酒精抑制脑星形胶质细胞胶原纤维酸性蛋白和S_(100)蛋白的表达

目的研究酒精对脑星形胶质细胞GFAP和S_(100)蛋白表达的影响。方法对体外分离培养的大鼠胚胎脑星形胶质细胞分别施以不同剂量酒精(2、5和20mmol/L),染毒7天后,以免疫细胞化学法观察酒精对星形胶质细胞GFAP和S_(100)蛋白表达的影响。结果随酒精剂量增加,脑星形胶质细胞GFAP和S_(100)蛋白表达强度下降,高剂量组细胞数量轻度减少。结论提示酒精能抑制星形胶质细胞GFAP和S_(100)蛋白表达。酒精诱导的星形胶质细胞蛋白表达异常可能是酒精引起中枢神经系统发育异常的主要机制之一。     

鱼藤酮对体外培养星型胶质细胞毒性作用

目的观察鱼藤酮对体外培养星型胶质细胞毒性作用的特点。方法体外培养大鼠中脑星型胶质细胞,采用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光法鉴定。观察染毒星型胶质细胞形态,检测细胞活力,通过生长曲线分析鱼藤酮对星型胶质细胞增殖的影响以及RT-PCR检测缝隙连接蛋白（connexin43,CX43）mRNA表达。结果0.5μmol/L鱼藤酮染毒24 h即可引起明显的细胞形态改变;0.75,1.0,2.0μmol/L鱼藤酮染毒时星型胶质细胞活力明显降低,乳酸脱氢酶释放量显著增加;0.5μmol/L以上鱼藤酮可明显抑制胶质细胞增殖,CX43 mRNA表达降低。结论鱼藤酮对体外培养星型胶质细胞可以产生明显的毒性损伤作用,但与神经元比较,星型胶质细胞对相同剂量的鱼藤酮染毒具有更强的耐受能力。     

热应激蛋白70在苯致小鼠骨髓细胞凋亡中的作用

目的 探讨苯是否可导致细胞凋亡和热应激蛋白70（HSP70）在这一过程中的作用。方法 取小鼠骨髓细胞，体外33℃，5%CO2孵箱中孵育过夜后，随机分为；普通组，以不同渡（0，2，10mmol/L)的苯染毒2h；热应激组，细胞40℃受热1h,33℃恢复1h，再以不同浓度（0，2，10mmol/L)的苯染毒2h，同时分别设立不染毒细胞组用以观察HSP70表达，采用Western blot和流式细胞术检测HSP70表达水平和小鼠骨髓细胞凋亡程度。结果 热应激后HSP70表达增加；热应激组细胞除0剂量染毒组外，其他剂量组细胞发生凋亡百分比均高于普通组。结论 热应激后细胞HSP70的增加不能抑制苯所致小鼠骨髓细胞凋亡的发生。     

甲基汞对脑神经胶质细胞凋亡及c-fos表达的影响

为探讨氯化甲基汞 (MMC)所致脑发育损伤及其与c fos表达的关系 ,采用光镜、电镜等形态学方法 ,观察了MMC对体外培养的大鼠脑神经胶质细胞的损害作用 ,并应用免疫细胞化学方法 (SP法 )观察MMC对培养神经胶质细胞c fos表达的影响。结果表明 ,体外培养的胶质细胞接触MMC后 ,出现胞浆浓缩、轴突回缩、染色质边聚、固缩等现象 ,呈凋亡的典型形态。MMC 0 0 2mmol L作用于神经胶质细胞 10min后 ,c Fos蛋白阳性细胞百分率随其后的培养时间而变化 :c Fos蛋白阳性细胞率 0 5h开始增高 ,2h达高峰 ,4～ 6h又逐渐减少。MMC 0 0 0 12 5、0 0 0 5、0 0 2、0 0 8和 0 32mmol L作用 10min后 ,0 32mmol L组的阳性率显著高于除0 0 8mmol L组外的其他各组 (P <0 0 1)。提示MMC可诱导体外培养大鼠脑神经胶质细胞c fos表达 ,并诱发其凋亡。MMC诱发神经细胞凋亡可能与c fos介导有关。     

