p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂减少大鼠肝脏炎症细胞因子的表达

目的 观察p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂SB203580阻断p36 MAPK信号通路,减少脑死亡大鼠肝脏促炎细胞因子表达的作用.方法 雄性Wistar大鼠30只,体质量180～200 g,随机分3组,每组10只.脑死亡组:诱导大鼠及死亡;脑死亡+SB203580组:大鼠脑死亡诱导成功后,经阴茎背静脉注射SB203580(10 mg/kg);两组大鼠脑死亡诱导成功,行人工呼吸6 h后,若平均动脉压大于80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),则为脑死亡供体,获取肝脏待检.对照组:正常大鼠麻醉后取肝脏待检.逆转录-聚合酶链反应检测肝脏肿瘤坏死因子(TNF)α和白细胞介素(IL)-1β的mRNA表达,Western blot检测肝脏TNF α和IL-1 β的蛋白质表达以及磷酸化p38 MAPK的表达.多个样本间比较行One-Way ANOVA分析,SNK法行两两样本间比较.结果 脑死亡组大鼠肝脏出现p38 MAPK磷酸化,磷酸化p38 MAPK的相对表达量比对照组明显增加(0.190±0.004比0.001±0.002),差异有统计学意义(q=172.53,P＜0.01);肝脏TNF α的mRNA和蛋白质表达量分别为0.670±0.012和0.240±0.003,较对照组(分别为0.130±0.013和0.001±0.002)明显增加(q值分别为123.99和243.09,P值均＜0.01);肝脏IL-1 β的mRNA和蛋白质表达量分别为0.560±0.009和0.190±0.003,较对照组(分别为0.160±0.010和0.001±0.002)明显增加(q值分别为135.35和192.23,P值均＜0.01).脑死亡SB203580组大鼠肝脏p38 MAPK磷酸化下降,磷酸化p38 MAPK的表达量(0.120±0.004)比脑死亡组明显下降(q=63.90,P＜0.05),但仍明显高于对照组(q=108.63,P＜0.01);肝脏TNF α的mRNA和蛋白质表达量分别为0.430±0.016和0.180±0.004,较脑死亡组明显下降(q值分别为55.11和61.03,P值均＜0.01),但仍高于对照组(q值分别为68.89和182.06,P值均＜0.01);肝脏IL-1β的mRNA和蛋白质表达量分别为0.270±0.009和0.140±0.004,较脑死亡组明显下降(q值分别为98.13和50.85,P值均＜0.01),但仍高于对照组(q值分别为37.22和141.38,P值均＜0.01).结论 SB203580能抑制p38 MAPK的磷酸化,阻断p38 MAPK信号通路,减少脑死亡大鼠肝脏促炎细胞因子表达,降低肝脏免疫原性.     

硫化氢在p38MAPK信号通路对大鼠肝星状细胞凋亡中的作用

目的探讨硫化氢(H2S)在p38MAPK信号通路对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)凋亡中的作用及磷酸化P38、Caspase-3蛋白表达的变化。方法实验设对照组(HSC加含10%胎牛血清的DMEM培养液)、二甲基亚砜(DMSO)组(对照组基础上加DMSO,使其终浓度为0.1%)、NaHS组(对照组基础上加NaHS,使其终浓度为50μmol/L)、SB组(DMSO组基础上加SB203580,使其终浓度为75μmol/L)、SB加NaHS(SB+NaHS)组;采用Hoechst荧光染色检测细胞凋亡;Western blotting法检测磷酸化p38MAPK表达及Caspase-3蛋白表达水平。结果与对照组比较,SB组和SB+NaHS组HSC-T6的凋亡率增加(P0.05),NaHS组p38MAPK磷酸化水平及Caspase-3表达均明显增高(P0.01);与NaHS组比较,SB组和SB+NaHS组细胞凋亡率增加明显(P0.01),p38MAPK磷酸化水平表达降低(P0.01);SB+NaHS组较SB组Caspase-3蛋白表达升高(P0.05)。结论 p38MAPK及Caspase-3在H2S刺激的HSC-T6中表达增强,H2S能促使SB203580诱导的HSC-T6细胞凋亡,其作用机制可能与活化p38MAPK的磷酸化途径,进而激活Caspase-3的表达有关。     

