单核细胞增生性李斯特氏菌溶血素基因克隆及原核表达载体构建

目的　构建单核细胞增生性李斯特氏菌 (Listeriamonocytogenes,LMO)溶血素基因重组表达质粒。 方法　本文采用PCR方法扩增出LMO 0 5 86株溶血素 (Hemolysin ,hly)基因 ,将其克隆到pMD18-T中 ,筛选带有插入片段的阳性质粒。经酶切和PCR鉴定 ,然后进行测序。继而用SalⅠ和XbaⅠ双酶切阳性质粒 ,目的片段定向插入pPROEXTMHTa中进行鉴定。结果　hly基因体外扩增产物大小约为 16 4 6bp。核苷酸序列鉴定后 ,其核苷酸序列与国外报道的LMOF6 789株、LMOF2 36 5株同源性分别为 99 70 %和 99 39%。推导出的氨基酸序列与其相应菌株比较 ,同源性分别为 99 82 %和 98 90 %。重组表达质粒经PCR及酶切鉴定表明为正确重组子。结论　在国内首次克隆到LMOhly全基因 ,并构建出含hly基因的原核表达载体。此项工作为进一步LMO溶血素基因的表达奠定了基础。     

单核细胞增生李斯特菌溶血素的研究进展

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）属于李斯特菌属,与其同属的还有伊万诺夫李斯特菌（L．ivanovii）、无害李斯特菌（L．in-nocua）、威斯梅尔李斯特菌（L．welshimeri）和西里杰李斯特菌（L．seeligeri）,L．ivanovii仅感染反刍动物,而LM是人畜共患李斯特菌病的主要病原,亦是四大食源性病原菌之一。     

漳州市首次分离出单核细胞增生李斯特氏菌

单核细胞增生李斯特氏菌(简称LM),是李斯特菌属中唯一能引起人类和动物患菌血症、脑膜炎、流产等高病死率的病原菌,也是造成目前国内外食品污染的食源性致病菌之一。LM在自然界分布广泛,可污染蔬菜和多种食品,欧美国家由LM引起的食物中毒不断发生,其发生率在全球大幅度上升,引起世界各国卫生部门的高度重视。我市以往对LM的污染调查尚属空白,为预防它发生和流行,近年来我们对市区居民消费的六大类食品进行采样检测,现将调查结果报告如下:1　材料和方法1.1　样品来源　324份样品采自市区主要14个菜市场、3家大超市和15家食品商店,其中生…     

卤制品中单核细胞增生性李斯特氏菌污染调查

单核细胞增生性李斯特氏菌 (Lm)是人畜共患病病原体 ,致病性强 ,在世界范围内引发了多起严重的食物中毒。因而越来越引起重视。为了解食品Lm污染状况 ,于 2 0 0 1年 5月对武汉市各集贸市场抽取了三类卤制品共 80份作Lm污染调查。并对阳性株作药敏试验 ,发现食品污染严重且抗药性普遍 ,报告如下。1　材料与方法1 1　样品　随机抽取各集贸市场卤制品 (卤牛肚、卤牛肉、卤鸭子 )共 80份。1 2　培养基及试剂1 2 1　培养基　北京陆桥商检新技术公司提供。1 2 2　试剂盒　生物梅里埃公司提供 ,按说明书操作。1 3　试验动物　江汉大学医…     

单核细胞增生性李斯特菌作为肿瘤疫苗运送载体的研究进展

单核细胞增生性李斯特菌是一种兼性胞内寄生菌,能直接感染抗原递呈细胞,使所运送的外源抗原可以同时进入MHCⅠ类和MHCⅡ类抗原递呈途径,从而诱导强烈的CD⁺₈T细胞和CD⁺₄T细胞免疫应答。目前,减毒李斯特菌作为一种新型的活疫苗载体,在运送宫颈癌、黑色素瘤等肿瘤相关抗原方面业已取得较好的免疫保护效果,在抗肿瘤治疗中显示出诱人的前景。本文综述了单核细胞增生性李斯特菌的免疫应答特性及其作为治疗性肿瘤疫苗载体的相关研究进展。     

武汉市食品中单核细胞增生性李斯特氏菌污染状况调查

单核细胞增生性李斯特氏菌 (LM) ,是重要的食源性疾病的病原菌 ,在自然界分布广泛。该菌致病性强 ,可引起人类菌血症 ,脑膜炎等症状 ,不易被寒冷日晒等强烈因素所杀灭。国外对该菌高度重视 ,WHO将其列为九十年代食品中四大致病菌之一〔1〕。我国虽未报道单核细胞增生性李斯特氏菌食物中毒 ,但此次食品污染状况调查初步了解了单核细胞增生性李斯特氏菌在武汉市食品污染状况 ,为制定食源性致病菌的预防措施提供了依据。1　材料和方法1 1　样品来源和品种　采自武汉三镇市售生肉、熟肉、乳制品 (酸奶、果奶 )、冷饮 (冰淇淋 )、乳 (生奶、消…     