硝酸铅诱导L-02细胞HSP70表达及氧化应激的研究

目的研究硝酸铅诱导人胚胎肝细胞株L-02细胞热应激蛋白70(HSP70)表达以及细胞氧化应激的变化,并探讨HSP70表达与抗氧化作用的关系。方法以0、10、20和40μmol/L硝酸铅染毒人胚胎肝细胞株L-02细胞,以免疫组化技术观察HSP70表达的变化,并检测L-02细胞裂解液超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物还原酶(GSH-Px)活力以及丙二醛(MDA)含量的变化。结果 20、40μmol/L硝酸铅组L-02细胞未出现细胞毒作用,HSP70出现阳性表达,且40μmol/L剂量组呈明显阳性;同时40μmol/L剂量组SOD活力高于对照组(P0.05)。结论该研究剂量的硝酸铅能够诱导L-02细胞HSP70表达明显增强,且细胞抗氧化作用增强。     

乙基亚硝基脲致大鼠脑星形胶质细胞DNA损伤及对P53和P21蛋白表达的影响

目的研究乙基亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU)诱发原代大鼠脑星形神经胶质细胞DNA损伤及对P53、P21蛋白表达的影响.方法采用机械分离技术,在体外培养大鼠脑神经胶质细胞,通过传代培养的方法纯化大鼠脑星形胶质细胞.给予不同浓度ENU(1.7、3.4、6.8、13.6、27.2 mmol/L)染毒,采用单细胞凝胶电泳(single-cell gel electrophoresis,SCGE)和免疫组织化学的方法观察ENU对星形胶质细胞DNA的损伤作用和抑癌基因p53、p21的产物P53、P21蛋白在细胞中表达.结果不同染毒浓度下,各染毒组对星形胶质细胞均有不同程度DNA损伤作用,各染毒组拖尾细胞百分率与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01),且随受试物浓度增加而增加,表现出明显的剂量-效应关系(r=0.916).各染毒组细胞DNA的迁移距离(尾长)与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).在13.6、27.2 mmol/L ENU染毒组,P53有阳性表达,与阴性对照组比较,有统计学意义(P＜0.01),而P21在各实验组均未见阳性表达.结论ENU对大鼠脑星型胶质细胞的毒性主要表现在诱导细胞遗传物质DNA损伤以及抑癌基因p53的表达水平升高.     

硝酸铅诱导大鼠肝组织及L-02细胞热应激蛋白70基因表达的研究

目的 研究铅诱导热应激蛋白70(HSP70)基因表达的变化.方法 以5、10、20μmol/L硝酸铅染毒胚胎肝细胞株L-02细胞,运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增技术观察HSP70 mRNA表达的变化.将Wistar大鼠以180、60、20mg/kg3个剂量染毒硝酸铅,并设正常对照组,每组16只,雌雄各半,连续染毒28 d;运用RT-PCR扩增技术观察肝组织HSP70 mRNA表达的变化,并用原子吸收光谱法检测动物肝脏铅含量.结果 在L-02细胞未出现明显细胞毒作用的20μmol/L染铅组HSPT0基因表达明显上调.大鼠肝组织HSP70 mRNA表达与硝酸铅浓度呈剂量-反应关系,180、60 mg/kg染铅组HSP70 mRNA表达明显增加,与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);20 mg/kg染铅组与对照组的差异无统计学意义(P＞0.05).各染铅组大鼠肝脏铅含量较对照组明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 硝酸铅能够诱导大鼠肝组织及L-02细胞HSP70 mRNA表达明显增强.     

