基因枪介导单纯疱疹病毒DNA疫苗的免疫效果研究

目的：研究单纯疱疹病毒DNA疫苗经基因枪免疫小鼠的效果。方法：基因枪免疫小鼠腹部，免疫组化法检测gD抗原在接种部位的表达；ELISA检测血清中抗gD抗体；病毒攻击检测经基因枪免疫的DNA疫苗对动物的保护效果。结果：基因枪可有效将DNA质粒运送至小鼠真皮内，单纯疱疹病毒Ⅱ型gD2糖蛋白基因在真皮和肌肉组织中高效表达，免疫小鼠体内产生高滴度的中和抗体，能有效抵抗HSV-2病毒的攻击。结论：疱疹病毒gD DNA疫苗通过基因枪接种方式，可在小鼠体内产生特异性保护作用。     

IL-12的真核表达载体促进小鼠对DNA疫苗的免疫应答

慢性乙型肝炎及其病毒携带者细胞免疫功能明显低下。ＤＮＡ疫苗可被体细胞摄取并表达相应抗原 ,激发出保护性免疫应答 ,包括特异性ＣＴＬ应答及特异性抗体的产生〔1〕。ＩＬ 12是目前发现对体内免疫活性细胞诱导和调节作用最强、范围最广的细胞因子。我们将ＨＢＶＤＮＡ疫苗 (ｐＣＲ3.1 Ｓ)与编码鼠ＩＬ 12的真核表达载体 (ｐＷＲＧ316 9,简称ＩＬ 12 )共同免疫小鼠后 ,观察其对小鼠免疫应答的影响。材料与方法材料 :5～ 8周龄雌性ＢＡＬＢ/ｃ小鼠购自本校实验动物中心 ,体重 15～ 2 0ｇ ;Ｐ815小鼠肥大细胞瘤细胞系 ,编码ＨＢＶＳ抗原的真…     

基因枪转导K-RLIS反义基因对胰腺癌细胞（K-PLASP21）蛋白表达的影响

目的观察基因枪转导K-RAS突变特异性反义基因对胰腺癌细胞K-RASP21蛋白的影响。方法利用基因枪技术，将反义基因转导入宿主细胞，通过免疫细胞化学和Westernblot方法，观察K-RAS突变特异性反义基因转导后ASPC-1、MiaPaCa-2和BxPC-3三种人胰腺癌细胞系K-RASP21蛋白的变化。结果转导K-RAS突变特异性反义基因后，AsPC-1和MiaPaCa-2胰腺癌细胞的K-RASP21蛋白表达明显降低；BxPC-3胰腺癌细胞的K-RASP21蛋白表达无明显变化。结论突变特异性K-RAS反义基因经基因枪有效转导后，可用于胰腺癌的治疗。     

转IL—2基因的骨髓基质细胞对骨髓移植后免疫功能重建的促进作用

目的探讨了用逆转录病毒载体转入小鼠IL-2基因的基质细胞系QXMSC1对异基因骨髓移植后免疫功能重建的促进作用.方法将小鼠IL-2cDNA片段连接到逆转录病毒载体PLXSN上,构建重组逆转录病毒载体PL2SN(含小鼠IL-2cDNA).用磷酸钙共沉淀法将PL2SN转入单嗜性包装细胞系CRE,获得G418抵抗细胞株后,以上清感染双嗜性包装细胞系CRIP,G418筛选后获得高滴度的包装细胞系CRIPIL-2.感染NIH3T3细胞测定CRIPIL-2培养上清病毒滴度为3.4×105cfu/ml.感染骨髓基质细胞系QXMSC1(H-2d),G418筛选,有限稀释法得10个单克隆细胞株,选择表达IL-2最高的细胞株为实验用细胞QXMSC1IL-2,用于以后的实验.供体小鼠BALB/c(H-2d)骨髓以抗T细胞单抗anti-Thy1.2加补体去除骨髓中T细胞,受体小鼠C57BL/6(H-2b)经γ射线致死剂量照射后,输入供体骨髓1×107/只,同时输入基质细胞QXMSC1IL-25×105/只.在第30天、60天检测BMT小鼠脾细胞对LPS、ConA的反应,脾细胞产生IL-2的能力,BMT小鼠产生抗体生成细胞(PFC)的能力及产生DTH的能力.流式细胞仪检测了QXMSC1IL-2对BMT小鼠T细胞亚群的影响.结果电泳及酶切鉴定证实构建的PL2SN质粒.QXMSC1IL-2细胞系IL-2的分泌量为857U(1×106*24h).异基因骨髓移植,共输入QXMSC1IL-2能明显增加BMT小鼠脾细胞对LPS、ConA的反应.脾细胞产生IL-2的能力增强.PFC数目增加,DTH反应增强.T细胞亚群中CD4+/CD8+的比例有所恢复.结论转入IL-2的骨髓基质细胞系可促进骨髓移植后免疫功能重建.     

