抗出血性大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗出血性大肠杆菌O157：H7(E．coli O157：H7)特异性单克隆抗体(MAbs)。方法福尔马林灭活的E．coli O157：H7免疫BALB／c小鼠，利用细胞融合技术建立分泌抗E．coli O157：H7 MAbs的杂交瘤细胞株，对配对较好的6株MAbs用ELISA法测定其免疫球蛋白类及亚类，用ELISA法、凝集法和Western blot鉴定MAbs的特异性。结果6株MAbs免疫球蛋白均为小鼠IgM。这些MAbs均能与27个E．coli O157：H7菌株发生凝集反应。与部分弗劳地杆菌发生凝集反应，与11株鼠伤寒沙门氏菌、7株伤寒杆菌、2株痢疾杆菌、致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌、出血性大肠杆菌O26：H11和O111、肠集聚性大肠杆菌、42株非定血清型大肠杆菌、霍乱弧菌O1群和O139群不发生凝集反应；ELISA结果显示6株MAbs与粪链球菌、变形杆菌、粘质沙雷氏菌、肺炎克雷伯杆菌均无交叉反应；ELISA和Western blot结果显示。3株MAbs针对E．coli O157：H7酚相脂多糖。结论6株MAbs具有较高的特异性，有可能用于制备检测E．coli O157：H7的病原检测试剂。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7脂多糖抗原的提取鉴定及间接ELISA法的建立

目的提取并纯化具有强免疫反应性和高特异性的肠出血性大肠杆菌O157∶H7（E.coliO157∶H7）脂多糖（LPS）抗原,并研究其在E.coliO157∶H7 LPS抗体检测中的应用。方法应用热酚水法提取E.coliO157∶H7 LPS抗原,同时收集水相和酚相LPS,并对其产率、纯度及免疫反应性进行分析比较,用酸解法制备O-特异性多糖（O-SP）,并以不同的LPS为包被抗原,建立间接ELISA法检测E.coliO157∶H7 LPS抗体。结果大分子量的E.coliO157∶H7 LPS优先溶于酚相,而水相中含有更多的小分子量LPS,与水相LPS相比酚相LPS具有更高的免疫反应性和纯度,酚相LPS经酸解去脂得到的O-SP具有更高的反应特异性。结论酚相LPS和O-SP都可用于E.coliO157∶H7 LPS抗体的ELISA检测,O-SP具有更高的特异性,是检测E.coliO157∶H7 LPS特异性抗体的理想材料。     

肠出血性大肠杆菌O157：H7实验室诊断技术进展

肠出血性大肠杆菌O157：H7（E．coli O157：H7）是肠出血性大肠杆菌（EHEC）的一个血清型，主要引起人的食源性疾病，以突发性腹痛、腹泻、血便为主要症状，严重时并发肾功能衰竭，病死率高。E．coli O157：H7广泛分布于自然界，在生猪、猪肉、牛及牛肉及其粪便中分离率极高，对公众健康构成严重威胁。因此，早期发现及时治疗和预防是控制该病的关键。E．coli O157：1-17实验室诊断以细菌培养、分离及生化和血清鉴定为主。近年来出现的新型免疫学方法和聚合酶链反应（PCR）对E．coli O157：H7诊断具有较高的敏感性和特异性。本文就E．coli O157：H7检测技术的研究进展综述如下。     

上海市浦东新区肠出血性大肠埃希菌O157：H7的监测研究

目的 了解上海浦东新区腹泻病人、宿主动物肠出血性大肠埃希杆菌(E. coli )O157:H7携带情况以及市售食品的污染状况,为疾病防治工作提供决策依据. 方法 于2003～2006年的5～10月,在设置的监测点与超市采集家禽和腹泻病人粪便及禽畜肉制品;应用免疫磁珠富集,山梨醇麦康凯平板和Chromager O157显色平板分离培养E. coli O157:H7,生化和血清学反应进行鉴定. 结果 E. coli O157:H7阳性率分别为:腹泻病人粪便0.24%,鸡粪2.95%,鸭粪3.83%,家畜肉15.05%,家禽肉2.25%.检出的67株E. coli O157:H7中,仅1株来自腹泻病人的E. coli O157:H7具有毒力基因. 结论 浦东新区腹泻病人、宿主动物及其肉类食品中存在E. coli O157:H7感染或污染,存在E. coli O157:H7感染流行的潜在危险.     

