应用二甲基亚砜体外诱导P19细胞分化为心肌细胞

目的观察P19细胞经二甲基亚砜（DMSO）诱导及不同培养方法,培养形成细胞聚集体并向心肌分化的过程.方法将P19细胞接种于Petri塑料培养皿或铺有0.5%软琼脂的培养皿中,DMSO诱导悬浮培养7 d形成细胞聚集体,将聚集体用生长培养基黏附培养至19 d.观察细胞跳动情况,用α-sarcomeric actin、cardiac Troponin T（cTnT）抗体进行免疫组织化学染色,鉴定细胞分化.结果经DMSO诱导7d,将形成的细胞聚集体用生长培养基黏附培养至15 d,在聚集体周围的生长晕中出现自发性节律跳动的细胞团片,α-sarcomeric actin及cTnT染色阳性,至19d,阳性率分别可达26%和15%.结论 DMSO诱导结合聚集体形成培养方法可诱导P19细胞向心肌细胞分化,并出现自发性有节律跳动.     

P19细胞向神经元诱导分化的实验研究

目的 探讨P19细胞向神经元定向分化发育的可能性。方法 经维甲酸(RA)诱导4d的．P19细胞按神经细胞培养方法培养12d，分别用NSE、MAP-2和TH进行免疫组织化学染色，用AchE进行组织化学染色，鉴定分化细胞的特征。结果 经RA诱导的P19细胞培养12d，大多数细胞转变为类似于神经元的形态，长出突起并相互联络成网。经NSE免疫组织化学显示，12d培养物中神经元约占89％。P19诱导的神经元培养12d，神经元突起经MAP-2染色呈阳性反应。TH免疫组织化学显示，神经元中TH染色阳性神经元约占0.8％。组织化学显示．神经元中AchE染色阳性神经元约占71．09％。结论 P19细胞在体外经定向诱导分化可以产生较高比例的神经元。     

RA诱导P19细胞神经分化过程中相关蛋白分子的表达变化

目的:研究维甲酸(retinoic acid,RA)诱导P19细胞神经分化过程中与增殖、分化及凋亡相关分子表达变化情况。方法:P19细胞经RA处理4 d后进行分化培养,对分化培养细胞用MAP2抗体进行免疫组织化学染色。在P19细胞分化前、后不同时间点,Western Blot检测细胞周期蛋白(Cyclin D、Cyclin E、Cyclin A、p-CDK2)、生长分化相关蛋白(E2F1、PCNA、GAP43)、MAGE家族蛋白(Necdin、MAGE D1、MAGE H1)及凋亡效应分子(激活型Caspase 3)表达变化情况。结果:RA可诱导P19细胞向神经元分化;Necdin、GAP43和MAGE D1在RA处理后明显上调并在分化过程中保持高水平表达。E2F1、Cyclin D和Cyclin E表达随分化进程呈现逐步升高趋势,而Cyclin A、p-CDK2表达逐步下调。MAGE H1在分化第4 d到达顶峰后下降。PCNA在RA处理4 d时表达下降至最低,在分化早期渐上调后又降至低水平。RA处理后激活型Caspase 3表达明显上调,但在随后分化过程中又下调至对照组水平。结论:RA诱导P19细胞向神经元分化过程中,与细胞生长、分化、增殖及凋亡相关蛋白呈现动态表达变化,为进一步研究这些分子在神经分化中的作用奠定了基础。     

血清与全反式维甲酸对神经干细胞分化及突起生长的作用差异

目的:比较血清与全反式维甲酸(RA)2种诱导条件对神经干细胞分化及神经元突起生长作用的差异。方法:取E12.5d的胚胎小鼠皮层分离培养得到神经干细胞,然后分别用低浓度2%的血清和1μmol/L RA诱导神经干细胞分化3d和7d,用免疫荧光鉴定神经干细胞分化特征。结果:RA诱导组中的神经元比例显著高于血清诱导组,长期诱导至7d其仍保持较高的水平,但其星形胶质细胞比例明显低于血清诱导组;随着诱导时间的延长,RA诱导组中神经元突起的长度和数目也都显著长于和高于血清诱导组;另外,血清和RA诱导形成的胶质细胞的形态特征不一致。结论:RA相较于血清更利于诱导神经元的分化以及突起的生长,而血清更利于诱导星形胶质细胞的分化。     