TF口服液诱导T细胞IL-2、IL-6及CD分子的表达

转移因子 (ｔｒａｎｓｆｅｒｆａｃｔｏｒ,ＴＦ)是介导细胞免疫的重要因子之一 ,其ＴＦ口服液具有协同诱导人Ｔ淋巴细胞ＩＦＮ γ和ＨＬＡ ＤＲ/ＤＱ分子的表达[1] ,促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬功能 ,促进人Ｔ淋巴细胞增殖发挥良好的免疫调节作用[2 ] 。为进一步了     

测定血IL-2、IL-6水平以评估肾移植后的排斥反应

排斥反应是器官移植失败的重要原因。急性排斥反应是许多种细胞因子共同作用的结果。ＩＬ 2、ＩＬ 6与其密切相关 ,其水平检测对肾移植排斥反应的诊断、鉴别诊断起重要作用。1　材料与方法1 1　对象　 32例我院肾移植患者 ,其中男 2 4例 ,女8例 ,根据移植反应情况分成非排斥组     

抗人IL-2Rα基因工程抗体Fab的构建和表达

目的：构建和表达抗人IL－2Rα基因工程抗体Fab片段，并测定该抗体片段的生物学活性。方法：采用连续PCR方法构建抗人IL－2Rα抗体Fab克隆载体5GI－pA22，并通过限制性酶切反应将抗人IL－2Rα抗体Fab基因从克隆载体5G1－pA22重组入表达载体pET-28b，并在大肠杆菌BL21（DE3）中用IPTG诱导以包含体形式高效表达，该表达产物约占菌体蛋白20％以上。经超声破碎，洗涤，和变性，复性后，采用双抗体夹心，ELISA法及体外抗体竞争抑制试验鉴定表达产物的生物学活性。结果：抗人IL－2Rα基因工程抗体Fab成功构建，并以包含体形式表达，表达产物的产量达1mg/ml。双抗体夹心ELISA法试验表明抗体Fab段与IL－2Rα有特异的结合能力，体外抗体竞争抑制实验表明Fab段可拮抗IL－2与活化T细胞表达IL－2Rα有特异的结合，抑制T细胞活化，增殖，抑制率达90％以上，结论：成功地构建了抗人IL－2Rα抗体Fab段，并获得高效表达，其具有较好的生物学活性。     

人IL-2真核表达质粒对副肌球蛋白核酸疫苗的免疫调节作用

目的：观察IL－2表达质粒对副肌球蛋白（AgB)核酸疫苗的免疫调节作用。方法：将人的IL－2全长cDNA插入到真核表达质粒pcDNA3中构建成pcDNA3－IL－2重组质粒，然后接种C57BL／6小鼠（分为pcDNA3组、AgB组、联合免疫组），ELISA法检测小鼠血清中的IgG和IgG2a的水平；用MTT法检测小鼠脾细胞增殖反应，用ELISA法检测其分泌的IL－2和IL－4的水平，最后在仔猪中进行攻击实验，观察pcDNA3－IL－2质粒的免疫刺激作用。结果：注射疫苗后，pcDNA3－IL－2协同注射组增强了副肌球蛋白特异性的IgG物IgG2a的水平，增强了脾细胞的增殖反应，提高了其分泌IL－2的水平，但对IL－4的水平产生轻微影响，仔猪攻击实验中，共同注射IL－2基因组提高了仔猪的相对保护率，结论：对于副肌球蛋白核酸疫苗而言，人的IL－2表达质粒是一种很好的免疫佐剂。     

