登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列原核载体的构建及蛋白表达

目的体外扩增登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E基因部分序列,构建pET28a(+)-ME、pET28a(+)-NE,分析其在E-coli BL21中的表达。方法 PCR方法扩增(DENV-2)M株、NGC株E基因部分序列并构建原核重组载体pET28a(+)-ME、pET28a(+)-NE,将重组载体转化E-coli BL21,IPTG诱导表达,采用镍离子亲和层析的方法纯化目的蛋白并用SDS-PAGE电泳和Western-Blot进行鉴定。结果经双酶切、PCR和测序证实成功构建原核重组载体pET28a+-ME、pET28a(+)-NE,Western-Blot证实成功诱导出目的蛋白,SDS-PAGE电泳证实亲和层析法纯化后得到较高纯度的目的蛋白。结论检测到目的蛋白的表达,经纯化后得到纯度约为90%的目的蛋白,为研究登革Ⅱ型病毒M株、NGC株E蛋白在致病机制方面奠定了一定的基础。     

细胞穿膜肽融合蛋白PEP1-vMIP-Ⅱ促进血管增生研究

 目的 构建细胞穿膜肽PEP-1与vMIP-Ⅱ融合基因的表达质粒,原核表达、纯化并鉴定PEP1-vMIP-Ⅱ融合蛋白,鉴定该蛋白的穿膜功能,研究其对血管增生相关基因表达的影响。方法 将化学合成的细胞穿膜肽PEP1和vMIP-Ⅱ基因克隆到原核表达载体pET15b,构建pET15b-pep-1-vMIP-Ⅱ质粒。表达纯化后,Western-blot 鉴定蛋白,荧光共聚焦显微镜观察融合蛋白的穿膜功能。Real time PCR检测该蛋白作用对HMEC-1细胞内血管增生相关基因表达的改变。结果 DNA测序和酶切结果鉴定了pET15b-PEP1-vMIP-Ⅱ载体构建正确,Western blot鉴定纯化的融合蛋白PEP1-vMIP-Ⅱ与所预测相对分子质量相符。激光共聚焦显微镜检测到该蛋白能够进入细胞,在HMEC-1细胞内上调了促血管增生基因VEGFA和VEGFC的表达。结论 成功构建了pET15b-PEP1-vMIP-Ⅱ载体,表达纯化的PEP1-vMIP-Ⅱ融合蛋白具有穿透细胞膜的功能,且能显著上调促进血管增生基因VEGFA和VEGFC的表达。     

大肠杆菌DNA复制相关蛋白PriC的初步研究

目的：对大肠杆菌DNA复制相关蛋白PriC进行研究。方法：构建重组表达载体pET21a-PriC及pET21a-PriC1-101,并进一步诱导表达纯化。利用Pulldown手段将pET21a-PriC-notag与pET28at-plus-PriB分别转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,诱导表达及共纯化后检测PriC与PriB的相互作用情况。结果：PriC经Ni柱亲和层析纯化获得的蛋白稳定性较差,易沉淀。根据二级结构和蛋白稳定性预测及限制性蛋白酶水解结果,构建了PriC的截短突变蛋白PriC1-101,经Ni亲和层析和superdex75纯化,获得了稳定性较好的蛋白,经Western blot鉴定为目的蛋白。PriC1-101的圆二色谱分析发现其具有较多的α-helix和无规卷曲,这为更好的了解其结构奠定了重要的基础。通过Pulldown手段发现PriC与PriB存在相互作用,并且PriC的稳定性有所提高。结论：PriC蛋白的C-端氨基酸序列是PriC蛋白与PriB蛋白相互作用的主要区域,并对PriC蛋白的稳定性有较大影响。     

