL对系膜细胞的毒性作用。方法应用ELISA法测定培养细胞上清纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)的分泌；RT—PCR法测定系膜细胞TGF-β1的基因表达情况。结果在一定的时间范围内(6～24h)，VLDL可以以时问、剂量依赖性的关系促进系膜细胞分泌FN。随着刺激时间的增加，TGF-β1。mRNA转录逐渐增强；VLDL浓度在0～500μg／ml之间时，TGF-β1 mRNA转录随着VLDL浓度的增加而逐渐增强。结论VLDL可以促进系膜细胞分泌FN以及TGF-β1的基因转录，提示VLDL具有肾脏毒性。     

洛伐他汀对大鼠肾系膜细胞增殖和细胞外基质分泌的影响

目的 研究洛伐他汀对肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质分泌的影响和机制。方法 用不同浓度的洛伐他汀及甲羟戊酸和拢牛儿基牻牛儿醇焦磷酸盐(GGPP)处理大鼠肾小球系膜细胞,测定溴化脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)的整合来评估DNA的合成,ELISA法测定上清液中胶原Ⅳ、Ⅰ和纤维连结蛋白含量,用蛋白质印迹法分析原癌基因蛋白(Ras)活动及丝裂原活化蛋白激酶的活化。结果洛伐他汀抑制血小板源生长因子(PDGF)引起BrdU整合进入系膜细胞和细胞外基质胶原Ⅳ、Ⅰ和纤维连结蛋白的分泌,同时也抑制PDGF引起的Ras活动及丝裂原活化蛋白激酶的活化,甲羟戊酸和GGPP能部分拮抗洛伐他汀的上述抑制作用。结论 洛伐他汀可显著抑制系膜细胞增殖及细胞外基质的分泌,其机制可能通过抑制甲羟戊酸及其代谢产物的合成而阻止Ras活动及丝裂原活化蛋白激酶的活化,影响信号传导有关。     

生松素对AngⅡ诱导的大鼠肾小球系膜细胞细胞外基质合成的影响及其机制研究

目的 探讨生松素（Pb）对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的大鼠肾小球系膜细胞细胞外基质（ECM）合成的影响及其机制。方法 以大鼠肾小球系膜细胞为研究对象,将实验分为以下5组：正常对照（NC）组、1×10-6mol/L AngⅡ（Ng）组、1×10-6 mol/L AngⅡ+1‰ DMSO（Ng-D）组、 1×10-6 mol/L AngⅡ+30 μmol/L Pb（Ng-Pb）组、1×10-6 mol/L AngⅡ+10 μmol/L缬沙坦（Ng-Val）组。分别在干预12、24、48 h搜集细胞和上清液,采用Western blot检测Ⅳ型胶原（ColⅣ）、纤连蛋白（FN）、转化生长因子-β（ 1 TGF-β1 ）、Smad3、磷酸化Smad3（p-Smad3）、核因子κB（NF-κB）、磷酸化NF-κB（pNF-κB）的蛋白水平,酶联免疫吸附法（ELISA）检测上清液中肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）水平,实时荧光定量PCR（qPCR）检测细胞中ColⅣ、FN、TGF-β1、TNF-α、IL-6的mRNA水平。结果 （1）Pb对 AngⅡ诱导的系膜细胞合成ECM的影响：与NC组相比,Ng组细胞内ColⅣ和FN的蛋白质和mRNA 水平升高（P＜0.05）,而Ng-Pb组和Ng-Val组细胞内ColⅣ和FN的蛋白质和mRNA水平均较Ng组降低（P＜0.05）。（2）Pb对TGF-β1/Smad3通路的 影响：与NC组相比,Ng组细胞内TGF-β1的蛋白质和mRNA水平增加,p-Smad3/Smad3水平增加（ P＜0.05）,而Ng-Pb组和Ng-Val组细胞内TGF-β1的蛋白质和mRNA水平以及p-Smad3/Smad3水平均较Ng组降低（P＜0.05）。（3）Pb对NF-κb介导的促炎症因子产生的影响：与NC组相比,Ng组 p-NF-κb/NF-κb水平增加,IL-6和TNF-α的蛋白质和mRNA水平增加（P＜0.05）,而Ng-Pb组和 Ng-Val组p-NF-κb/NF-κb水平以及IL-6和TNF- α的蛋白质和mRNA水平均较Ng组降低（P＜0.05）。结论 Pb可能通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路和NF-κb介导的促炎症因子的产生, 从而抑制AngⅡ诱导的大鼠系膜细胞合成ECM。     