芳烃类有机溶剂对原代培养神经胶质细胞的谷氨酸重摄取的影响

[目的 ]研究芳烃类有机溶剂对原代培养大鼠神经胶质细胞的谷氨酸重摄取的影响。 [方法 ]取新生SD大鼠的海马神经胶质细胞进行原代培养 ,培养 2周后 ,用芳烃类有机溶剂 (甲苯、二甲苯和乙苯 )染毒 ,染毒浓度为 3mmol/L、6mmol/L和 9mmol/L ,染毒时间为 4h、12h和 2 4h ,并设空白对照组和赋形剂蓖麻油组 ,染毒后 ,观察神经胶质细胞的存活率、乳酸脱氢酶 (LDH)活性以及氨基酸重摄取的变化。 [结果 ]染毒后 ,神经胶质细胞摄取谷氨酸的能力显著下降(P <0 0 5 ) ,有明显的剂量 反应关系 (r =0 87,P <0 0 1) ,当染毒浓度为 9mmol/L浓度时 ,抑制率达 70 %以上 ;但染毒后神经胶质细胞的存活率与对照组相比无显著性差异 (P >0 0 5 ) ,LDH的活性差异亦无显著性 (P >0 0 5 )。 [结论 ]芳烃类有机溶剂对神经胶质细胞本身的致死性毒作用较小 ,但对神经胶质细胞的谷氨酸重摄取功能有较强的抑制作用     

乙酸铅对人星形胶质细胞超微结构及凋亡相关蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3表达的影响

为探讨乙酸铅对人星形胶质细胞超微结构及凋亡相关蛋白天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达的影响,将处于对数生长期人星形胶质细胞(细胞密度约5×103个/ml)分别暴露于0(对照)、10、20μmol/L乙酸铅,培养24 h后,采用倒置相差显微镜观察细胞的形态学变化,采用透射电镜观察细胞超微结构的变化,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,采用细胞免疫化学法检测Caspase-3的表达,采用Western blot法检测细胞中Caspase-3表达量。结果显示,显微镜下观察发现,乙酸铅染毒人星形胶质细胞变小、变圆,细胞间隙变大,细胞部分脱落。透射电镜观察发现,乙酸铅染毒细胞胞质内出现空泡,核固缩,核膜结构模糊,线粒体数目减少、空泡化。流式细胞仪检测结果表明,乙酸铅染毒组细胞凋亡率高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。细胞免疫化学法和Western Blot法检测结果显示,乙酸铅染毒人星形胶质细胞Caspase-3表达量均高于对照组,并且表达量随着染铅剂量增加而升高。提示乙酸铅可诱发人星形胶质细胞凋亡,其机制可能与Capase-3的活化有关。     

c-Jun氨基末端激酶在镉致小鼠脑原代星形胶质细胞凋亡中的作用

目的利用原代培养的小鼠脑星形胶质细胞(astrocytes,AS),探讨c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号转导通路是否参与镉致小鼠脑星形胶质细胞凋亡的过程。方法原代培养的小鼠脑星形胶质细胞给予0~20μmol/L镉染毒0~24 h,倒置相差显微镜观察细胞形态变化;给予0~20μmol/L镉染毒9、12 h,采用MTT法检测细胞存活率;给予0~20μmol/L镉染毒12 h,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率;给予0~20μmol/L镉染毒0~12 h,采用蛋白印迹(Western blotting)法检测JNK磷酸化蛋白的表达水平。结果镉浓度为5~20μmol/L时,随染毒剂量的升高及作用时间的延长,细胞形态发生明显改变:细胞间网络连接松散,突起消失,胞体收缩成球形,贴壁能力下降,最终脱落,漂浮于培养液中。与对照组比较,各浓度镉染毒9、12 h后小鼠脑星形胶质细胞的存活率均下降,差异有统计学意义(P0.01);且随着镉染毒浓度的升高和染毒时间的延长,小鼠脑星形胶质细胞的存活率均呈下降趋势。与对照组比较,各浓度镉染毒12 h后小鼠脑星形胶质细胞的凋亡率均升高,差异有统计学意义(P0.01);且随着镉染毒浓度的升高,小鼠脑星形胶质细胞的凋亡率均呈上升趋势。与对照组比较,5~20μmol/L镉染毒3 h后小鼠脑星形胶质细胞内p-JNK表达量均升高,20μmol/L镉染毒6 h后小鼠脑星形胶质细胞内p-JNK表达量升高,10~20μmol/L镉染毒9、12 h后小鼠脑星形胶质细胞内p-JNK表达量均升高,差异有统计学意义(P0.05);与0 h比较,0~20μmol/L镉染毒3~12 h后小鼠脑星形胶质细胞内p-JNK表达量均升高,差异有统计学意义(P0.05);且随着镉浓度的升高和染毒时间的延长,小鼠脑星形胶质细胞内p-JNK的表达量均呈上升趋势。结论镉可能通过上调JNK磷酸化蛋白的表达水平来诱导小鼠脑星形胶质细胞的凋亡。     