基于中西医特异临床指标的系统性红斑狼疮的抗Sm抗体蛋白的研发

目的:为抗Sm抗体的特异性检出,提高中西医对疾病特异诊断,构建SmD1蛋白原核表达载体,并诱导表达。方法:提取Hela细胞总RNA后逆转录为cDNA,将带酶切位点BamH I和Xho I的人SmD1蛋白基因序列进行PCR扩增,经酶切后插入pET41a质粒中,构建pET41a-GST-SmD1-6*His重组表达质粒,转化进入感受态大肠埃希菌OverExpress C41(DE3)中,经过异丙基β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,利用C端的His标签(His-tag)进行Ni-树脂柱亲和层析纯化,SDS-PAGE鉴定重组蛋白表达形式,Western blotting(WB)鉴定重组蛋白的免疫原性,ELISA法鉴定其免疫反应性和特异性,并使用构建好的蛋白进行检测。结果:经PCR扩增得到目的基因,菌落PCR提示重组表达质粒构建成功,经IPTG诱导后pET41a-GST-SmD1-6*His重组蛋白在感受态大肠埃希菌OverExpressC41(DE3)中高效表达,SDS-PAGE显示GST-SmD1-6*His重组蛋白以包涵体形式表达,WB示重组蛋白有足够的免疫原性,能与人血清中的抗Sm抗体发生特异性反应,与常见的自身抗体无交叉反应。且使用复方黄芪颗粒治疗后抗Sm抗体含量有所降低。结论:成功构建中西医特异临床指标的系统性红斑狼疮的抗Sm抗体蛋白,该蛋白具有免疫原性和免疫反应性。可为后续该指标在中西医结合诊断运用中提供高质量的蛋白。     

三七病程相关蛋白PR10-2基因的克隆、表达及功能初步分析

在转录组测序的基础上,采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,从三七主根中分离到三七病程相关蛋白10(pathogensis related protein 10,PR10)基因,命名为PnPR10-2,测序结果表明该序列长465 bp,编码154个氨基酸。氨基酸序列同源性及系统发育树分析发现,PnPR10-2与人参的PR10-2蛋白同源性最高,具有典型的病程相关蛋白Bet v I保守结构域。构建了重组载体pET32a(+)-PnPR10-2,在宿主菌Escherichia coli BL21中诱导表达融合蛋白,优化诱导条件,PnPR10-2融合蛋白在E.coli BL21中以可溶性和包涵体蛋白2种形式大量表达。纯化上清中的重组蛋白,运用纸片法分析纯化重组蛋白的体外抑菌活性,其对三七根腐病病菌腐皮镰刀菌Fusarium solani和坏损柱孢菌Cylindrocarpon destructans具有一定的抑制作用,猜测该基因可能参与了三七抗根腐病的防御反应。     

白木香AsJAZ1基因原核载体的构建与表达

克隆国产沉香基原植物白木香Aquilaria sinensis jasmonate-zim-domain protein(As JAZ1)基因的编码区,构建原核表达载体及诱导重组蛋白的表达,为筛选互作蛋白因子和研究基因功能奠定基础。该实验以白木香叶片中分离的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆到茉莉酸信号转导抑制蛋白基因JAZ(As JAZ1)的编码区全长序列,克隆到原核表达载体p ET-28a上,构建重组原核表达载体p ET-28a-As JAZ1,经酶切鉴定和测序验证后将其转入大肠杆菌BL21(DE3),在37℃经0.5 mmol·L-1异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达4 h后,可获得相对分子质量约为39 k Da的融合重组蛋白的高效表达。该重组蛋白在大肠杆菌的上清和沉淀中均有表达,但以包涵体表达为主。     

冬凌草IrCYP71基因的克隆和功能

目的:克隆冬凌草二萜类化合物生物合成途径下游关键酶基因Ir CYP71,进行序列特征分析,对此基因编码的蛋白进行原核表达分析以及亚细胞定位,并对蛋白在宿主细胞表达的条件进行了优化。方法:根据转录组测序所得的Ir CYP71基因片段,克隆出全长c DNA序列;构建p ET28a(+)-Ir CYP71重组质粒,转化到Rosetta感受态细胞,小量表达和大量表达蛋白并鉴定,进行包涵体蛋白的纯化与复性,再对复性蛋白纯化鉴定分析。基于gateway克隆技术构建出PCR8/GW/TOPO-Ir CYP71载体之后与改造Pearleygate104载体重组,之后与农杆菌GV3101重组,转入烟草中瞬时表达,从而进行蛋白亚细胞定位。结果:克隆得到的Ir CYP71基因全长c DNA为1 593 bp,编码530个氨基酸,并在Gen Bank注册(登录号MG800628)。经大肠埃希菌表达系统表达的重组蛋白相对分子质量正确,在62 k Da左右,纯化后的重组蛋白总量有1 mg,蛋白纯度为85%。此蛋白亚细胞定位在细胞核。结论:对冬凌草Ir CYP71基因进行了初步验证,并对基因表达的蛋白进行原核表达和亚细胞定位,使该基因在冬凌草二萜成分的生物合成过程中的作用得到了进一步的阐述。     

