低渗液对星形胶质细胞水通道蛋白-9表达的影响

目的探讨体外培养星形胶质细胞在低渗状态下水通道蛋白-9(aquaporin-9,AQP9)表达的变化特点及其所起的作用。方法取生后2d的Wistar大鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养,随机分为对照组和低渗组(又分268、254、240mmol/L三个组),每组分为3、6、12、24h共4个时间点,每个时间点细胞孔数为6。对照组予正常培养液常规培养,低渗组分别予不同渗透压的低渗液作用于细胞,建立星形胶质细胞对低渗液反应的实验模型。通过采用原位杂交检测AQP9mRNA的表达,乳酸脱氢酶活性的测定及图像分析等方法研究星形胶质细胞对低渗液的反应及AQP9的表达变化。结果对照组在正常渗透压培养液中培养3、6、12、24h后,AQP9表达差异无统计学意义(P>0.05)。在相同的作用时间条件下,各低渗组细胞AQP9mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.05)。尤以作用12h后明显,而且与作用时间和低渗液的程度密切相关;同时细胞存活能力明显下降,其严重程度与低渗液的作用时间和渗透压有关。结论低渗液可导致细胞的生存能力下降、AQP9mRNA表达增强,提示星形胶质细胞AQP9的表达与渗透压可能直接相关,AQP9可能参与脑水肿的形成。     

星形胶质细胞水通道蛋白-4在高渗液中的表达变化

目的研究高渗培养液对体外培养星形胶质细胞表达水通道蛋白-4(Aquaporin-4,AQP4)的影响及AQP4在高渗性脱水中的作用.方法取生后2 d的Wistar大鼠的大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养,分别予不同程度的高渗培养液作用于星形胶质细胞,建立星形胶质细胞对高渗液反应的实验模型.通过形态学观察、PT-PCR、免疫细胞化学、四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及图像分析等方法,研究体外星形胶质细胞对高渗液的反应及AQP4 mRNA和蛋白的表达变化.结果高渗组各时相点吸光度A值均低于对照组(P＜0.05),星形胶质细胞表现出特征性的细胞脱水形态学变化,AQP4mRNA和蛋白的表达均显著高于对照组(P＜0.01),尤以作用12 h后最明显,而且AQP4 mRNA和蛋白的表达呈显著正相关(rs＞0.8485,Ps＜0.01).结论在高渗状态下,AQP4 mRNA和蛋白的表达增强,AQP4表达上调在高渗性脱水的早期(＜12 h)可能起到重要的代偿作用.     

高渗液对体外培养星形胶质细胞中水通道蛋白4 mRNA表达的影响

目的　研究体外培养星形胶质细胞高渗状态下水通道蛋白 4 (AQP4 ) m RNA表达的变化特点及其所起的作用。方法　取生后 2 d的新生 Wistar大鼠大脑皮质进行星形胶质细胞纯培养 ,分别用不同渗透压的高渗培养液作用于星形胶质细胞 ,建立星形胶质细胞对高渗反应的实验模型 ;采用原位杂交、乳酸脱氢酶(L DH)活性测定及图像分析等方法 ,研究体外培养星形胶质细胞对高渗液的反应和 AQP4 m RNA的表达规律。结果　 32 0、333和 345 m mol/ L的高渗培养液作用于星形胶质细胞 3、6、12和 2 4 h后 ,L DH活性测定的吸光度 A值在各时间点均显著高于对照组 (P均 <0 .0 5 ) ;原位杂交分析表明 ,AQP4 m RNA表达明显增高 ,与正常组相比有显著意义 ,尤以高渗液作用 12 h时最明显 ,而且与作用时间及渗透压相关。结论　在高渗状态下 ,细胞活性明显下降 ,AQP4 m RNA表达增强。 AQP4可能在高渗性脱水的早期起重要的调节作用。     