HIV-2 DNA疫苗免疫小鼠的免疫反应观察

目的：用构建的HIV－2外膜蛋白gp105和核心蛋白gag基因的DNA疫苗免疫小鼠，评价其免疫效果。方法：将HIV－2型gp 105和gag基因克隆到表达载体pIRES1neo中，构建重组DNA疫苗质粒。间接免疫荧光试验证明，构建的DNA疫苗在真核细胞中表达了gp105或／和gag.构建的疫苗免疫小鼠后，用流式细胞仪测定CD4^ 、CD8^ T淋巴细胞亚类数，并用HIV－2抗体ELISA检测试剂盒检测免疫鼠血清中抗HIV－2抗体水平。结果：构建了3种HIV－2 DNA疫苗pIRES1gag、pIRSE1gp105和pIRES1gag-gp105，转染BHK细胞后均能表达抗原蛋白，免疫小鼠后可有效地刺激淋巴细胞增殖并诱导产生抗HIV－2特异性抗体，其中pIRES1gag-gp105免疫鼠中，淋巴细胞增殖最显著，而pIRES1gp105免疫鼠中HIV－2特异性抗体水平最高。结论：构建的DNA疫苗均能诱导机体产生免疫反应，其中pIRES1gp105诱导的体液免疫应答最显著，而pIRES1gag-gp105 诱导的细胞免疫响应最显著。     

肺癌患者血清sIL-2R、IL-2及IL-10相关性研究

本研究拟通过检测肺癌血清中ｓＩＬ 2Ｒ、ＩＬ 2与ＩＬ 10水平的变化 ,探讨肺癌患者血清ｓＩＬ 2Ｒ、ＩＬ 2与ＩＬ 10相关性 ,为肺癌的免疫治疗提供参考依据。采用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法测定 71例肺癌患者、30例肺部良性病变患者外周血中ＩＬ 2、ＩＬ 10、ｓＩＬ 2Ｒ水平 ,并以 10例健康体检者作正常对照 ,具体步骤按试剂盒说明书。方差齐性的计量资料组间比较采用单因素方差分析 ,不满足方差齐性要求的计量资料组间比较采用Ｇａｍｅｓ Ｈｏｗｅｌｌ法。用ＳＰＳＳ10 .0统计软件包进行分析处理。结果见表 1。从表 1可见 :肺癌组ｓＩＬ 2Ｒ…     

HBV preS2S-rhGM-CSF融合基因表达质粒的构建和表达

目的：研究GM-CSF和preS2对乙肝DNA疫苗的免疫增强作用。方法：采用PCR方法，扩增HBV preS2 S基因约846 bp的片段和rhGM-CSF(包括甘氨酸接头)基因450bp的片段。通过T-A克隆技术和基因定向克隆，构建融合基因的真核表达质粒pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF，并在HepG2细胞中表达。结果：经酶切、PCR及DNA测序鉴定，融合基因表达质粒HBV preS2S-rhGM-CSF成功地构建。将其转染HepG2细胞后，目的基因的转录通过RT-PCR得到证实，而且表达的融合蛋白能与抗-HBs、抗-preS2和抗-GM-CSF单克隆抗体(mAb)均产生特异性反应。结论：融合基因表达载体pcDNA3．1-S2S-rhGM-CSF的成功构建并表达，为进一步研究乙肝DNA疫苗奠定了实验基础。     

The Experimental Study on Treating Transgenic HBV Mice with Recombined IL-2-PreS DNA Vaccine

There are estimated 350 million chronic HBV carriersworldwide, third in China [1]. Unfortunately, there is nogood curative therapy approach for these patients. The pro tein vaccine contains surface protein of HBV (encoded Sgene), which (produced in…     

重组质粒pcDNA3.1IL-2/Fc对HBV preS2S DNA疫苗免疫作用的影响

目的 探讨IL-2/Fc融合表达后对HBVpreS2S基因疫苗诱导免疫反应的佐剂效应.方法 采用HBV preS2S DNA疫苗作为基础免疫,重组质粒pcDNA3.1IL-2/Fc作为佐剂加强免疫BALB/c小鼠,采用0、2、4周的方案接种,检测各次接种后抗体水平.初次免疫后7周,测定免疫脾细胞的杀伤活性、增殖活性和细胞因子的分泌水平.结果 pcDNA3.1IL-2/Fc作为佐剂在HBV preS2S注射3 d后免疫组小鼠抗体滴度、免疫脾细胞的杀伤活性和增殖活性、TH1型细胞因子的分泌水平,均比各对照组明显增强.结论 IL-2/Fc是有效的HBV preS2S DNA疫苗佐剂之一.     