HSF1/HSP70通路抑制c-Jun氨基末端激酶的活化保护UVA诱导的HaCaT细胞凋亡

目的观察热休克转录因子1(HSF1)与热休克蛋白70(HSP70)对紫外线A(UVA)诱导HaCaT细胞凋亡的保护作用及其机制。方法建立8mJ/cm2UVA辐射损伤HaCaT细胞的病理模型。将细胞随机分为对照组、8mJ/cm2UVA照射组、HSP70转录抑制剂组(50μmol/L槲皮素)。Honechst 33258荧光染色观察细胞凋亡;蛋白质印迹法检测UVA辐射HaCaT细胞后p-HSF1和HSP70蛋白的经时变化及UVA辐射后孵育6h JNK(c-Jun氨基末端激酶)、p-JNK的蛋白表达;Real-Time PCR检测HSP70 mRNA的表达。结果 UVA辐射后HaCaT细胞内p-HSF1、HSP70蛋白表达量均出现先增加后减少的时间依赖性趋势,其中p-HSF1于1h开始增加,3h达高峰,HSP70于6h达高峰,24h基本恢复原始水平;UVA辐射前预先加入HSP70转录抑制剂槲皮素能显著抑制HSP70 mRNA的表达,增加p-JNK的表达量,同时Honechst 33258荧光染色观察其与UVA辐射组比较凋亡率明显升高。结论 8mJ/cm2UVA辐射HaCaT细胞在一定时间内可使HSF1活化致HSP70表达增加。HSF1/HSP70通路对UVA诱导的HaCaT细胞凋亡具有保护作用,其机制与HSP70大量表达后抑制JNK的活化有关。     

酒精对星形胶质细胞和少突胶质细胞膜脂质流动性的影响

为探讨酒精所致的神经元分化成熟迟滞和髓鞘形成受阻机制,本文以ＤＰＨ荧光探针研究了酒精对与神经元和髓鞘发育相关的星形胶质细胞、少突胶质细胞膜脂质流动性的影响。结果表明５ｍｍｏｌ／Ｌ酒精可导致星形胶质细胞、少突胶质细胞ＤＰＨ荧光探针的荧光偏振度（Ｐｒ）降低,膜脂质流动度（ＬＦＵ）增高,呈明显的剂量－反应关系,并发现酒精对星形胶质细胞作用强于少突胶质细胞。上述结果揭示酒精能改变两种胶质细胞的膜脂质流动性。它可能在酒精所致的神经元和髓鞘功能发育异常中起重要作用。     

Glutamine attenuation of cell death and inducible nitric oxide synthase expression following inflammatory cytokine-induced injury is dependent on heat shock factor-1 expression

