骨髓造血干细胞分离 保存的研究

目的探讨骨髓造血干细胞分离及保存的方法。方法应用羟乙基淀粉(HES)或percoll液分离骨髓造血干细胞;联合应用二甲基亚砜(DMSO)和HES对造血干细胞进行液氮保存。应用血细胞计数法、锥虫蓝拒染实验、粒-巨噬细胞集落生成单位(CFU-GM)的体外培养等方法对造血干细胞冷冻前后的有核细胞(NC)数、存活率、体外分化能力进行检测;应用流式分析法计数CD34+细胞数。结果利用HES沉降法分离的单个核细胞数、CD34+细胞数、CFU-GM集落数均比percoll液离心法明显增多;骨髓造血干细胞冷冻保存1年后的有核细胞数、CD34+细胞数、锥虫蓝活率、CFU-GM集落计数与保存前差异无统计学意义。结论HES法分离骨髓造血干细胞方法安全、有效;通过程序降温,联合使用DMSO及HES的低温冻存方法对骨髓造血干细胞的长期保存是适合的。     

脐血CD34+细胞向巨核系定向扩增的初步探讨

目的探讨不同细胞因子组合定向诱导CD34 细胞向巨核系分化的能力。方法利用免疫磁珠法(MACS)分离纯化脐血CD34 细胞,在无血清培养体系中以1×105/ml每孔接种,经不同细胞因子组合诱导培养。结果收集5份脐血标本,平均体积为95ml,CD34 细胞的比例为2.18%±0.89%,经过MACS分选后,CD34 细胞纯度平均可达81.55%。在细胞生长因子的刺激培养下,MK3组有核细胞数,CD34 细胞数,CD41a 细胞数在培养第16天分别达277.4倍、6.89倍、66.79倍,高于其它各组。结论脐血CD34 细胞体外在相关细胞生长因子的刺激下可向巨核细胞系定向分化。     

利用诱导性多能干细胞技术体外扩增造血干/祖细胞的初步研究

目的 利用诱导性多能干细胞技术体外扩增造血干/祖细胞.方法 利用非整合型载体,将四个转录因子:Sox2、Klf4、Oct4和c-Myc导入脐血来源的造血干/祖细胞(CD34+细胞)重编程获得诱导性多能干细胞(iPSCs),再利用与小鼠骨髓基质细胞OP9共培养法将其定向分化成CD34+造血干/祖细胞.借助iPSCs可以在体外无限传代、大量扩增的特点,实现体外保存及大量扩增造血干/祖细胞的目的.结果 脐血CD34+细胞可以在体外重编程为非整合型iPSCs,并能够高效定向分化成为CD34+细胞,其分化效率比胚胎干细胞(ESCs)有显著提高.结论 利用诱导性多能干细胞技术体外大量扩增脐血造血干/祖细胞是一个可行的方案,具有良好的应用前景.     

骨髓间充质干细胞对造血干细胞"干性"的保持作用

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)对造血干细胞(HSCs)"干性"的保持作用及其机制.方法 免疫磁珠分离纯化脐血HSCs-CD34+细胞,并分组培养:A组,CD34+细胞单独培养;B组,加细胞因子;C组,加细胞因子和MSCs(直接接触);D组,加细胞因子和MSCs(不接触);E组,加MSCs(直接接触);F组,加Mscs(不接触).0、7、14 d分别计扩增倍数、单位细胞数形成集落能力、CD34+比率,计数7 d时各组CD34+、CD34+CD38-比率.结果 随着时间延长扩增倍数增加(尤其B组),形成集落的能力和CD34+细胞比率渐下降,但E、F组下降不明显.结论 以MSCs为滋养层,对HSCs扩增作用不明显,但可更好地保持HSCs的"干性";这种保持"干性"的作用依赖于细胞与细胞间的相互黏附作用.     