26S蛋白酶体参与人骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化

目的:研究人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向神经元样细胞逐步分化过程中26S蛋白酶体的作用。方法:贴壁分离获得的hBMSCs先经β-巯基乙醇(β-ME)预诱导24h,随后用视黄酸(RA)诱导3d,最后再用生长因子(GF,10μg/LbFGF、20μg/LNGF)持续培养3d。免疫荧光染色观察不同诱导阶段神经前体细胞标志物nestin、早期神经元标志物Tuj1、成熟神经元标志物NF的表达。免疫荧光染色和RT-PCR分析不同诱导阶段26S蛋白酶体的表达变化。应用含26S蛋白酶体抑制剂的培养液(5μmol/LMG132、10μg/LbFGF、20μg/LNGF)作用于经β-ME/RA诱导后的细胞,NF免疫荧光染色观察蛋白酶体抑制剂对hBMSCs向神经元样细胞分化的影响。结果:未诱导的hBMSCs几乎不表达nestin、Tuj1和NF;经β-ME/RA诱导后神经前体细胞标志物nestin和早期神经元标志物Tuj1表达率增高(34.41%±1.27%,27.79%±1.27%);经β-ME/RA/GF诱导后成熟神经元标志物NF表达率迅速升高(56.72%±2.40%)。免疫荧光染色和RT-PCR结果证实,未诱导hBMSCs26S蛋白酶体表达水平较低;经β-ME/RA诱导后个别细胞26S蛋白酶体染色增强,26S蛋白酶体mRNA表达水平增至1.33倍;经β-ME/RA/GF诱导后26S蛋白酶体深染细胞增多,26S蛋白酶体mRNA表达水平增至1.77倍。应用26S蛋白酶体抑制剂MG132后,NF阳性细胞表达率显著降低(37.59%±1.52%)。结论:hBMSCs在β-ME/RA/GF诱导下可逐步向神经元样细胞分化,26S蛋白酶体在诱导过程中表达水平逐步增高,26S蛋白酶体抑制剂能够抑制hBMSCs向成熟神经元分化,提示26S蛋白酶体可能参与诱导hBMSCs向神经元样细胞的成熟分化。     

热环境对纹状体神经元生长的影响

目的:研究热环境对纹状体神经元生长、凋亡的影响,探讨热环境刺激对神经系统损伤的机理,为筛选新的预防和治疗热环境损伤的药物提供参考。方法:原代培养的纹状体神经元用抗神经丝蛋白(NF)、抗神经元特异的烯醇化酶(NSE)和抗酪氨酸羟化酶(TH)的抗体进行免疫细胞化学染色鉴定,计数NF阳性细胞百分比。细胞在(43.0±0.2)℃,10%的CO₂条件下培养1h造成热环境处理模型,立即用PI/H33258双染色、台盼蓝染色、活性caspase-3和原位末端转移酶(TdT)染色等方法分别检测坏死和凋亡细胞,同时采用体视学分析神经元体积大小。结果:正常培养的纹状体神经元在接种7-9d成熟,胞体饱满,呈NF、NSE和TH阳性。PI/H33258双染色结果表明,急性热环境处理时发生的细胞凋亡的百分比较少,而坏死比例明显增加;台盼蓝染色计数结果表明,细胞总数明显减少,同时坏死细胞的比例增加了10倍左右;活性caspase-3和TdT以及细胞体积的分析结果表明,热环境刺激引起神经元细胞数目减少,同时小幅度增加了细胞凋亡的发生。结论:43℃的热环境处理1h,导致纹状体细胞数目减少,引起细胞死亡主要通过坏死途径,凋亡比例较少。     

骨形态发生蛋白2诱导P19细胞体外向心肌样细胞分化

目的 探讨骨形态发生蛋白2(BMP-2)诱导P19细胞形成细胞聚集体并向心肌细胞分化的作用.方法 将P19细胞接种于铺有0.5%软琼脂的培养皿中,BMP-2诱导悬浮培养4d形成细胞聚集体,将细胞聚集体用生长培养基黏附培养至19d.相差显微镜观察细胞形态学变化,应用免疫细胞化学、激光扫描共焦显微镜技术检测α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin)和心肌特异性肌钙蛋白T(C-TnT)的表达,透射电镜观察分化细胞的超微结构.结果 经BMP-2诱导悬浮培养24h后即可见多个悬浮的细胞团形成,至第4天形成细胞聚集体/类胚体(Ebs).将Ebs再用生长培养基黏附培养后,可见位于Ebs中央的细胞密集、颜色较深,为Ebs的内核.Ebs贴壁生长后 8h,细胞由Ebs边缘逐渐爬出,在周边形成单层的生长晕,中央细胞多层排列,增殖速度较快,细胞体积较小,具有高核质比,为未分化细胞.培养至11d后,细胞生长晕中一些细胞变形,胞体伸长,体积增大,呈放射状排列.培养至第19天,Ebs边缘生长晕中变形的细胞表达α-横放肌肌动蛋白和c-TnT蛋白.免疫荧光双标染色显示α-横纹肌肌动蛋白和C-TnT蛋白均定位于细胞质并且呈共表达.透射电镜下观察到,分化细胞呈杆状,细胞核呈卵圆形,位于细胞中央,细胞器丰富,并可见到平行排列的肌丝.结论 BMP-2暴露结合悬浮培养可以诱导P19细胞向心肌样细胞分化.     