银杏果抗真菌肽基因(GZ-gb)原核表达载体的构建

目的 为了构建贵州银杏果抗真菌肽基因(GZ-gb)的表达载体.方法 采用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切的pMD18-T-GZ-gb和pET32a(+)质粒,纯化回收产物进行反应,将连接产物pET32a(+)-GZ-gb转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后,经菌落PCR、酶切鉴定和测序.结果 表明目的片段成功插入表达载体.结论 pET32a(+)-GZ-gb可以用来制备抗真菌蛋白.     

肠致病性大肠埃希菌EspB基因的体外诱导表达研究

目的:研究肠致病性大肠埃希菌(enteropathogenic E.coli,EPEC)EspB基因的体外诱导表达情况,获得纯化的EspB蛋白。方法:体外构建重组质粒pET-28a-EspB,转化BL21感受态细菌培养,提取重组质粒并行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。重组质粒pET-28a-EspB经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹试验(Western blot)分析。pET-28a-EspB表达产物再次经纯化,获得的纯化蛋白进一步经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证。结果:经双酶切和测序验证pET-28a-EspB重组质粒构建成功。pET-28a-EspB重组质粒经IPTG诱导后,在诱导表达不同时间点,培养菌液、沉淀和上清中均有良好的蛋白表达。经SDS-PAGE和蛋白质Western blotting分析验证我们获得了纯化的EspB蛋白。结论:体外可成功诱导EPECEspB蛋白稳定高效表达并获得纯化EspB蛋白产物。     

白木香AsMAPK3基因的原核表达及其在洋葱表皮瞬时表达体系中的定位研究

目的构建国产沉香基原植物白木香AsMAPK3基因的原核表达载体,诱导重组蛋白正确表达,并研究AsMAPK3的亚细胞定位情况,为抗体制备准备材料,为筛选其互作蛋白及进一步研究其功能奠定基础。方法通过PCR方法克隆AsMAPK3基因的部分编码序列,构建重组原核表达载体pET-28a-AsMAPK3,并诱导蛋白表达。克隆AsMAPK3基因全长编码区,构建绿色荧光蛋白(GFP)瞬时表达载体pAN580-AsMAPK3,通过基因枪法转化洋葱表皮,荧光显微镜观察GFP的发光情况。结果含有重组表达载体的大肠杆菌BL21(DE3)在37℃经0.5 mmol/L异丙基硫代β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导4 h后,可获得相对分子质量约为39 000的融合蛋白,该融合蛋白在上清和包涵体中均有表达。瞬时转化洋葱表皮的GFP荧光观察发现,AsMAPK3主要在细胞核和质膜表达。结论成功实现了AsMAPK3的体外表达和纯化,明确了AsMAPK3的亚细胞定位,为后续开展其功能研究奠定了基础。     

天花粉蛋白突变体的构建及其与重组天花粉在原核系统中的表达和纯化

目的:对天花粉蛋白(TCS)的第120-123位氨基酸进行缺失突变,并在原核系统中对其进行表达和纯化。方法:利用重叠延伸PCR的方法得到TCS突变体cDNA,并克隆入原核表达载体pET-28(a+)。酶切和测序鉴定后,将突变体质粒pET-28(a+)-mTCS转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导表达后,对表达产物用Ni2+-NTA亲和层析柱进行纯化和Western-blot鉴定。结果:利用重叠延伸PCR成功获得突变天花粉蛋白的编码序列,并构建pET-28(a+)-mTCS原核表达质粒。在BL21(DE3)菌中,突变体蛋白(mTCS)可被IPTG诱导性表达,并被Ni2+-NTA树脂有效纯化。结论:本实验成功获得一种突变体TCS,并建立该突变TCS的原核表达和纯化的实验方法。     