血液肿瘤自体造血干细胞移植后患者的DC/CIK培养及临床应用安全性观察

目的采用自体造血干细胞移植后完全缓解的血液肿瘤患者的外周血单个核细胞,经体外培养扩增出树突状细胞(dendritic cell DC)/细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell CIK),应用DC/CIK细胞免疫治疗自体造血干细胞移植后完全缓解血液肿瘤患者,观察其不良反应。方法采集10例血液肿瘤自体造血干细胞移植后完全缓解患者的外周血单个核细胞,在体外经GM-CSF、IL-4、TNF-α等诱导产生DC,经IFN-γ、抗CD3单抗、IL-2等诱导产生CIK,观察其细胞形态及临床应用的不良反应并分析其细胞免疫表型。结果培养产生形态学典型的DC/CIK。诱导成熟的DC经流式细胞仪分析显示CD80、CD83、CD86、CD1a等阳性细胞比率大幅上升。CIK随着培养时间的延长,CD3+CD56+、CD3+CD8+双阳性细胞的比率亦大幅度上升。在DC/CIK细胞免疫治疗过程中,3例患者DC注射部位出现轻微疼痛,可自行缓解。2例患者输注CIK后出现低热,持续时间2～6h,可自行消退。4例患者输注完CIK后出现乏力,约2h可自行缓解。结论自体造血干细胞移植后完全缓解患者的外周血单个核细胞对DC/CIK的培养不受影响。DC/CIK细胞免疫治疗自体造血干细胞移植后完全缓解的血液肿瘤患者,安全性好,不良反应少。     

系统性红斑狼疮患者血清IL-6对造血干细胞分化发育为树突状细胞的影响

目的 观察系统性红斑狼疮(SLE)患者血清中的白细胞介素6(IL-6)对脐血CD34 造血干细胞(HPC)体外诱导分化为树突状细胞(DCs)的影响.方法 淋巴细胞分离液分离获得脐血单个核细胞,免疫磁珠阳性分选CD34 HPC,采用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF) IL- 4 肿瘤坏死因子α(TNF-α)方案体外诱导分化形成DCs,加入高IL-6水平的SLE患者血清观察对细胞分化的影响.在培养的7、10和14d收集细胞,流式细胞术检测表型,细胞增殖/毒性(CCK-8)试剂盒分析DCs刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力.结果 在高IL-6水平SLE血清的作用下,由HPC分化而来的DCs表达CD80、CD86上升,刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力增强;IL-6中和抗体能够降低这种DCs的CD80、CD86表达水平和对同种异体淋巴细胞增殖的刺激能力.结论 SLE血清中的IL-6对造血干细胞向DCs分化、发育及DCs功能的活化可能起促进作用.     

人脐血源性间充质干细胞的体外培养及生物学鉴定

目的 建立体外培养、扩增人脐带血间充质干细胞(MSCs)的方法．初步鉴定其生物学特性。方法 无菌条件下取正常足月剖宫产的脐带血,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞．以偏酸性的Mesencult^TM作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细咆层,测定MSCs的生长曲线．用流式细胞技术分析细胞的表面抗原。结果 来源于脐血的单个核细胞存体外用合适的培养基培养,细胞贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞。间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达MSCs相关的抗原CD29、CD44、CD105。但不表达CD34、CD45、CD106和HLA-DR。这与源于骨髓的MSCs一致。结论 脐带血中含有的MSCs可在体外培养、扩增,能够为实验和临床的应用提供一种新的间充质干细胞来源。     

人骨髓间充质干细胞联合细胞因子的无血清培养体系体外扩增脐血干细胞研究

目的 探讨以人骨髓间充质干细胞(BM-MSC)为基质的无血清培养方法，体外扩增脐血造血干细胞(CBSC)，研究BM-MSC支持造血的功能和体外扩增时间的选择。方法 用含血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、flt3／flk2配体(FL)和粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)的无血清培养液，以人BM-MSC为基质，比较体外扩增脐血CD34^ 细胞7d及14d后总细胞(TC)、CD34^ 细胞和集落形成单位(CFU)数增加倍数。结果在以人BM-MSC为基质及TPO、FL、SCF和G-CSF这四种细胞因子作用下，经体外扩增7d后TC、CD34^ 细胞、CFU-GM和CFU-C数较起始分别增加了87、16、15和26倍；14d后较起始分别增加了427、38、125和104倍，与7d扩增倍数有显著性差异。结论以人BM-MSC为基质的无血清体外培养体系可以有效扩增CBSC，有潜在的临床应用价值，扩增时间应以14d为宜。     