贵州省首次从腹泻病例中检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的 从贵州省1例腹泻病例的粪便标本中分离鉴定O157肠出血性大肠杆菌并对其进行毒力基因检测。方法 收集腹泻病例的粪便标本,mEC肉汤增菌后,采用O157胶体金进行初筛,阳性者增菌液经免疫磁珠富集后进行肠出血性大肠杆菌的分离,对分离株进行系统生化鉴定,O157、H7诊断血清凝集,应用特异性PCR进行rfbE和fliC基因鉴定,以及stx1、stx2、eaeA和hlyA 4种毒力基因检测。结果 腹泻病例粪便标本经mEC肉汤增菌后,检测O157胶体金阳性;增菌液经免疫磁珠富集后培养出可疑菌落,经系统生化鉴定为大肠杆菌,血清型为O157∶H7;PCR检测O抗原特异性rfbE基因和H7特异性fliC基因均阳性;毒力基因eaeA、stx2和hly均阳性,stx1阴性。结论 分离株确诊为肠出血性大肠杆菌O157∶H7,为贵州省腹泻病例中首株该病原体。     

免疫捕获PCR法快速检测大肠埃希氏O157∶H7的研究

目的建立两种免疫捕获PCR法快速检测E.coliO157∶H7,并探讨其灵敏度和特异性。方法运用免疫磁珠集菌(IMS)和抗体包被扩增管(mACT)两种方法富集待测样品中E.coliO157∶H7,再应用巢式PCR法检测编码E.coliO157∶H7O抗原的rfbE基因,对13株E.coliO157菌和10株非E.coliO157菌进行检测。结果应用两种icPCR检测,所有E.coliO157∶H7和E.coliO157NM菌株均为阳性结果,而其它包括与O157抗血清能交叉凝集的菌株检测结果均为阴性;对于含有48×102cfu/ml以上浓度的E.coliO157∶H7菌悬液,两种方法,所有试验管都能检测到特异性扩增;并证实了这两种方法可用于检测鲜牛奶中E.coliO157∶H7,样品中E.coliO157∶H7的含量只要不少于101cfu/ml,经过6小时增菌均能检测出来。结论IMS-icPCR和mACT-icPCR用于检测E.coliO157∶H7,是快速、灵敏且高特异的方法。     

PCR方法在出血性大肠杆菌O157:H7诊断中的应用

自1982年首次在美国引起出血性肠炎爆发以来,肠出血性大肠杆菌O157:H7(entero-hemorrhagic E.coli O157:H7,EHECO157:H7)已经成为世界性的重要的公共卫生和食品安全问题,曾在日本、美国、加拿大等国造成了暴发流行和大规模食物中毒事件.估计目前在美国每年可造成大约70000人感染.     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 TccP基因克隆、表达及其抗原性鉴定

目的克隆表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 Tir细胞骨架偶联蛋白(TccP)基因,并研究其抗原性。方法采用PCR法自EHEC O157∶H7 Sakai菌株基因组扩增TccP基因,构建TccP原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达。表达产物经初步纯化后,免疫新西兰白兔,制备兔抗TccP多克隆抗体。抗体效价及特异性用ELISA法和Western blotting法进行测定和分析。结果从EHEC O157∶H7 Sakai菌株中克隆出了1014bp的TccP基因。构建的重组质粒pET28a-TccP在大肠杆菌中获得了高效表达;以TccP免疫家兔获得了高效价多克隆抗体,Western blotting分析此抗体能与TccP发生特异性抗原抗体反应。结论在大肠杆菌中成功克隆表达了TccP基因,所获TccP具有良好的抗原性,为进一步研究TccP在EHEC O157∶H7致病机制中的作用奠定基础。     