产单核细胞李斯特菌plcB基因的克隆与原核表达

目的克隆并原核表达产单核细胞李斯特菌plcB基因。方法利用PCR技术从产单核细胞李斯特菌基因组中扩增不含编码信号肽的plcB基因。采用T-A克隆构建pGEM-T-plcB重组质粒,BamHI、XhoI双酶切pGEM-T-plcB获得plcB片段后再插入pGEX-6p-1原核表达载体,获得pGEX-6p-1-plcB重组表达质粒并在表达宿主菌BL21中诱导表达。对表达产物进行纯化和SDS-PAGE、Western-blotting、磷脂酶活性实验分析。结果克隆的plcB基因长834bp,与GenBank上公布的序列完全相同;表达的与GST标签蛋白融合的广谱磷脂酶C蛋白(GST-PC-PLC)具有磷脂酶生物活性和免疫原性。结论成功构建产单核细胞李斯特菌plcB基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中得到有效表达,这为进一步研究PC-PLC蛋白的致病与免疫机理奠定了基础。     

衢州市食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的检测

单核细胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes．以下简称单增李斯特菌）是一种强致病性的食源性病原菌,主要侵袭孕妇、新生儿、免疫功能低下成人,特别是老年人。该菌广泛分布于自然界,多种食品均可受到污染。为了解衢州市食品中单增李斯特菌的污染状况,我们对2002～2004年衢州市市区菜市场、超市的食品进行了单增李斯特菌的监测,现将结果报告如下。     

4b型单核细胞增生李斯特菌内化素基因NTSN_0462的功能初探

目的单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)对宿主的粘附、侵袭作用与其多种内化素蛋白密切相关。本研究以4b型菌株LmNTSN的內化素基因NTSN_0462为研究对象,初步探究其致病作用。方法利用同源重组技术构建该基因缺失的突变株,研究0462基因对NTSN在生长、细胞侵袭和体内定植中的作用。人结肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2的侵袭率,以及BALB/c小鼠体内肝、脾脏中定植能力的差异。结果缺失株的生长曲线结果显示,NTSN_0462基因对Lm在BHI培养基中的生长及代谢未造成明显影响。以人结肠腺癌细胞Caco-2、人肝癌细胞HepG2进行的体外试验表明,缺失株的侵袭能力低于野生株(P0.001)。以BALB/c小鼠进行的体内试验显示,缺失株在肝脏中定殖的能力显著低于野生株(P0.001),在脾脏中无统计学差异。结论 NTSN_0462基因在LmNTSN入侵肝脏和定植中发挥重要作用,是侵袭相关的重要毒力因子。     

市售熟食单核细胞增生李斯特菌流行病学分析

目的了解市售散装熟食中Lm污染状况，探索Lm在熟食中流行特征。确定控制Lm的关键控制点。方法采集市售熟食、宾馆饭店熟食、生产熟食用原料、生产场所环境及用具、熟食销售场所环境及用具、宾馆饭店熟食间环境及用具样品共883份检测Lm，用统计学处理分析结果。结果市售散装熟食Lm检出率为13．06％，宾馆饭店熟食Lm检出率为1．02％。二者间有极显著差异（P〈0．01）。生产原料Lm检出率为3．00％．生产环境及用具Lm检出率为22．22％。销售环境及用具Lm检出率11．02％，宾馆饭店熟食间环境及用具未检出Lm。二者间有显著差异（P〈0．05）。结论市售熟食Lm与宾馆饭店熟食有极显著差异；销售环境及用具Lm与宾馆饭店熟食间环境及用具有显著差异。Lm关键控制点：建立相对封闭的销售环境。加强熟食冰箱、柜台内外、销售用具的消毒措施。     

粪肠球菌溶血素cylL基因的原核表达

目的克隆表达粪肠球菌溶血素cylL基因,为制备单抗、开发疫苗及其致病机制研究奠定基础。方法从粪肠球菌中扩增溶血素cylL基因,相应酶切后,克隆到原核表达载体pET42a中,构建pET-cylL重组质粒。将pET-cylL质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)。经KpnI、XhoI酶切及测序鉴定,以IPTG诱导表达融合蛋白,用SDS-PAGE、Western blot进行分析。结果PCR体外扩增cylL基因产物约206bp,成功构建了重组表达质粒pET-cylL;SDS-PAGE、Western免疫印迹显示蛋白表达带的分子量约为39.6kD。结论成功构建粪肠球菌溶血素cylL基因的重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。     