环磷酸腺苷反应元件结合蛋白-1对肝星状细胞转化生长因子β3的mRNA表达及启动子活性的影响

目的 探讨大鼠肝星状细胞(HSC)中,环磷酸腺苷(cAMP)反应元件结合蛋白-1(CREB-1)对转化生长因子β3 (TGFβ3)的mRNA表达及启动子活性的影响. 方法 将HSC分为CREB-1表达质粒转染组(C质粒组)、siRNA-CREB-1转染组(S质粒组)、阴性对照质粒组(N质粒组)、Forskolin处理组(FSK组)、H-89处理组(H-89组)及空白对照组,并根据加或不加入外源性TGFβ3重组蛋白将以上各组再分为(TGFβ3+)组和(TGFβ3-)组,实时荧光定量PCR法检测TGFβ3 mRNA的表达.上述各组共转染PGL3-basic-TGFβ3P (W质粒)或PGL3-basic-TGFβ3P-mCRE(M质粒),以pRL-SV40为空白对照,荧光素酶报告基因分析法检测各组TGFβ3启动子活性.双侧t检验进行组间数据比较. 结果 TGFβ3 mRNA表达结果显示,与N质粒(TGFβ3-)组比较,S质粒(TGFβ3-)组mRNA相对表达量降低至0.69±0.15(t=3.702,P＜0.05);与空白对照(TGFβ3-)组比较,H-89 (TGFβ3-)组降低至0.57±0.08(t=9.490,P＜0.05);N质粒(TGF β 3+)组与N质粒(TGFβ3-)组、S质粒(TGFβ3+)组与S质粒(TGFβ3-)组、空白对照(TGFβ3+)组与空白对照(TGFβ3-)组、H-89 (TGFβ3+)组与H-89 (TGFβ3-)组分别比较,差异均有统计学意义(t值分别为-7.404、-3.480、-2.831和7.875,P值均＜0.05).荧光素酶报告基因分析结果显示,S+W质粒组、N+W质粒组、C+W质粒组的TGFβ3启动子活性分别为0.062±0.013、0.122±0.011、0.165±0.016,C+W质粒组TGFβ3活性较N+W质粒组组明显升高(t=-3.823,P＜ 0.05),S+W质粒组较N+W质粒组明显降低(t=5.853,P＜0.01);H-89+W质粒组、空白对照+W质粒组、FSK+W质粒组TGFβ3启动子活性分别为0.154±0.010、0.188±0.016、0.276±0.031,FSK+W质粒组的TGFβ3启动子活性较空白对照+W质粒组明显升高(t=-4.419,P＜0.05),H-89+W质粒组的TGFβ3启动子活性较空白对照+W质粒组明显降低(t=-3.115,P＜0.05). 结论 增加HSC内CREB-1表达或提高CREB-1磷酸化水平可上调TGFβ3 mRNA表达及其启动子活性;CRE位点是TGFβ3启动子的关键位点,封闭该位点后,TGFβ3启动子活性明显降低.外源性TGFβ3可上调HSC中内源性TGFβ3 mRNA的表达.     