pQE-hbFGF表达系统的构建及其蛋白质的表达和纯化

 目的　构建pQE-hishbFGF表达载体,通过一步纯化得到6×HishbFGF蛋白质。方法　用PCR扩增目的基因hbFGF ,连接到pQE40载体上,转化到Top10菌株筛选重组子,经测序后将质粒转化到表达菌M15上,经IPTG诱导表达,超声波破菌后通过镍离子螯合层析一步纯化得6×HishbFGF蛋白质,ELISA鉴定产物 ,用MTT法检测产物促细胞增殖的生物活性。结果　hbFGF基因插入pQE载体中,在M15中6×HishbFGF的表达量达到20%,且为可溶性表达。经一步纯化后得到N端带 6个组氨酸的hbFGF蛋白,纯度为96%,6×HishbFGF具有免疫原性及促进NIH3T3细胞增殖的活性。结论　 6×HishbFGF蛋白质在M15中可溶性地高效表达,并经一步亲和层析得到纯度高活性高的产物,降低了生产成本,为大规模生产hbFGF及hbFGF的应用研究奠定了基础。     

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??OBJECTIVE To construct a novel fusion protein contained insulin-like growth factor 1 (IGF-1) and lidamycin (LDM) and evaluate its antitumor activity on non-small cell lung cancer (NSCLC). METHODS DNA fragment coding for fusion protein (ldp-igf) was synthesized by linking apoprotein of lidamycin (ldp) with igf-1, and then was cloned into the plasmid pET30a. Fusion protein LDP-IGF was expressed in E.coli as inclusion bodies and was purified by Ni²⁺ affinity chromatography. Binding affinity of LDP-IGF to NSCLC cells was evaluated by immunofluorescence assay and flow cytometry-based binding assay. MTT assay was used to measure the in vitro cytotoxicity of LDP-IGF and its enediyne-energized analogue LDP-IGF-AE. PI staining assay and Annexin V-FITC/PI staining assay were used to analyze the cell cycle arrest and cell apoptosis after treatment with LDP-IGF-AE, respectively. RESULTS Active soluble LDP-IGF protein was prepared by isolation, purification, denaturation and refolding, and the production of LDP-IGF was 12 mg per liter fermentation broth. Both of immunofluorescence assay and flow cytometry-based binding assay showed that LDP-IGF has strong binding activity to NSCLC cells. Enediyne-energized fusion protein LDP-IGF-AE exhibited potent cytotoxicity to NSCLC cells in vitro, and it is more potent than that of LDM. Furthermore, fusion protein LDP-IGF without active enediyne was also cytotoxic to A549 cells at high concentrations (50 and 100 ??g??mL^-1). LDP-IGF-AE could cause significant G₂-M arrest in A549 and H460 cells, and it also induced the apoptosis in NSCLC cells in a concentration-dependent manner. CONCLUSION Fusion protein LDP-IGF-AE shows potent antitumor efficacy in vitro on NSCLC, suggesting it could be a promising candidate for targeted therapy.     

人参铜锌超氧化物歧化酶原核表达载体的构建、表达及纯化

研究提取人参叶中的总RNA,采用RT-PCR扩增人参叶Cu/Zn-SOD基因,构建pET-28（a）-Cu/Zn-SOD原核表达载体。使用Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞进行IPTG诱导表达。利用镍离子亲和层析进行纯化,并采用黄嘌呤氧化酶法测定目的蛋白的酶活。经RT-PCR扩增的人参Cu/Zn-SOD基因序列与GenBank数据库中公布的高丽参Cu/Zn-SOD基因序列同源性为99.00%。经IPTG诱导,目的蛋白的表达量约为44.42%,相对分子质量为16.30 kDa。纯化后的蛋白酶活可达到10 596.69 U·mg^-1。通过分子生物学方法,成功构建了人参pET-28（a）-Cu/Zn-SOD原核表达载体,为进一步研究人参Cu/Zn-SOD生物学功能奠定了基础。     