单核细胞增多性李氏杆菌TA分离株P60基因的克隆与表达

目的对单核细胞增多性李氏杆菌TA分离株入侵相关蛋白P60基因进行克隆、测序和表达。方法利用PCR方法扩增P60基因,克隆入T载体中进行测序,并亚克隆到大肠埃希菌表达载体pET28a中进行诱导表达。结果该基因全长1122bp,编码374个氨基酸,其中前25个氨基酸残基构成信号肽序列。与GenBank已经报道的5个不同分离株P60基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分别在96.4%～99.6%和97.1%～99.8%之间。在推导的P60蛋白氨基酸序列中,存在9个潜在的N-联糖基化位点,5个Thr-Asn重复序列区,Thr占所有氨基酸残基的16.3%。重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到分子质量单位为45.6ku的重组蛋白,Western blot分析表明重组蛋白为特异的。经凝胶薄层扫描,重组蛋白表达量可占菌体蛋白的31.6%。结论成功克隆和表达了单核细胞增多性李氏杆菌TA分离株P60基因。     

单核细胞增多性李斯特菌mpl全基因克隆与序列分析

目的克隆单核细胞增多性李斯特菌mpl全基因并进行序列比较分析。方法分别从参考菌株CCTC-CAB97021和分离菌株XFL0605中PCR扩增mpl全基因,连接到T克隆载体转化到受体菌DH5α中,经菌落PCR和提取质粒酶切鉴定,分别获得阳性克隆转化子后测序,运用DNAStar软件对测定核苷酸及推导AA序列与GenBank中李斯特菌属的部分菌株进行分析。结果成功克隆了单核细胞增多性李斯特菌mpl全基因,所获得的mpl基因片段具有完整的ORF,均全长1533bp,编码510个氨基酸。对李斯特菌属mpl基因遗传性分析显示L.monocytogenes与L.seeligeri和L.ivanovii处于不同的分支,在L.monocytogenes种内分为两个群,表明mpl能够反应出这三种李斯特菌株的亲缘关系。结论单核细胞增多性李斯特菌mpl基因具有种的特异性。     

合肥市市售猪肉产单核细胞李斯特菌分离及hly基因序列分析

目的了解市售猪肉中产单核细胞李斯特菌(Lm)的污染状况及Lm分离菌株hly基因部分序列的分析比较。方法菌株分离鉴定应用多聚酶链反应(PCR);PCR产物直接测序,对780bp片段作序列分析。结果市售猪肉产单核细胞李斯特菌的污染率为1.17%(2/170);分离菌株WLD1和FCY1与国内外14个参考菌株的同源性分别为96.4～98.6%和95.0%～97.2%,而两者之间的同源性仅为95.9%。结论合肥市市售猪肉中有一定程度产单核细胞李斯特菌的污染,且存在李斯特菌病的可能性和食物中毒的潜在危险;分离菌株WLD1和FCY1,尤其是FCY1分化程度较高,Lmhly基因核苷酸序列差异的距离与地理分布、菌株的样品来源无一定的相关性。     

单核细胞增生性李斯特菌PCR快速检测方法建立及应用

目的　通过扩增hly基因PCR法建立快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌 (Lm )方法。 方法 :用PCR法扩增hly基因来检测标准菌株及临床分离的Lm的纯培养物和模拟污染的生猪肉、水和牛奶 ,并应用于实际食品检验工作中进行验证。结果　 34株Lm的PCR结果呈阳性 ,而其它李斯特菌 ,包括英诺克李斯特菌、绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌、威儿李斯特菌和格氏李斯特菌以及非李斯特菌均未出现特异性的片段。表明所扩增的hly基因 3’末段 82 7bp的DNA片段对Lm具有较高的特异性。PCR法对Lm纯培养物的检测限达 10 5CFU/ml,对模拟污染生猪肉、水和牛奶的 30℃ 16h改良LEB增菌培养液用PCR法检测 ,结果检测限达 10CFU/ 2 5 g(ml)。进一步研究表明该PCR扩增体系能检测出 6 .5pg的LmDNA ,整个检测过程只需 2 4h。采用该法对扬州市区 16 9份食品样品检测 ,8份样品Lm呈阳性且结果与传统的生化鉴定方法完全一致。结论　扩增hly基因的PCR法对Lm的鉴定具有特异性强、灵敏度高、速度快和易操作等优点 ,可用于食品的Lm的分离     

利用商品DNA探针对食品中单核细胞增生李斯特菌的快速检测评估

用商品核酸探针 (AccuProbe)对 10 0份市售食品中单核细胞增生李斯特菌进行检测和验证 ,并以酶联免疫荧光分析技术 (VIDAS)和常规培养分离物做生化鉴定 (API)做平行测试比较 ,最终证实基因探针 (AccuProbe)对食品中单增李氏菌的检测具备正确、灵敏、快速、简便等优点 ,适于推广应用