星形胶质细胞AQP9在高渗液中的表达变化

目的 研究星形胶质细胞水通道蛋白-9(aquaporin-9,AQP9)在高渗培养液中的表达变化及AQP9在高渗性脱水中的作用.方法 取生后2 d的新生Wistar大鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养,分别予不同程度的高渗堵养液作用于细胞,建立星形胶质细胞对高渗液反应的实验模型.通过免疫细胞化学和PT-PCR方法研究星形胶质细胞对高渗液的反应及AQP9mRNA和蛋白的表达变化.结果 星形胶质细胞经渗透压为320、333 mmol/L的培养液作用3、6、12、24 h后,AQP9 mRNA和蛋白的表达均显著高于对照组(P<0.05),尤以作用6 h后较明显,而且AQP9 mRNA和蛋白的表达呈显著正相关(r>0.7971,P<0.01).结论 高渗引起AQP9基因表达上调,AQP9在高渗性脱水的早期可能起到重要的代偿作用.     

谷氨酸引起培养大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4表达动态变化

目的研究谷氨酸是否引起培养大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)表达变化。方法利用传代培养至10d左右的大鼠星形胶质细胞,给予1mmol/LL-谷氨酸钠,分别作用1h、3h、6h、12h、24h、48h后进行细胞形态学观察、GFAP免疫化学染色及荧光定量PCR检测AQP4mRNA表达变化。结果谷氨酸作用1h后星形胶质细胞出现肿胀并随着作用时间延长肿胀持续,AQP4mRNA3h时开始出现表达降低(P0.05),后随谷氨酸作用时间延长先下调后上调,12h达最低(P0.01),48h升至高于正常(P0.05)。结论AQP4可能在谷氨酸引起星形胶质细胞肿胀发生发展中发挥作用。     

体外培养大鼠星形胶质细胞水通道蛋白4的表达

目的研究水通道蛋白4(AQP4)在体外培养大鼠星形胶质细胞中的表达规律。方法取新生1 d Wistar大鼠大脑皮层行星形胶质细胞原代培养,分别于原代培养3 d、5 d、7 d、9 d及传代培养9 d行胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色;实时荧光定量聚合酶链反应及AQP4免疫荧光染色检测AQP4 m RNA及蛋白的表达。结果原代及传代培养不同时间点95%以上细胞GFAP免疫荧光染色阳性,且GFAP表达量逐渐增加。原代培养3 d有AQP4 m RNA表达,3 d和5 d AQP4 m RNA表达水平无显著性差异(P0.05),7 d AQP4 m RNA表达升高(P0.05),9 d持续升高(P0.05);传代培养9 d与原代培养9 d AQP4 m RNA表达无显著性差异(P0.05)。AQP4蛋白表达与AQP4 m RNA表达一致。结论大鼠星形胶质细胞原代培养3 d即有AQP4表达,之后逐渐增加,9 d左右表达渐趋稳定。     

水通道蛋白4示踪系统的构建及评价

目的构建绿色荧光蛋白（GFP）标识的水通道蛋白4（AQP4）示踪系统,建立表达AQP4的大鼠星形胶质细胞水通透性的评价系统。方法利用基因重组技术,构建pEGFP-C1AQP4-M23表达质粒,并转染CTX-TNA2星形胶质细胞,利用激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）成像技术分析GFP标记的AQP4-M23在细胞上的分布,动态观察钙黄绿素荧光强度随时间的变化,评价AQP4．M23对细胞膜水通透性的影响。结果正确获取AQP4-M23全长序列,利用基因重组技术连接pEGFP-C1质粒和AQP4．M23序列,酶切证实成功构建pEGFP—C1-AQP4-M23质粒。LSCM扫描显示GFP标记的AQP4-M23融合蛋白在细胞膜上均匀分布表达,胞浆内仅痕量表达;表达AQP4．M23的CTX-TNA2细胞对水的通透性明显增加（P〈0．01）。结论成功构建了GFP标识的AQP4示踪系统,建立了表达AQP4的大鼠星形胶质细胞水通透性的评价系统,AQP4可使星形胶质细胞对水的通透性明显增加。     