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??OBJECTIVE To investigate apoptosis induction ability of hPP10-Apoptin fusion protein to mouse B16 melanoma cell. METHODS pET15b-hPP10-Apoptin expression plasmid was constructed, and E. coli BL21 (DE3) was transformed with the plasmid, then the yielded hPP10-Apoptin fusion protein was purified by Ni-NTA His-Bind Resin and confirmed by Western blotting assay. Melanoma cell apoptosis induced by hPP10-Apoptin fusion protein was analyzed by TUNEL assay, and the antitumor effect was examined in melanoma cell-bear mouse model. RESULTS hPP10-Apoptin fusion protein was highly expressed in BL21 cells, Western blotting analysis result showed that fusion protein was expressed correctly. The fusion protein can induce melanoma cell apoptosis in vivo and in vitro. CONCLUSION The results confirm that hPP10-Apoptin fusion protein could penetrate into melanoma cell and also has antitumor effect.     

苦豆子SaLDC密码子偏好性分析、优化及原核表达

目的 研究苦豆子SaLDC密码子偏好性、优化及原核表达.方法 运用EMBOSS在线程序中的CHIPS、CUSP和CodonW软件分析SaLDC密码子的偏好性,根据大肠杆菌密码子的偏好性对SaLDC密码子进行优化,并将优化后的基因命名为optSaLDC;构建重组表达载体pET-28a (+) -optSaLDC,转化大肠...     

广西眼镜蛇毒中Natrin的克隆及在E.coli中的表达

目的采用基因工程技术,在大肠杆菌中表达广西眼镜蛇毒中Natrin成熟蛋白。方法将来源于广西眼镜蛇毒的Natrin蛋白的基因克隆至融合表达载体pMAL-c2x中,以N端融合了麦芽糖结合蛋白的形式在大肠杆菌BL21(DE3)通过异丙基硫代半乳糖苷诱导表达Natrin蛋白。超声破菌后,将上清液经Amylose树脂柱上纯化后,收集并冻干Natrin融合蛋白,利用蛋白印迹分析其是否有Natrin抗原活性。结果经蛋白印迹分析可知在50 kD处的条带具有Natrin抗原活性。结论在大肠杆菌中可以表达出Natrin蛋白。     

呼吸道合胞病毒重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法及免疫原性研究

 目的建立呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,并研究其免疫原性。方法PCR扩增G1和F/M2基因片段,经酶切后插入原核表达载体pET-DsbA中,构建重组质粒pET-DsbA-G1F/M2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni⁺螯合亲和色谱法纯化尿素变性的包涵体溶液,梯度透析复性,Western-blot鉴定重组蛋白的RSV特异性,免疫BALB/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL)。结果构建的重组质粒在E.coli中表达了RSV特异性的重组蛋白,经变性、纯化并复性后获得了高纯度的DsbA-G1F/M2(>90%);该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体和CTL活性。结论建立了重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础。     

基因重组沙蚕纤溶活性蛋白的克隆、表达和活性检测

 目的从双齿围沙蚕消化道中克隆并表达具有纤维蛋白溶解活性的蛋白。方法提取沙蚕消化道上皮细胞RNA,逆转录获得cDNA。根据丝氨酸蛋白酶家族基因保守序列设计兼并引物,筛选包含丝氨酸蛋白家族保守位点的阳性克隆,进行核苷酸测序。根据该序列利用5′RACE技术进行扩增,将获得的基因片段克隆到pMAL-p2载体中,在大肠杆菌BL21中进行融合表达。表达的融合蛋白经过直链淀粉树脂亲和色谱和DEAE-Sepharose 4B纯化后,纤维蛋白平板法检测其溶栓活性。结果cDNA经5′RACE扩增获得长度为260 bp的基因片段,推测其包含可编码83个氨基酸的完整序列(约9.0×10³);重组pMAL-p2表达出51.0×10³的融合蛋白,经过测定具有明显的溶栓活性。结论从双齿围沙蚕中克隆获得的基因片段表达的融合蛋白具有溶栓活性,有望成为一种新型的纤溶药物。