IL-15-IgG2b fusion protein accelerates and enhances a Th2 but not a Th1 immune response in vivo,while IL-2-IgG2b fusion protein inhibits both

We have explored how IL-15 influences Th1 or Th2 type immune response in vivo. Intraperitoneal application of an IL-15-IgG2b fusion protein (FP) to mice did neither significantly affect the footpad swelling nor the production of hemagglutinizing antibodies in a delayed type hypersensitivity reaction to sheep red blood cells. In contrast, in an established murine Th2 model of sensitization to ovalbumin (OVA), IL-15-IgG2b FP plus OVA sensitization resulted in massively accelerated and enhanced allergen-specific IgE and IgG1 antibody production. In vitro, stimulation of spleen cells from OVA-sensitized mice with OVA+IL-15 or OVA+IL-15-IgG2b resulted in a significantly enhanced IgE production. IL-4 secretion was significantly induced by IL-15 but not by IL-15-IgG2b. An IL-2-IgG2b FP with the same Fc tail as the IL-15-IgG2b FP was used as control in both models. In striking contrast to the IL-15-IgG2b FP, IL-2-IgG2b significantly inhibited the Th2 type antibody production in vivo. The current study suggests that IL-15-IgG2b may be employed as a potent accelerator and enhancer of Th2 type immune responses in vivo, while IL-2-IgG2b can suppress the latter.     

IL-2 preS DNA疫苗免疫正常小鼠和HBV转基因鼠的免疫应答研究

目的 探讨IL—2 preS DNA疫苗作为预防和治疗性疫苗的可行性及作用机理。方法 应用基因重组技术，构建人白细胞介素2(hIL-2)和前表面抗原(preS)的真核表达载体，将此重组载体用基因枪分别注射正常的BALB／c小鼠和HBV转基因小鼠，通过ELISA方法检测BALB／c小鼠和HBV转基因鼠的抗-preS2、HBsAg及抗-HBs抗体水平；荧光定量PCR方法检测HBV转基因鼠血清中HBV DNA拷贝数，并用免疫病理HE染色观察小鼠肝组织炎症活动度，同时检测肝功能指标。结果 ①基因枪注射真核表达质粒免疫正常小鼠后，100％小鼠能在第4、6周检测到抗preS1抗体，持续时间长达10周。②用IL-2 preS真核表达质粒基因枪肌肉注射方式优于正常肌肉注射和皮下注射的方式，且所需质粒量(10μg／只)仅为后者(100μg／只)的1／10。③在第4周高峰期检测IgG亚类，是诱导以TH1(IgG2a)细胞免疫为主的反应。④基因枪注射真核表达质粒(1μg／只)免疫转基因小鼠后，80％的小鼠产生了抗体，HBV DNA量下降，其中20％的小鼠HBsAg转阴。⑤HE肝组织染色显示：肝组织有明显的炎细胞浸润、肝细胞肿大、颗粒样变性、转氨酶升高。结论 IL-2 preS DNA疫苗能刺激小鼠机体产生体液和细胞免疫，可部分打破小鼠机体的免疫耐受，为新型乙肝疫苗和抗HBV持续性感染的特异性免疫治疗剂的设计和构建提供理论与实践依据。     

Tumor cells secreting IL-13 but not IL-13Ralpha2 fusion protein have reduced tumorigenicity in vivo

IL-13 is a Th2 cytokine that plays crucial roles in the pathophysiology of allergy, asthma and helminth infection. The high affinity receptor for IL-13, IL-13Ralpha2, may act as a decoy receptor for IL-13. The anti-tumor effect of IL-13 and its soluble receptor IL-13Ralpha2 have been examined in different tumor systems. Previous studies have shown that IL-13 enhances anti-tumor responses in some model systems, whereas IL-13Ralpha2Fc prevents IL-13 mediated suppression of tumor immuno-surveillance in a different model system. In this study, we have used a cytokine (receptor) gene therapy approach and studied the immune responses mediated by IL-13 and IL-13Ralpha2Fc in poorly immunogenic B16F1 melanoma and immunogenic MethA fibrosarcoma tumor models. We find that IL-13 reduces the tumorigenicity of B16F1 melanoma and MethA fibrosarcoma cells in vivo, most likely through the recruitment of neutrophils and macrophages. IL-13 mediated anti-tumor responses do not lead to the generation of tumor-specific T cells. Neither IL-13Ralpha2Fc gene transduction nor in vivo treatment with soluble IL-13Ralpha2Fc has a statistically significant effect of tumor growth. IL-13Ralpha2 deficient host background does not alter tumor growth, suggesting that endogenous levels of IL-13 do not contribute to an anti-tumor response in these models. We conclude that IL-13, but not soluble IL-13Ralpha2, has anti-tumor activity in the models described here, possibly by enhancing innate anti-tumor immunity.     