抗呆Ⅰ号对体外模拟脑缺血再灌注损伤星形胶质细胞的影响

目的：观察体外培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞在模拟脑缺血再灌注损伤中的活性、存活率和无血清条件培养液蛋白含量的变化以及中药抗呆Ⅰ号的影响。方法：先对分离纯化培养的星形胶质细胞进行体外模拟脑缺血再灌注损伤模型的建立，然后采用MTT法对星形胶质细胞的活性和存活率进行测定以及用Bradform法对星形胶质细胞条件培养液中蛋白质含量进行测定。结果：体外培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞在体外模拟脑缺血再灌注损伤中的活性、存活率、无血清条件培养液蛋白含量的变化具有一定的规律性，可分细胞损伤期、功能代偿期、功能低下期和功能恢复期。抗呆Ⅰ号可使受损的星形胶质细胞的活性明显增强(与模型组相比多数时间点比较(t=2．074，P&;lt;0．05)。存活率显著提高(与模型组相比多数时间点P&;lt;0．05，t&;gt;2．219)，使其条件培养液中的蛋白含量迅速增高(与模型组相比多数时间点，t&;gt;5．087，P&;lt;0．001)。结论：抗呆Ⅰ号可能通过保护星形胶质细胞免受损伤或使其分泌功能增强，从而间接地发挥星形胶质细胞对神经元的保护和修复作用。     

抗呆I号对体外模拟脑缺血再灌注损伤星形胶质细胞的影响

目的:观察体外培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞在模拟脑缺血再灌注损伤中的活性、存活率和无血清条件培养液蛋白含量的变化以及中药抗呆Ⅰ号的影响。方法:先对分离纯化培养的星形胶质细胞进行体外模拟脑缺血再灌注损伤模型的建立,然后采用MTT法对星形胶质细胞的活性和存活率进行测定以及用Bradform法对星形胶质细胞条件培养液中蛋白质含量进行测定。结果:体外培养的大鼠大脑皮质星形胶质细胞在体外模拟脑缺血再灌注损伤中的活性、存活率、无血清条件培养液蛋白含量的变化具有一定的规律性,可分细胞损伤期、功能代偿期、功能低下期和功能恢复期。抗呆Ⅰ号可使受损的星形胶质细胞的活性明显增强(与模型组相比多数时间点比较(t=2.074,P<0.05)。存活率显著提高(与模型组相比多数时间点P<0.05,t>2.219),使其条件培养液中的蛋白含量迅速增高(与模型组相比多数时间点,t>5.087,P<0.001)。结论:抗呆Ⅰ号可能通过保护星形胶质细胞免受损伤或使其分泌功能增强,从而间接地发挥星形胶质细胞对神经元的保护和修复作用。     

视神经脊髓炎IgG刺激原代培养大鼠星形胶质细胞免疫反应

视神经脊髓炎(NMO)主要累及星形胶质细胞,导致中枢神经系统炎症、脱髓鞘和组织损伤。脑内病灶常高表达水通道蛋白4(AQP4),AQP4被认为是NMO血清IgG的抗原目标。根据NMO的可逆性及对NMO病灶演变特点的分析,笔者推测NMO IgG可能诱导了星形胶质细胞的动态免疫过程。培养原代大鼠星形胶质细胞,加入从NMO患者血清中提取或纯化的IgG,星形胶质细胞出现炎性增殖,同时基因表达出现与之匹配的明显变化。且星形胶质细胞反应因子脂质运载蛋白-2、多种趋化因子、细胞因子、应激反应因子的表达均增加。而在培养的原代星形胶质细胞中加入从正常对照者血清中提取的IgG则无上述变化。此星形胶质细胞的反应还与疾病种类相关。从复发缓解型多发硬化、Sj觟gren's或系统性红斑狼疮患者血清中提取的IgG加入培养的原代星形胶质细胞中也不能导致上述变化。笔者推测是NMO IgG与AQP4结合,导致星形胶质细胞出现炎症反应,并出现基因在转录和翻译水平的相应变化。抑制星形胶质细胞的炎症反应可能有助于减少星形胶质细胞增殖,缓解NMO病灶的发展。     