转HOXB4基因人骨髓MSC促进脐血CD34~+细胞体外扩增

目的 研究转HOXB4基因的人骨髓间充质干细胞(MSC)对脐血CD34~+细胞体外扩增的支持作用.方法 用病毒载体质粒转染包装细胞293T,收获病毒上清(VCM)感染MSC后,用潮霉素筛选获得转HOXB4的MSC(MSC-HOX).分别将MSC(对照组)与MSC-HOX细胞(实验组)作为CD34~+细胞体外扩增的饲养层细胞,结合细胞因子Fh3/Flk3配体(FL)、促血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)和粒细胞-集落生长因子(G-CSF)体外扩增脐血CD34~+细胞10 d,收集所有脐血细胞,检测细胞总数、CD34~+细胞总数,集落细胞形成单位(CFU)数.结果 生产重组逆转录病毒可有效将HOXB4基因转入靶细胞内并表达.脐血CD34~+细胞经体外扩增10 d后,细胞总数和CFU数两组间差异无统计学意义(P>0.05),脐血CD34~+细胞总数和比例高于对照组(P<0.05).结论 转HOXB4基因的人骨髓MSC在脐血CD34~+细胞体外扩增中,可保持CD34~+细胞未分化状态,有潜在的应用价值.     

脐血造血细胞扩增后细胞成分的变化

目的　探讨人脐血造血细胞体外扩增细胞数量和质量的变化及收获的最佳时机。方法　用重组人白细胞介素 - 3(rh IL- 3)、粒单集落刺激因子 (GM- CSF)和重组促红细胞生成素 (rh EPO)长期培养人脐血单个核细胞 ,动态观察其细胞构成和集落生成能力。结果　培养 1周后细胞总数逐渐增多 ,3周末细胞总数最多 ,扩增倍数为 (8± 4)倍 ,细胞构成则以髓系细胞为主 ;淋巴细胞 (CD3+ 、CD19+ )培养 1周明显下降 ,2周后低水平维持 ;培养 2周时 CD34+ 细胞百分比最高 ,为 (2 .4± 0 .7) % ,培养 3周时 CD34+ 细胞扩增倍数最大 ,为 (30± 7)倍 ,其中CD33+ CD34+ 细胞扩增倍数为 (4 5± 5 )倍。 CD71+ 细胞以培养 2周时最多 ,最高为 (5 1± 8) % ;CD42 a+ 细胞培养 3周时最高 ;单位数量细胞集落生成能力培养 ,1周时最大 ,但总的集落生成能力第 3周时最大。结论　含有上述生长因子的培养体系主要扩增脐血造血细胞的髓系细胞 ,次要扩增红系、巨核系细胞 ,最佳扩增时机为 3周。     

脐血贴壁细胞体外培养的动态观察

用脐血MNC体外培养方法，观察脐血造血干细胞在细胞因子作用下形成的贴壁细胞，及其在形态学、组织化学和对造血于细胞生长增殖等方面的动态变化。结果显示：培养两周后的脐血贴壁生长细胞形态以上圆形、椭圆形内皮样细胞和巨噬细胞为主，膜分化抗原主要表达髓系抗原。脐血贴壁生长细胞形成后对造血干细胞的生长增殖具有良好支持作用。研究为实行造血基质细胞体外扩增应用于临床重建骨髓造血微环境提供了实验依据。     