BACKGROUND: Glutamine (GLN) has been shown to improve outcome after experimental and clinical models of critical illness. Enhanced expression of heat shock protein (HSP) has been hypothesized to be responsible for this protection. The heat shock response has been shown to inhibit inducible nitric oxide synthase (iNOS) gene expression and nitric oxide (NO) production. This study tested the hypothesis that GLN-mediated activation of the HSP pathway is responsible for improved survival and attenuation of iNOS expression after an inflammatory cytokine-induced injury. METHODS: Heat shock factor-1 (HSF-1) wild-type and knockout mouse embryonic fibroblasts (HSF-1+/+ and HSF-1-/-) were used in all experiments. Cells were treated with 0 mmol/L or 8 mmol/L GLN and cytomix (tumor necrosis factor-alpha, lipopolysaccharide, and interferon-gamma) in a concurrent treatment model once they had reached confluence. Cell viability was assayed with MTS/PMS mixture. Apoptosis and necrosis were assayed via immunohistochemistry. iNOS and HSP-70 expression were detected via Western blotting. NO production was measured using the Griess reagent. RESULTS: GLN treatment significantly attenuated inflammatory cytokine-induced cell death and apoptosis in HSF-1+/+ cells vs 0 mmol/L GLN treatment; however, GLN's cellular protection was lost in HSF-1-/- cells. GLN supplementation attenuated cytomix-induced iNOS expression and NO production only in HSF-1+/+ cells. Further, GLN induced HSP-70 expression only in HSF-1+/+ cells. CONCLUSIONS: This is the first demonstration that GLN-mediated cellular protection after inflammatory cytokine injury is due to HSF-1 expression and cellular capacity to activate an HSP response.     

谷氨酰胺对肝癌细胞热休克蛋白70表达的影响

目的研究谷氨酰胺(Gln)对体外培养肝癌细胞株SMMC-7721内热休克蛋白70(HSP70)表达的影响,及其与细胞增殖的关系。方法SMMC-7721细胞株分别与0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和16.0mmol/L的Gln培养24小时后,采用MTT法检测SMMC-7721细胞的增殖,RT-PCR和Western blot方法检测细胞内HSP70 mRNA和蛋白质的表达。结果Gln能显著促进SMMC-7721细胞增殖,当Gln浓度为2.0mmol/L时,SMMC-7721细胞的增殖达峰值。SMMC-7721细胞内有HSP70表达,Gln显著增加HSP70 mRNA和蛋白质的表达(P<0.05),当Gln浓度为2mmol/L时,HSP70表达量最高。结论诱导SMMC-7721细胞HSP70表达增高可能是Gln促肿瘤生长的作用机制之一。     

抑制ClC-3表达促进顺铂诱导人卵巢癌SKOV3/DDP细胞凋亡的作用机制

目的:探讨抑制ClC-3基因表达对顺铂(DDP)复制的人卵巢癌SKOV3/DDP细胞损伤促进作用过程中的具体作用机制,为应用DDP治疗卵巢癌提供实验依据。方法:转染pSH1-siRNA-ClC-3重组质粒到人卵巢癌SKOV3/DDP细胞,Western blotting方法观察热休克蛋白(HSP70)、溶酶体组织蛋白酶D(cathepsin D)蛋白表达。结果:与SKOV3细胞比较,SK-OV3/DDP细胞中HSP70蛋白表达增加(P<0.05)。转染pSH1-siRNA-ClC-3重组质粒联合DDP作用后,SKOV3/DDP细胞中HSP70蛋白表达降低(P<0.05),cathepsin D蛋白表达增加(P<0.05)。结论:抑制ClC-3基因表达促进顺铂诱导SKOV3/DDP细胞凋亡的可能作用机制与溶酶体膜通透性(LMP)增加有关。     

预热诱导K_(562)细胞热应激蛋白70高表达对高温引起细胞凋亡的影响

为初步观察预热诱导的应激蛋白 70 (HSP70 )高表达对高温所致细胞凋亡影响 ,用 40℃预热诱导K5 6 2 细胞产生应激蛋白 70高表达 ,用 RT- PCR半定量法检测细胞应激蛋白表达情况 ,然后分别将预热细胞和对照细胞置于 43℃用高温诱导细胞凋亡 ,用流式细胞仪检测细胞凋亡率 ,判断 HSP70高表达对细胞凋亡的影响。用 RT- PCR检测发现 ,随着细胞预热时间的延长 ,细胞 HSP70合成明显增加 ,到 12 0 min时达到最高 ,高水平可以维持数小时 ;43℃高温处理后 ,未预热组的细胞凋亡率明显高于预热细胞 ;预热时间长的细胞组细胞凋亡率明显低于预热时间短的细胞组。提示 HSP70高表达可以抑制高温所致的 K5 6 2 细胞凋亡。     