5株产硫化氢大肠杆菌O157的分离鉴定

肠出血性大肠杆菌O157：H7是引起人类出血性肠炎的主要菌型，自1982年在美国首次被分离并确认为食物中毒新型致病菌以来，在世界范围内发生过多次暴发，并造成严重危害。尤其是1996年5～8月日本发生了由E．coli O157：H7引起的人类历史上大规模的暴发流行，引起世界普遍关注。我们自1999年开始开展了大肠杆菌O157：H7的监测，     

出血性大肠杆菌O157主要毒力因子单克隆抗体的制备

目的利用两种抗原制备针对出血性大肠杆菌EHECO157主要毒力因子的特异性单克隆抗体。方法分别用纯化融合蛋白Eae-Stx1/2B和EHECO157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)全菌免疫BALB/C小鼠,通过细胞融合和EHECO157标准株EDL933间接ELISA筛选稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株,纯化抗体并鉴定。结果纯化融合蛋白免疫获得了2株单抗2H9和3B4,EHECO157Δler/stx(pBR322::stx1/2B::eae)免疫获得了1株单抗4H7。2H9、3B4和4H7亚类鉴定分别为lgG2b、lgM和lgM;纯化腹水ELISA效价分别为1∶1.28×105、1∶3.2×104、1∶6.4×104,亲和力常数分别为2.9×106、1.4×106、2.6×105。结论3株单克隆抗体均具有较高特异性,2H9效价和亲和力最高,可作为产志贺毒素EHECO157的检测抗体。     

广西畜禽大肠杆菌O157∶H7流行病学调查

目的为了掌握广西畜禽大肠杆菌O157∶H7的流行病学情况。方法应用细菌分离、生化特性鉴定、血清凝集反应和PCR鉴定等方法在2007-2010年广西200多个畜禽养殖场进行畜禽大肠杆菌O157∶H7的流行病学调查。对采集的2 915份样本进行了大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定、致病性试验、药物敏感试验以及毒力基因检测。有5份样本经细菌培养特性、生化特性、血清凝集反应和PCR鉴定为大肠杆菌O157∶H7,样本细菌分离率为0.17%。小白鼠致病性试验显示分离菌株的毒力各有差别,对小白鼠的致死率在33.4%～100%之间。药敏结果表明分离菌株对阿莫西林、氨苄西林、多粘菌素B、罗红霉素、利福平和林可霉素不敏感。毒力基因的检测结果表明,5株分离菌株携带的毒力基因略有差异,并与其致病性强弱有一定的相关性。结论大肠杆菌O157∶H7主要在猪群传播,具有一定的毒力,对常用抗生素耐药。     

大肠杆菌O157∶H7对氟苯尼考耐药机制的初步研究

目的研究大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)对氟苯尼考耐药性产生的机制。方法本研究采用亚抑菌浓度体外耐药诱导的方法将E.coli O157∶H7诱导成为氟苯尼考高度耐药菌株,采用无抗生素压力下连续传代培养或SDS方法将耐药菌株的氟苯尼考耐药性消除,使用PCR方法检测氟苯尼考耐药基因floR,通过外排泵抑制剂与氟苯尼考联合使用,检测E.coli O157∶H7是否存在对氟苯尼考的主动外排作用。结果经过36代的耐药诱导,敏感菌株对氟苯尼考产生了高度耐药(MIC为256μg/mL)。质粒检测结果显示,耐药诱导菌株出现2个质粒,大小分别约为3 500bp和1 200bp,floR基因位于质粒DNA中。经连续传代培养或SDS法进行耐药消除,耐药诱导菌株对氟苯尼考的敏感性提高,但其质粒和floR基因均未丢失。结论 E.coli O157∶H7氟苯尼考敏感菌和耐药菌均存在对氟苯尼考的质子驱动型外排泵和ATP水解依赖型外排泵主动外排作用。     