应用5-氮胞苷体外诱导P19细胞分化为心肌细胞

目的 探讨P19细胞体外经5-氮胞苷(5-aza)诱导向心肌细胞分化的特征.方法 将P19细胞接种于铺有琼脂的培养皿中,用含不同浓度5-aza的培养基诱导培养7d,细胞悬浮生长形成类胚体(EBs).将EBs用生长培养基黏附培养,观察细胞收缩情况;免疫细胞荧光检测α一横纹肌肌动蛋白(asarcomeric actin)、心肌肌钙蛋白(cTnT)的表达;RT-PCR检测GATA-4、a-MHC基因表达,鉴定细胞分化.结果 将5-aza诱导形成的:EBs黏附培养后,在EBs周围的生长晕中出现自发性节律收缩的细胞团片,α-sarcomeric:actin及cTnT染色阳性,表达GATA-4、αMHC基因.10μmol/L5-aza处理组心肌细胞分化率较高.结论 5-aza暴露结合悬浮培养可诱导P19细胞向心肌细胞分化,其分化与5-aza浓度有关.     

不同培养代数大鼠骨髓基质细胞向神经元样细胞转分化能力的比较

为确定诱导大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)向神经元样细胞转分化的适宜培养代数,本研究比较了不同培养代数的BMSCs的转分化潜能。首先体外培养大鼠BMSCs并传代,于不同的培养代数利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、全反式维甲酸(RA)、音猬因子(Shh)诱导分化,随后运用免疫荧光法和免疫印迹法检测诱导细胞中的神经元样细胞。结果显示骨髓基质细胞体外培养1至3代时能够被诱导分化为神经元样细胞,培养至第7代时丧失转分化为神经元样细胞的潜能。上述结果提示:传代次数增多将引起BMSCs自发分化,使其向神经元样细胞转分化的能力下降,因而BMSCs培养至第3代时适宜进行诱导分化。     

细胞密度与骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:细胞种植密度是影响干细胞分化的因素之一,对于细胞种植密度在骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化过程中的作用尚缺乏深入研究。目的:观察细胞种植密度对骨髓间充质干细胞诱导向神经元样细胞分化的影响。方法:采用贴壁培养法分离大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代后将其按2×102,2×103,4×103,8×103,2×104,4×104/cm2种植于六孔板,每组均加入碱性成纤维细胞生长因子+表皮生长因子+维甲酸诱导向神经元样细胞分化,并通过免疫组织化学染色鉴定,计算每组细胞出现神经元样细胞的比例,比较各组的分化率。结果与结论:各组骨髓间充质干细胞加入诱导剂后均出现神经元样细胞,Nestin、NSE、GFAP细胞化学染色呈阳性。不同种植密度组出现神经元样细胞比例不同,以8×103/cm2组神经元样细胞比例最高,且神经元样存活时间最长,达7d。结果说明骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化与细胞接种密度有关,过高或过低细胞密度均不利分化。     

p27~(Kip1)调控永生化人神经前体细胞分化的机制

目的研究p27Kip1在永生化人神经前体细胞分化中的作用,探讨神经前体细胞的分化机制。方法取本课题组已建立的永生化人神经前体细胞系hSN12W-TERT细胞(第12代)进行培养,在细胞进入对数生长期时给予1μmol/L全反式视黄酸(RA)诱导,重复诱导3次,每次均在诱导的第3、5、7天收集细胞,用流式细胞仪分析RA诱导第3天细胞周期的变化,用免疫印迹法检测RA诱导第3、5、7天p27Kip1、p21cip1细胞周期蛋白依赖激酶2(cdk2)及S期激酶相关蛋白2(skp2)的变化。结果流式细胞术结果显示,hSN12W-TERT细胞经1μmol/LRA诱导3d后,G0/G1期细胞的比例由77.25%上升至85.68%,而S期的比例由9.38%下降到8.57%。免疫印迹法结果显示,RA诱导第3天,hSN12W-TERT细胞p27Kip1蛋白表达比未经RA诱导的细胞增加,并在RA诱导第5天达到高峰(P0.05)。未经RA诱导的正常hSN12W-TERT细胞p21Cip1蛋白表达弱,RA诱导后p21Cip1蛋白的表达略呈下降趋势。RA诱导前后hSN12W-TERT细胞cdk2蛋白的表达变化不明显,但反映cdk2活性的磷酸化cdk2(p-cdk2)的表达在RA诱导后明显下降,同时,参与p27Kip1泛素降解途径的重要因子skp2的表达在RA诱导后明显下降。结论在RA诱导hSN12W-TERT细胞分化的过程中,p27Kip1通过抑制cdk2的活性而发挥促细胞分化的作用,且RA诱导后p27Kip1蛋白含量增加与其泛素降解途径被抑制密切相关。     