神经生长因子对2,5-己二酮致运动神经元线粒体功能损伤的影响

目的探讨神经生长因子(NGF)对2,5-己二酮所致运动神经元细胞线粒体功能损伤的影响。方法用10mmol/L和20mmol/L2,5-己二酮给运动神经元VSC4.1细胞处理12h后,检测VSC4.1细胞活性,NGF的蛋白表达以及线粒体膜电位的变化;20mmol/L2,5-己二酮与VSC4.1细胞作用12h后,去除2,5-己二酮加入不同浓度的NGF,检测细胞活性和线粒体膜电位的变化。结果10mmol/L和20mmol/L2,5-己二酮与运动运动神经元VSC4.1细胞共同培养12h后,细胞活性分别下降了17%和23%;VSC4.1细胞内NGF的表达分别下降了33.5%和34%;线粒体膜电位由39.36分别下降到29.57和23.80。VSC4.1细胞与2,5-己二酮作用12h后用50ng/ml和100ng/mlNGF处理,细胞的活性增加了6.38%和23.40%;细胞线粒体膜电位也由26.03增加到30.18和31.50(P<0.05)。结论NGF可以通过改善线粒体膜电位来修复2,5-己二酮导致的运动神经元线粒体功能损伤。     

预热对K_(562)细胞化疗药物体外敏感性的影响

目的：研究预热对肿瘤细胞化疗药物敏感性的影响并初步探讨其可能机理。方法：对Ｋ５６２细胞预热应激,用ＲＴ－ＰＣＲ检测细胞热应激蛋白７０（ＨＳＰ７０）,并用ＭＴＴ比色法观察细胞对化疗药物体外敏感性的变化。结果：预热使Ｋ５６２细胞ＨＳＰ７０明显增多,且在预热２ｈ后达到最高;在常规剂量下（临床一次用量的１／２５０）未预热Ｋ５６２细胞对阿霉素（ＡＤＭ,０．４ｍｇ／Ｌ）及环磷酰胺（ＣＴＸ,０．８ｍｇ／Ｌ）中度敏感;预热应激后,Ｋ５６２细胞对这两种同剂量药物均轻度敏感或不敏感;并检测了这两种药物的浓度梯度。结论：热应激可以降低肿瘤细胞对化疗药物的敏感性;推测ＨＳＰ７０表达增强可能是肿瘤热疗效果和化疗药物敏感性降低的直接原因。     

丝裂原活化蛋白激酶信号途径在苯并[a]芘影响内皮细胞热休克蛋白70基因表达中的作用

目的研究丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号途径在苯并[a]芘(BaP)影响内皮细胞热休克蛋白70(HSP70)基因表达中的作用.方法猪主动脉内皮细胞以不同浓度BaP(0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μmol/L)染毒24 h,或以PD98059(10μmol/L)或SB203580(20μmol/L)预处理1 h后再加一定剂量的BaP共同孵育24 h.分别以Western-blot法检测各组细胞磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶(extracellularsignal regulated protein kinase,ERK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase,JNK)、磷酸化p38和HSP70表达水平的改变.结果随BaP浓度的升高,MAPK途径的3种磷酸化激酶表达水平出现不同程度的改变,其中磷酸化ERK1表达改变最明显,呈剂量反应性增加.BaP抑制内皮细胞HSP70表达,在中、高剂量(≥1.0μmol/L)暴露时,HSP70表达明显低于对照组,差异有显著性(P＜0.05);尽管ERK途径抑制剂PD98059可部分减弱BaP对HSP70表达的抑制效应,但经PD98059预处理后内皮细胞HSP70表达水平仍明显低于正常状态下的表达水平,差异亦有显著性(P＜0.05).结论BaP可能通过ERK1途径而影响内皮细胞HSP70基因表达,同时可能还有其他信号途径在BaP影响HSP70基因表达过程中起作用.