肠出血性大肠杆菌O157 LPS单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立能够分泌针对肠出血性大肠杆菌O157∶H7表面抗原的特异性单克隆抗体,以期用于该病原菌的检测。方法以敲除毒力基因的O157突变株F25全菌免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,分别以全菌抗原和热酚水法纯化的O157 LPS抗原用间接ELISA筛选能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,纯化抗体并鉴定。结果建立了稳定分泌抗O157 LPS抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D6,分泌抗体属IgG3亚类,轻链为κ型。腹水抗体ELISA效价达1∶3.2×106。以辛酸/饱和硫酸铵法纯化后抗体效价为1∶1.6×106,亲和常数Ka大于6.14×10-11mol/L。用于协同凝集和间接荧光抗体试验具有良好的特异性。结论该单克隆抗体针对O157的LPS抗原,特异性强,亲和力高,可用于O157的检测或分离鉴定。     

一种快速鉴别牛肉中大肠杆菌O157∶H7检测方法的建立及应用

目的 建立一种快速、准确检测牛肉中大肠杆菌O157∶H7的方法。方法 利用抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体2G5(捕获抗体),酶标单克隆抗体2E3(HRP-2E3,检测抗体),建立可用于检测大肠杆菌O157∶H7的双抗体夹心ELISA方法,同时对反应条件进行优化并对该方法进行评价。 结果 通过优化得到最佳反应条件,单克隆抗体2G5最佳包被浓度为4.48 μg/mL,HRP-2E3最佳检测浓度为19.9 μg/mL。该方法对纯培养菌液最低检出限为 1×10⁵ CFU/mL,具有良好的敏感性,且特异性良好,与其他大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌等均无交叉反应。板内及板间变异系数均小于7%,具有较高的精密度。人工污染牛肉样品增菌8 h后,对大肠杆菌O157∶H7的检出限为1 CFU/25 g。结论 建立的双抗体夹心ELISA检测方法灵敏度、准确度、重复性良好,特异性强,可用于临床实际样品检测。     

肠出血性大肠杆菌生物学特性

肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhage E.Coli,EHEC）是大肠杆菌的一个亚型,EHEC分为157、26、111血清型,主要致病菌株为O157∶H7,可引起感染性腹泻,因能引起人类的出血性肠炎而得名。在1982年一次出血性结肠炎流行中被分离出。大肠杆菌是人和动物肠道中的正常菌群,一般对人无害。它有3种抗原结构,即菌体抗原（又叫O抗原）、包膜抗原（又叫K抗原）和鞭毛抗原（又叫H抗原）。     

肠出血性大肠埃希菌感染的诊治

大肠埃希菌(E.coli)是人类和动物肠道内的正常菌群之一.肠出血性大肠埃希菌(enterohemorrhagic E.Coli,EHEC)是大肠埃希菌的一个亚型,分为157、26、111血清型,主要致病菌株为O157∶H7,可引起严重的腹泻、血便并出现溶血尿毒综合征(haemolytic uraemic syndrome,HUS),是近年来发现的严重危害人类健康的肠道传染病,因能引起人类的出血性肠炎而得名.     