细胞松弛素D对大鼠脊髓星形胶质细胞水通道蛋白和内向整流性钾通道4.1 基因表达的影响

目的探讨不同浓度细胞松弛素D(CytD)对大鼠脊髓星形胶质细胞骨架重构,水通道蛋白(AQP)1、AQP4 及内向整流性钾通道4.1(Kir4.1)基因表达的影响。方法原代培养大鼠脊髓星形胶质细胞,加CytD 0.05 μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml、0.40μg/ml、0.80 μg/ml 和1.00 μg/ml 共培养2 h、12 h 和24 h。MTT法检测细胞增殖情况;鬼笔环肽联合Hoechst 33342 套染后激光共聚焦显微镜下观察共培养2 h 后细胞骨架重构情况;RT-PCR法检测共培养2 h 时AQP1、AQP4 和Kir4.1 mRNA表达水平。结果细胞生存率随CytD 浓度升高和作用时间延长而减少。CytD 使大鼠脊髓星形胶质细胞微丝发生解聚、弯曲,但极性未失。CytD 0.05μg/ml、0.10 μg/ml、0.20 μg/ml 和0.40 μg/ml 上调AQP1、AQP4 和Kir4.1 mRNA表达。结论适当浓度CytD可以重建星形胶质细胞骨架,上调大鼠脊髓星形胶质细胞AQP1、AQP4和Kir4.1基因表达。     

水通道蛋白 4 在大鼠脑缺血再灌注后脑水肿中的变化及意义

目的基于大鼠局灶性脑损伤缺血再灌注模型,观察水通道蛋白 4（AQP4）、蛋白激酶 C（PKC）的表达水平变化与脑水肿的关系。 方法线栓法复制大脑中动脉缺血再灌注模型,大鼠随机分为正常对照组、假手术组和缺血再灌注（CIR）组。通过绿色荧光蛋白 G FP 标识的 AQP4 示踪系统评价大鼠星形胶质细胞的水通透性,同时检测脑组织含水量和进行神经功能缺损评分。 AQP4 和 PKC 的表达使用免疫组织化学方法检测。 结果CIR 后 6 h 大鼠开始出现神经功能缺损,脑组织含水量在 CIR 12 h 明显升高,24 h~3 d 时达到高峰;AQP4 表达在早期水平降低,从 12 h 逐渐升高,至 CIR 24 h 明显升高,3 d 达高峰;PKC 在 CIR 6 h 后缓慢增加,连续 5 d 维持较高水平。 结论脑水肿可能和 PKC、AQP4 的升高相关,PKC 可能在 CIR 早期通过磷酸化 AQP4 以降低 AQP4 的表达以延缓脑水肿进程。      

即时高压氧治疗对大鼠脑缺血后脑水肿及水通道蛋白4 表达的影响

目的观察即时高压氧治疗对缺血早期脑水肿形成的影响,并探讨其可能的机制。方法健康成年雄性清洁级Sprague-Dawley 大鼠18 只,随机分为假手术组(n=6)、对照组(n=6)和高压氧组(n=6)。对照组及高压氧组采用线栓法制备大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型,其中高压氧组在舱内升压时进行模型制备并予高压氧治疗60 min。各组均于术后6 h 行Longa 评分法评分,采用干湿比重法检测脑组织含水量,免疫组化SP 法观察水通道蛋白4 (AQP4)表达,应用图像分析系统进行半定量分析。结果与对照组比较,高压氧组大鼠神经功能评分改善(P<0.05),缺血半球脑含水量减少(P<0.05),AQP4 表达量减少(P<0.05)。结论即时高压氧治疗可有效缓解脑缺血后症状,对脑水肿的发生有抑制作用;AQP4 表达减少可能是其机制之一。     