缬沙坦对高糖培养的肾小球系膜细胞p38MAPK传导通路的影响

目的探讨高糖状态下肾小球系膜细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、其上游因子MAPK激酶3/6(MKK3/6)和下游因子cAMP反应元件结合蛋白1(CREB1)的表达以及血管紧张素受体1拮抗剂(AT1Ra)缬沙坦的影响。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,分别给予高糖和缬沙坦干预,采用Western bolt检测MKK3/6、p38 MAPK和CREB1及其磷酸化蛋白的表达,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测系膜细胞内TGF-β1和FN mRNA的表达。放免法测定细胞上清液中纤维连接蛋白(FN)和IV型胶原的含量。MTT法检测缬沙坦在不同时间、不同药物浓度对细胞增殖状态的影响。结果①与低糖对照组相比,高糖组系膜细胞p-p38 MAPK、p-MKK3/6和p-CREB1表达明显上调,TGF-β1和FN mRNA的表达增加,FN和IV型胶原含量增加。②缬沙坦组p-p38 MAPK、p-MKK3/6和p-CREB1的表达明显下调,TGF-β1和FN mRNA的表达降低,同时FN和IV型胶原的含量减少。③MTT法检测显示不同浓度的缬沙坦对细胞增殖状态都有所抑制,并随药物浓度的增加而作用增强。结论缬沙坦抑制肾小球系膜细胞TGF-β1的表达和细胞外基质的分泌可能部分是通过影响p38 MAPK传导通路的激活来实现的。     

非诺贝特及罗格列酮对高糖培养肾小球系膜细胞p38MAPK信号通路调控影响

目的：探讨非诺贝特及罗格列酮对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞（MC）p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号传导通路的影响。方法：大鼠系膜细胞分别培养在正常糖浓度（5．5mmol／L）、高糖浓度（25mmol／L）、25mmol／L葡萄糖＋非诺贝特（FB）100μmol／L及25mmol／L葡萄糖＋罗格列酮（RG）20μmol／L。ELISA法检测培养细胞上清液Ⅳ型胶原（Col-Ⅳ）、纤维连接蛋白（FN）;Phospho—ELISA法检测胞浆及胞核内p38MAPK和磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）蛋白的表达：以及RT-PCR法检测p38MAPK的mRNA的表达。结果：与正常对照组比较,高糖组MC合成基质蛋白Col-Ⅳ、FN增多;胞浆及胞核内P—p38MAPK的表达增加。非诺贝特及罗格列酮干预能使高糖培养系膜细胞合成Col-Ⅳ、FN显著减少,胞核内p-p38MAPK表达显著下调,但对胞浆内p-p38MAPK的表达则无显著影响。各组总p38MAPK蛋白水平及p38MAPK的mRNA表达则没有明显改变。结论：非诺贝特及罗格列酮能够显著下调高糖培养的Mc核内p38MAPK信号传导通路的活化,进而减少胞外基质合成。     

厄贝沙坦对高糖刺激的大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子及膜型基质金属蛋白酶-1表达的影响

目的研究血管紧张素Ⅱ受体1拮抗剂厄贝沙坦对高糖刺激的大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子(CTGF)和膜型基质金属蛋白酶-1(MT1-MMP)表达的影响。方法体外培养的大鼠肾小球系膜细胞,分别给予高糖和厄贝沙坦干预,采用RT-PCR及Western blot法分别检测CTGF和MT1-MMP的mRNA及蛋白的表达,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清中Ⅳ型胶原的含量。结果与对照组相比,高糖组各时间点系膜细胞CTGF表达明显上调,Ⅳ型胶原的分泌增加,且二者随时间持续增高;而MT1-MMP的表达则随时间呈明显下降趋势。厄贝沙坦能够抑制高糖引起的上述变化。结论高糖可诱导肾小球系膜细胞CTGF表达增加,抑制MT1-MMP的表达。厄贝沙坦抑制肾小球系膜细胞基质分泌的作用可能部分通过抑制CTGF,增加MT1-MMP的表达而实现。     

氟伐他汀对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞外基质 p38 MAPK表达的影响?

研究HMG-CoA还原酶抑制剂氟伐他汀 (fluvastatin) 对高糖状态下肾小球系膜细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶 (p38 mitogen-activated protein kinase, p38 MAPK) 及其下游因子cAMP反应元件结合蛋白1 (cAMP response element-binding protein, CREB₁) 表达的影响。采用体外培养大鼠肾小球系膜细胞, 分别给予高糖和氟伐他汀干预, 应用Western blotting检测p38 MAPK和CREB₁及其磷酸化蛋白 (p-p38 MAPK、p-CREB₁)的表达; 逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 检测转化生长因子β₁ (TGF-β₁) 和纤维粘连蛋白 (FN) mRNA的表达; 放射免疫法测定细胞上清液中层连接蛋白 (LN) 和IV型胶原蛋白的含量。结果表明, 与低糖对照组相比, 高糖组的系膜细胞p-p38 MAPK、p-CREB₁表达明显上调, TGF-β₁ mRNA和FN mRNA的表达增加, 细胞上清液中LN和IV型胶原蛋白含量增加。氟伐他汀组的p-p38 MAPK、p-CREB₁表达明显下调, TGF-β₁ mRNA和FN mRNA的表达降低, 同时LN和IV型胶原蛋白的含量减少。因此氟伐他汀抑制肾小球系膜细胞TGF-β₁的表达和细胞外基质的分泌可能部分是通过影响p38 MAPK及其下游因子CREB₁的激活而实现的。     