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7环介导恒温扩增快速检测方法的建立与应用

目的肠出血性大肠埃希菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli,EHEC)O157∶H7是一种重要的人畜共患病致病菌,主要通过被污染的食物传播,引起出血性结肠炎,建立其快速检测方法具有重要意义。方法基于EHEC O157∶H7保守的rfbE基因序列,设计4条引物,利用环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP),成功建立了EHEC O157∶H7LAMP快速检测方法 ,60min内即可完成致病菌检测。结果利用该LAMP方法对30种共38株细菌进行检测,所试EHEC O157∶H7均为阳性结果 ,说明该方法具有高度特异性。本方法对纯培养的EHEC O157∶H7检测限为12CFU/mL,污染食品中EHEC O157∶H7的检测限为18CFU/g。实践应用表明,对1121份进出口肉类、奶类制品及人工污染样品等进行检测,检出57份LAMP阳性,与采用AOAC标准检测结果的符合率为100%。结论该LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性。     

浙江省O157大肠杆菌监测及其分子生物学特性

目的了解肠出血性大肠杆菌O157∶H7和其他O157大肠杆菌在浙江省动物、人群中的分布、流行以及PFGE分型、毒力基因携带状况。方法按全国O157∶H7监测方案在5-10月份肠道传染病高发季节,采集全省各地(市)肠道门诊腹泻病人粪便,进行O157大肠杆菌分离培养,并用免疫磁珠分离法对浙江省5个监测点的宿主动物进行O157∶H7分离培养、鉴定,可疑菌株以PCR法检测O157∶H7抗原、志贺样毒素(stx1和stx2)、粘附抹平因子(eaeA)及溶血素(hly)4种毒力基因。用脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis,PFGE)方法进行同源性分析,同时选择14种抗生素进行药敏试验,并将分析结果与本省首株患者粪便中分离的产志贺样毒素的O157∶H7菌株进行比较。结果全省5个监测点2006年共监测动物粪便标本2377份,分离到4株O157∶H7菌株,阳性率为0.17%;同时在绍兴、舟山肠道门诊腹泻病人粪便中分离到2株O157:H?菌株。4株O157∶H7菌株,stx2、Hly、eaeA均阳性,stx1均阴性;2株O157∶H?菌株仅1株携带eaeA毒力基因。脉冲场凝胶电泳分型显示,4株O157∶H7菌株分3个型,除金华地区2006年分离所得2株完全相似外,其它相同地区不同年代分离的O157∶H7菌株及相同年代不同地区分离的O157∶H7菌株则完全不相似。2株O157∶H?菌株1株PF-GE电泳条带降解,另1株与其它O157∶H7菌株电泳条带差异明显。结论浙江省大肠杆菌0157菌株在动物中以携带stx2毒力基因的O157∶H7菌株为主,但在腹泻患者中则以不带志贺样毒素的O157∶H?菌株为主。不同地区分离的O157∶H7菌株PFGE分型差异明显。羊、奶牛是携带stx2毒力基因的O157∶H7大肠杆菌的主要宿主。各级疾控应加强对宿主动物和腹泻病人大肠杆菌O157的分离监测和流行病学调查。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

[目的 ]制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)单克隆抗体 (McAb) ,并对其特异性进行鉴定。[方法 ]用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备McAb ,筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株 ,测定其免疫球蛋白亚类及其效价 ,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。 [结果 ]筛选出 2A5和1H10两株能稳定分泌抗LDHpMcAb的杂交瘤细胞株 ,两株单抗均为IgG2b,2A5和 1H10培养上清的ELISA效价分别为 1∶5 12和 1∶2 5 6 ,腹水效价分别为 1∶2 5 6 0 0和 1∶12 80 0 ,两株单抗与间日疟原虫、红细胞、弓形虫、日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应 ,能识别恶性疟原虫 33kDa的虫源蛋白。 [结论 ]制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗     

福建省家畜,家禽O157大肠杆菌初查

本文检查了7种家畜（包括猪肉砧板）、家禽粪便标本784份。首次从中检出17种O157出血性大肠杆菌，平均检出率为2．17％，其中以猪最高达6．61％．其次为鸡3．64％，鸽子1．25％，还在猪内与砧板上检出此菌。根据检出菌株与O157、H7诊断血清凝集反应及其产生动力的情况将它们分为二类即：O157；H7（8株）及O157：NM（9株）。