依达拉奉对心肺复苏后脑水通道蛋白-4表达的影响

目的 探讨大鼠心肺复苏后脑水通道蛋白-4(AQP4)表达与脑水肿动态变化的关系,评价依达拉奉的干预作用.方法 72只雄性SD大鼠随机分为4组:正常对照组(A组,6只),假手术组(B组,6只),复苏组(C组,按ROSC后1 h,6 h、12 h、24 h、72 h各时点分5亚组,各6只),依达拉奉处理组(D组,亚组同C组),复苏即刻予以依达拉奉干预.分别测定脑组织含水量,免疫组化法检测其AQP4蛋白表达,行神经功能缺损评分(neurodeficit score,NDS)及脑组织病理形态学观察.结果 C组大鼠ROSC后脑组织含水量呈上升趋势,24 h达高峰,各时点均高于B组(P<0.01).AQP4表达呈现与脑含水量同样趋势改变,积分光密度(iOD)、显色面积比(△S)增加(P<0.01),相关性分析表明iOD(r=0.858,P<0.01)、AS(r=0.870,P<0.01)与脑组织含水量呈正相关.与C组相比,依达拉奉干预处理后脑组织含水量明显下降(P<0.05);AQP4蛋白iOD、△S显著下调(P<0.01);病理学损伤程度减轻,NDS评分显著提高(P<0.05).结论 大鼠心肺复苏后脑AQP4表达上调,与脑水肿变化正相关,AQP4可能参与心肺复苏后脑水肿形成.依达拉奉可抑制AQP4表达,减轻大鼠心肺复苏后脑水肿,具有脑保护作用     

Hypertonic saline reduces lipopolysaccharide-induced mouse brain edema through inhibiting aquaporin 4 expression

Introduction

Three percent sodium chloride (NaCl) treatment has been shown to reduce brain edema and inhibited brain aquaporin 4 (AQP4) expression in bacterial meningitis induced by Escherichia coli. Lipopolysaccharide (LPS) is the main pathogenic component of E. coli. We aimed to explore the effect of 3% NaCl in mouse brain edema induced by LPS, as well as to elucidate the potential mechanisms of action.

Methods

Three percent NaCl was used to treat cerebral edema induced by LPS in mice in vivo. Brain water content, IL-1β, TNFα, immunoglobulin G (IgG), AQP4 mRNA and protein were measured in brain tissues. IL-1β, 3% NaCl and calphostin C (a specific inhibitor of protein kinase C) were used to treat the primary astrocytes in vitro. AQP4 mRNA and protein were measured in astrocytes. Differences in various groups were determined by one-way analysis of variance.

Results

Three percent NaCl attenuated the increase of brain water content, IL-1β, TNFα, IgG, AQP4 mRNA and protein in brain tissues induced by LPS. Three percent NaCl inhibited the increase of AQP4 mRNA and protein in astrocytes induced by IL-1β in vitro. Calphostin C blocked the decrease of AQP4 mRNA and protein in astrocytes induced by 3% NaCl in vitro.

Conclusions

Osmotherapy with 3% NaCl ameliorated LPS-induced cerebral edema in vivo. In addition to its osmotic force, 3% NaCl exerted anti-edema effects possibly through down-regulating the expression of proinflammatory cytokines (IL-1β and TNFα) and inhibiting the expression of AQP4 induced by proinflammatory cytokines. Three percent NaCl attenuated the expression of AQP4 through activation of protein kinase C in astrocytes.     

醒脑静治疗大鼠重型颅脑损伤的作用机制

目的观察醒脑法与传统活血法对重型颅脑损伤大鼠脑组织水肿、凋亡及水通道蛋白4（AQP4）表达的影响,探讨其治疗颅脑损伤的疗效差异及作用机制。 方法SD大鼠72只,随机分为假手术组（12只）,模型组（20只）,醒脑静治疗组（20只）,传统活血治疗组（20只）。采用改良后Feeney方法建立大鼠重型颅脑损伤模型。分别在24 h,48 h,72 h,7 d 4个时间点,假手术组取3只、余各组取5只测定脑组织含水量、HE染色观察脑组织变化情况,免疫组化方法检测受损区域脑组织AQP4的表达并采用TUNEL法检测凋亡细胞,通过RT-PCR验证治疗后AQP4表达水平。 结果模型组各时间点脑组织含水量、损伤灶周围细胞凋亡数及AQP4的表达均高于假手术组,差异具有统计学意义（P<0.05）。醒脑静组及传统活血组各时间点脑组织含水量、AQP4表达水平、细胞凋亡水平均比模型组降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,RT-PCR支持AQP4变化结果。 结论醒脑静可改善重型颅脑损伤后引起的脑水肿及细胞凋亡,效果优于传统活血疗法。其作用机制可能与抑制AQP4在损伤脑组织中的表达、减轻脑细胞损害有关。