插入IL-2基因优化HBV DNA疫苗的研究

目的：观察IL-2基因的插入对DNA疫苗免疫效应的影响，探讨优化DNA疫苗设计、提高DNA疫苗兔疫效应的途径。方法：采用PCR产物直接克隆和重组DNA技术构建了人IL-2和HBsAg融合基因的真核表达载体pcDNA3．1 -S/IL-2，通过脂质体基因转移技术导入Cos-7细胞中检测其瞬间表达，并经肌肉注射免疫C57Bl/6小鼠，以检测和比较它们的细胞和体液免疫应答。结果：通过酶切、PCR及测序证实已正确完整地插入 IL-2基因，成功构建了 pcDNA3．1 -S/IL-2重组质粒。体外转染Cos-7后可见基因的表达和分泌，pcDNA3．1 -S/IL-2可以提高免疫小鼠的抗 HBs抗体滴度和脾淋巴细胞诱生的IL-2的生物活性水平，增加 HBsAg特异性的脾淋巴细胞增殖指数。结论：IL-2和 HBsAg基因的融合表达对 DNA疫苗的免疫反应起协同和增强作用，提示IL-2基因插入可能是增强DNA疫苗的免疫效应的可行途径。     

基因佐剂注射时相对HBV preS2S疫苗免疫作用的影响

目的：HBV preS2S基因疫苗接种不同时相应用佐剂peDNA3．1IL-2／Fc，观察其对诱导免疫反应效果的影响。方法：采用HBV preS2S DNA基因疫苗作为基础免疫，重组质粒peDNA3．1IL-2／Fc作为佐剂加强免疫，设计实验组与HBVpreS2S基因疫苗同时及在注射BALB／c小鼠后第3天加用佐剂，采用0、2、4周的方案接种，检测各次接种后抗体水平、免疫脾细胞的杀伤活性、增殖活性和细胞因子分泌水平。结果：HBV preS2S注射3天后应用佐剂的免疫小鼠，其抗体滴度、免疫脾细胞杀伤活性、增殖活性和Th1型细胞因子分泌水平均比同时免疫组、单独应用HBV preS2S组及空载体对照组明显增强。结论：预先接种疫苗后加用IL-2／Fc佐剂，能明显增强疫苗免疫效应。     

结核分枝杆菌Ag85B/IL-2-GST融合蛋白表达质粒的构建及原核表达

卡介苗（BCG）膀胱灌注是治疗表浅型膀胱肿瘤及预防其复发最有效的方法之一,BCG联合IL-2治疗膀胱肿瘤具有更好的临床疗效。无论是BCG还是IL-2在临床治疗膀胱癌均存在着剂量大、疗程长、毒副作用大等缺点。     

白藜芦醇对活化小鼠T淋巴细胞IL-2和CD25表达的影响

目的：研究白藜芦醇(RSV)对活化的小鼠T淋巴细胞分泌IL-2和CD25的影响，并探讨其免疫抑制机制。方法：无菌分离小鼠淋巴结细胞，与不同浓度的白藜芦醇共同孵育1小时后，用多克隆刺激剂佛波醇酯和离子霉素刺激T细胞活化，继续培养6小时后收获细胞，进行胞内细胞因子染色，流式细胞仪检测IL-2的分泌情况，RT-PCR检测IL-2 mRNA的表达：24小时后检测CD25表达。结果：RSV对IL-2的分泌具有抑制作用，并呈剂量依赖性，同时RSV也能抑制T细胞表面活化分子CD25。结论：RSV对活化T细胞分泌的细胞因子IL-2及IL-2α链CD25的表达可能是RSV对T细胞具有免疫抑制作用的机制之一，并可能与T细胞活化通路的PKC-NF-κB信号传导途径相关。