六种重组细胞因子对人骨髓造血细胞的体外扩增效应

目的 :观察造血生长因子对骨髓CD34 +细胞的扩增效应及扩增细胞的分化特性。方法 :采用重组人白细胞介素 (rhIL) 1 +rhIL 3+rhIL6 +重组人粒细胞集落刺激因子 +重组人粒 巨噬细胞集落刺激因子和重组人干细胞因子对人骨髓单个核细胞 (MNC)进行刺激 ,动态观察了经上述细胞因子作用后MNC的增殖效应及液态扩增培养后粒 巨噬集落形成率 (CFU GM ) ,利用流式细胞技术 (FACS)分析了扩增前后CD34 +细胞及其亚群的动态变化。结果 :经上述 6种细胞因子作用 2 4d ,骨髓MNC总数是原代MNC的 38.33倍 ,液态扩增 1 0d后 ,CFU GM的数量达高峰 ,是原代MNC的 1 9.0 4倍 ,2 4d时CFU GM总数降至 3.94倍 ,且集落明显小于扩增初期。扩增至 6～ 1 0d ,CD34 +细胞总数是原代MNC的 1 36 .40～ 90 .40倍 ,1 9d时降为 6 1 .40倍。结论 :外源性造血生长因子对CD34 +骨髓细胞具有较强的扩增效应 ,选择适宜的扩增时间是保证骨髓移植后尽快重建造血功能的重要环节。     

脐带间充质干细胞对脐血单个核细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察在低浓度血清培养下脐带间充质干细胞（UC—MSCs）对脐血单个核细胞（MNC）的增殖和凋亡的影响。方法：利用密度梯度法分离脐血单个核细胞，接种于脐带MSC建立的饲养层培养，通过计数细胞、半固体培养和流式细胞仪分别检测细胞的增殖和凋亡，以评价脐带MSC的支持造血功能和抗凋亡作用。结果：脐带间充质干细胞组单个核细胞总数及集落形成细胞（CFC）显著高于单培养组（P〈0．01），且单个核细胞凋亡率低于单培养组（P〈0．01）。结论：体外证实脐带MSC具有促进造血和抗凋亡作用。     

脐血间充质干细胞对系统性红斑狼疮患者细胞因子分泌的影响

目的：体外探讨脐血间充质干细胞（UCB－MSCs）对系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血单个核细胞（PBMNCs）细胞因子分泌的影响。方法①UCB－MSCs的分离、扩增及鉴定；②健康志愿者及SLE患者PBMNCs的分离。③UCB－MSCs与植物凝集素（ PHA）刺激的PBMNCs共培养， ELISA法检测共培养前后各组细胞培养上清液中IL－6、IL－10、IL－2、IL－12、IFN－γ的含量。结果①UCB－MSCs呈梭形贴壁生长，能在体外连续传代，均表达CD13、CD44、CD166，不表达 CD34、CD45；②UCB－MSCs能显著下调 SLE患者 PBMNCs中 IL－10、IL－6的分泌而上调 IL－2、IL－12、IFN－γ的分泌。结论 UCB－MSCs在体外能改变SLE患者的Th1／Th2极化状态。     

脐血造血干细胞分离方法的实验研究

目的 优化脐血造血干细胞/祖细胞的分离方法.方法 脐血按体积比1:5与含有树脂海绵筛(筛孔直径约12μm)的6%羟乙基淀粉混合,静置60min,提取界面有核细胞.倒置显微镜下计数有核细胞数,集落培养记数CFU-GM数,流式细胞仪检测CD34 细胞数,并与按照标准的羟乙基淀粉沉淀法和淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离的脐血相对照.结果 采用本实验方法分离脐血获得的有核细胞数、CFU-GM数和CD34 细胞数分别为(96.82±25.78)×105/ml,(66.70 ±12.47)×105,(1.33±0.57)×105/ml,明显高于由羟乙基淀粉沉淀法(70.72±20.93)×105/ml,(28.79±10.25)×105,(1.01±0.36)×105/ml和淋巴细胞分离液密度梯度离心法(25.33±7.27)X 105/ml,(20.13±7.55)×105,(0.34±0.01)×105/m1分离的脐血(P＜0.05).结论 本实验方法可由脐血中分离出大量的造血干/祖细胞,是一种分离脐血造血干/祖细胞的理想方法.     

rhBMP-2m对辐射小鼠骨髓CD34~+细胞变化的影响

目的　探讨小鼠受到辐射后 ,重组人骨形成蛋白成熟肽 2 (rhBMP 2m)对骨髓CD34+ 细胞变化的影响。方法　通过60 Coγ射线照射 ,建立小鼠骨髓造血损伤模型 ,经rhBMP 2m连续治疗后 ,骨髓单个核细胞计数 ,通过流式细胞仪检测骨髓单个核细胞中CD34+ 细胞比例 ,比较对照组和治疗组之间的差别。结果　经rhBMP 2m治疗的动物 ,单个核细胞数和CD34+ 细胞比例均明显高于照射对照组 ,P <0 0 5 ,n=6。结论　对于辐射引起的小鼠骨髓造血损伤 ,rhBMP 2m能够增加造血细胞数量 ,提高骨髓单个核细胞中CD34+ 细胞的比例 ,加快骨髓造血系统的重建。     