氟伐他汀对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞CTGF mRNA的影响及其作用机制的研究

目的探讨高糖状态下肾小球系膜细胞中结缔组织生长因子（CTGF）mRNA的表达以及HMG-CoA还原酶抑制剂氟伐他汀对其的影响及作用机制。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,实验分为4组：低糖组（LG组,5.5 mmol/L葡萄糖）;低糖＋甘露醇组（LG＋M组,5.5 mmol/L葡萄糖＋24.5 mmol/L甘露醇）;高糖组（HG组,30 mmol/L葡萄糖）;高糖＋氟伐他汀组（HG＋Flu组,30 mmol/L葡萄糖＋10μmol/L氟伐他汀）。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测CTGF和纤维粘连蛋白（FN）mRNA的表达,Western印迹检测磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶（p-p38 MAPK）及其下游因子cAMP反应元件结合蛋白1（p-CREB1）。结果与LG＋M组相比,HG组系膜细胞增殖明显,p-p38 MAPK、p-CREB1表达明显上调,CTGF和FN mRNA的表达增加。与HG组比较,HG＋Flu组可抑制系膜细胞增殖,p-p38 MAPK、p-CREB1的表达明显下调,CTGF和FN mRNA的表达降低。结论高糖状态下肾小球系膜细胞CTGF mRNA表达增强,p-p38 MAPK和p-CREB1表达明显升高,氟伐他汀抑制肾小球系膜细胞CTGF mRNA和细胞外基质的分泌可能部分是通过影响p38 MAPK及其下游核因子CREB1的激活而实现。     

重楼含药血清对系膜细胞增殖及分泌纤维连接蛋白的影响

目的探讨中药重楼治疗肾小球疾病的作用机制。方法提取大鼠的含药血清作用于体外培养的大鼠系膜细胞(MC),观察重楼对MC增殖及分泌纤维连接蛋白(FN)的影响。结果①CCK-8比色法结果显示:脂多糖(LPS)能促进肾小球MC异常增殖(P<0.01)。重楼各剂量组OD值均较LPS组显著减低(P<0.01);在干预24 h时重楼随着剂量的增加,其OD值逐渐减低,3个剂量组两两比较均有显著性差异(P<0.01或P<0.05)。②ELISA法测定结果显示:重楼各剂量组均能明显抑制FN的分泌(P<0.01);随重楼剂量的增加MC分泌FN的水平呈递减变化,且重楼各剂量组间两两比较均有显著性差异(P<0.01)。③RT-PCR显示FN mRNA在正常组有少量表达,在LPS组其表达量显著增加(P<0.01),重楼各剂量组较LPS组均显著减低(P<0.05)。结论重楼含药血清可抑制MC的异常增生及MC过度分泌FN,此可能是重楼治疗肾小球疾病取得临床疗效的内在机制。     

缬沙坦对高糖培养系膜细胞信号转导和转录活化因子1、3表达的影响

目的探讨高糖状态下肾小球系膜细胞中信号转导和转录活化因子1、3的改变以及血管紧张素受体1拮抗剂(AT1Ra)缬沙坦的影响。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,分别给予高糖和缬沙坦干预,采用W estern印迹检测信号转导和转录活化因子1、3(STAT1、STAT3)及其磷酸化蛋白(p-STAT1、p-STAT3)的表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)和放免法测定细胞上清液中TGF-β1、纤维连接蛋白(F ibronectin,FN)和IV型胶原的含量,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β1mRNA的表达。结果与低糖对照组相比,高糖组系膜细胞p-STAT1和p-STAT3表达明显上调,TGF-β1、FN和IV型胶原含量增加,TGF-β1mRNA的表达增加。缬沙坦组p-STAT1和p-STAT3的表达明显下调,TGF-β1、FN和IV型胶原的含量减少,同时TGF-β1mRNA的表达降低。结论高糖状态下p-STAT1和p-STAT3表达明显升高,缬沙坦抑制肾小球系膜细胞TGF-β1和细胞外基质的分泌可能部分是通过影响STAT1和STAT3的激活而实现。