Retinoic acid induced the differentiation of neural stem cells from embryonic spinal cord into functional neurons in vitro

Retinoic acid is an important molecular taking part in the development and homeostasis of nervous system. Neural stem cells (NSCs) are pluripotent cells that can differentiate into three main neural cells including neuron, astrocyte and oligodendrocyte. However, whether retinoic acid can induce NSCs derived from embryonic spinal cord differentiating into functional neurons and its efficiency are not clear. In this experiment, NSCs were isolated from embryonic 14 d spinal cord of rats. The growth and neuronal differentiation of NSCs induced by 500 nM RA was examined in vitro. It was indicated that compared with the control group, there were more differentiated cells with longer cytodendrites in the medium treated with RA at different time. And more, there were more neuronal marker positive cells in 500 nM RA group than the control group seven days after differentiation. At the same time, the expression of β-tublin III protein in RA group was higher than those in control group, which was contrary to the expression of astrocyte marker GFAP protein at seven days after differentiation. However the differentiated neurons, whether treated with RA or not both exhibited biological electrical reactivity after stimulated by glutamine. Therefore, these findings indicated that RA could promote growth of cellular dendrites and neuronal differentiation of NSCs, which also induce functional maturation of differentiated neurons finally.     

羊水干细胞定向及稳定分化为神经元样细胞体系的建立

文题释义： 羊水干细胞：羊水是由多种细胞组成的异质细胞群,其中包括胎儿脱落的表皮细胞、呼吸道上皮细胞、消化道和泌尿道等体腔管道的脱落细胞、羊膜脱落细胞等。羊水中包含有向内、中、外3个胚层分化潜能的干细胞,约占1%,近年来研究发现羊水干细胞在体外通过特殊的诱导微环境能够分化成多种不同类型的细胞,使羊水来源干细胞成为干细胞研究的一个新热点。 悬滴培养：与传统的二维培养模式不同,悬滴培养提供的三维环境有利于促进各种干细胞的增殖与分化,可以使细胞聚集,相互紧密接触,从而促进细胞之间的相互作用,进而提高或增强干细胞的生物学功能。羊水干细胞悬滴培养可形成拟胚体结构,具有较强的分化潜能,有助于提高定向诱导分化效率。 背景：利用干细胞分化代替受损神经元的设想,已经逐渐受到科研工作者的关注。胚胎干细胞和诱导性多能干细胞虽然具有良好的神经元分化潜能,但由于接种活体动物具有致瘤性,限制了其进一步的深入研究。 目的：建立稳定的羊水干细胞分选、培养、成神经诱导分化体系,探讨其作为神经元再生种子细胞的可行性。 方法：经B超引导下,穿刺获取孕19-22周期间的羊水样本10 mL,磁珠分选其中c-Kit阳性的羊水干细胞。免疫荧光染色鉴定羊水干细胞标记物Oct-4、Sox2;RT-PCR检测羊水干细胞多次传代后干性标记物c-Kit、Oct-4、Sox2、Nestin的表达;羊水干细胞悬滴培养4 d观察拟胚体的形成情况;采用“两阶段”分步诱导羊水干细胞向神经元方向分化,免疫荧光染色观察Neuro D、Tuj1的表达。 结果与结论：①羊水中可分选出大约1%的c-Kit阳性羊水干细胞;②(75.0±4.6)%的羊水干细胞表达Oct-4,(86.0±2.8)%的羊水干细胞表达Sox2;③RT-PCR方法检测干性标记物c-Kit、Oct-4、Sox2、Nestin的表达量并不随细胞传代数的增加而改变;④经悬滴培养可形成拟胚体并表达Oct-4;⑤免疫荧光证实未经诱导的羊水干细胞表达神经元标记物Tuj1,但缺乏典型的神经元形态特征;RT-PCR证实不同羊水干细胞标本都能检测到Tuj1的表达,同一样本多次传代也能稳定检测到Tuj1的表达;⑥羊水干细胞经碱性成纤维细胞生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子3的两阶段分步诱导后表达神经干细胞标记物Neuro D和神经元标记物Tuj1,具有神经元样细胞的形态特征。 ORCID: 0000-0001-6488-2055(宗凌) 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程