生长抑素对人脐血CD34^＋细胞增殖能力的影响

目的探索生长抑素（SST）对造血干／祖细胞增殖能力的影响以及可能机制。方法采用免疫磁殊分选技术纯化人脐血CD34^＋细胞;SST孵育人CD34^＋细胞后,体外集落形成、扩增培养了解细胞增殖;ELISA测定细胞内外TNF-α、TGF-β水平;RT—PCR分析其受体亚型。结果在1&#215;10^-6～1&#215;10^-10mol／L浓度范围内,SST抑制人CD34^＋细胞集落形成及扩增倍数,其细胞集落形成抑制与SST浓度呈正相关（r=0．903,P〈0．01）。SST使CD34^＋细胞内、外TNF-α及TGF-β1浓度显著增加（P〈0．05）;人脐血CD34^＋细胞表达SST-3型受体。结论SST通过人脐血CD34^＋细胞上SST-3型受体介导,提高造血抑制因子TNF-α、TGF-β水平,抑制人CD34^＋细胞的增殖、维持其干细胞特性。     

脐血造血细胞体外扩增及在再生障碍性贫血治疗中的应用

目的：探索脐血造血细胞体外培养后生物学特性变化及输液后对再生障碍性贫血（AA）患者造血恢复和重建的影响。方法：将脐血造血细胞在多种细胞因子组合下体外培养，同时进行CD34＋细胞及粘附分子表达检测，3天后收集输液给用常规治疗方法无效的急，慢性AA患者共50例。结果：脐血造血细胞在体外培养3天后CD34＋细胞和粘附分子的表达均增加，输注后的治愈率达56％，总有效率88％，随访3－5天，50％以上患者已不再服用任何药物，各项血液指标均正常。结论：脐血造血细胞经恰当的体外培养后可明显提高CD＋细胞和粘附分子的表达及归髓能力，输液治疗AA具有良好的疗效，值得进一步尝试。     

SD大鼠脂肪干细胞体外分离培养及造血因子表达情况的研究

目的建立一种体外分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,观察其增殖的规律,并探讨其造血因子的分泌情况。方法无菌技术下切取双侧腹股沟皮下脂肪垫,加入0.1%Ⅰ-型胶原酶消化获取细胞,接种入含10%胎牛血清的DMEM培养液,倒置显微镜下连续观察细胞形态变化,并用流式细胞学鉴定CD90、CD34、CD44、CD45、CDl06和CDllb的表达,ELISA法检测造血因子的表达,并作统计学分析。结果原代培养显示培养的脂肪干细胞24 h左右开始贴壁,8 d左右可达90%融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态,从第3代开始细胞稳定增殖,15代以前具有活跃的增殖能力。流式细胞学鉴定显示CD44、CD90、CDl06为阳性表达,CD34、CD45、和CDllb为阴性表达,脂肪干细胞能持续的表达G-CSF、GM-CSF、M-CSF、SCF、IL-6,统计学分析提示各代细胞因子的分泌呈缓慢下降趋势。结论成功地建立了一种分离培养大鼠脂肪干细胞的方法,其生长稳定、增殖较快,可以作为组织工程的种子细胞,其稳定的表达多种造血因子,找到了一条促进造血干细胞增殖的新途径。     

脐带血间质干细胞生物学特性研究

本文旨在探讨从人脐带静脉血是否可分离出基质干细胞,如果可以,确定它们的特性,方法是采用不支持造血干细胞生长的培养基培养脐血单个核细胞,对其生物学特性进行研究。1资料与方法1.112份脐血采至厦门市中山医院,每份30～60ml。1.2基质细胞的分离与培养经新生儿父母同意,于厦门市中