Wnt3a对肝星状细胞增殖活化以及转化生长因子β/Smad表达的影响

目的 研究Wnt3a对肝星状细胞(HSC)的增殖、活化以及转化生长因子(TGF)β/Smad表达的影响. 方法 重组Wnt3a刺激HSC后,用EDU法测定其对HSC增殖的影响;用Westem blot法检测HSC表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGFβ 1、Smad3和Smad7的蛋白水平并比较四者之间的关系,多组间数据的比较用单因素方差分析,双变量相关分析研究数据间相关性.结果 200 ng/ml Wnt3a刺激HSC24h后,其增殖率达到最大(63.00％±2.30％),显著高于未处理组、50 ng/ml、100 ng/ml及150 ng/ml组(P值均＜0.05),而和250、300ng/ml组的差异无统计学意义(P值均＞0.05);随着Wnt3a浓度的增加和刺激时间的延长,HSC表达α-SMA、TGFβ1和Smad3的蛋白水平也随之升高,均在300 ng/ml刺激48h后达到最大值(与3-磷酸甘油醛脱氢酶的灰度比值分别为1.0860±0.0101、1.0346±0.0118、1.0306±0.0122),而Smad7的蛋白水平却随之降低,在300ng/ml Wnt3a刺激48h后达到最小(与GAPDH的灰度比值为0.7736±0.0139),差异均具有统计学意义(P值均＜0.05),并且α-SMA的蛋白表达与TGFβ 1、Smad3的蛋白表达呈正相关(r=0.968,P＜ 0.05;r=0.997,P＜0.01),而和Smad7的蛋白表达呈负相关(r=0.960,P＜0.05).结论 重组Wnt3a能促进HSC的增殖、活化,并上调TGF β/Smad的表达,可能对肝纤维化的形成具有促进作用.     

益肝康抑制肝星状细胞Ⅰ型胶原合成的作用机制

目的:探讨活血化瘀中药复方“益肝康”抑制肝星状细胞Ⅰ型胶原合成的作用机制。方法:应用West-ern印记检测p38的活化程度;3H-Pro掺入法检测Ⅰ型胶原合成。结果:IL-1β有明显促大鼠HSCⅠ型胶原合成作用,IL-1β(10μg/L)作用培养的HSC24小时后,3H-Pro掺入量明显高于对照组(618.33±52.69vs388.83±49.72,P<0.01),阻断p38通路后,IL-1β的促HSCⅠ型胶原合成作用受到抑制。经不同浓度p38特异性阻断剂SB203580(10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L)预处理的各组细胞,3H-Pro掺入量分别为487.33±42.75、408.50±27.47、400.83±19.49,与对照组(未用SB203580预处理,629.67±69.88)相比,其掺入量均明显降低(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。益肝康可抑制IL-1β诱导的HSC中p38活性,与未用IL-1β处理组相比,在分别刺激HSCs5分钟、15分钟、30分钟和60分钟,HSC p38活性受到明显抑制(P<0.05,P<0.01)。经益肝康浸膏预孵育的益肝康 IL-1β组与单纯IL-1β组相比,p38活性明显受到抑制(1.550±0.410vs2.973±0.953,P<0.01)。结论:IL-1β可促进大鼠HSCⅠ型胶原合成;细胞内p38信号蛋白参与了IL-1β促HSCⅠ型胶原合成;益肝康可通过阻断p38通路,从而发挥抑制HSCⅠ型胶原合成作用。     

青蒿琥酯对大鼠原代肝星状细胞产生与分泌转化生长因子β1的影响

目的 探讨青蒿琥酯对大鼠原代肝星状细胞(HSC)增殖的影响,从抑制HSC表达、生成和分泌转化生长因子β1 (TGF β1)这一环节探讨其抗肝纤维化的机制. 方法 分离大鼠HSC于培养瓶中原代培养10d,已处于培养活化状态,将HSC分为实验组和对照组,实验组以青蒿琥酯(终浓度分别为125、150、175、200、225μmol/L)作用24、48、72 h.以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖率,RT-PCR法检测HSC中TGFβ1 mRNA的表达水平,Western blot法分析TGFβ1蛋白水平的变化,酶联免疫吸附法测定培养上清液中TGFβ1含量.样本均数比较采用单因素方差分析,两样本均数比较采用独立样本t检验. 结果 不同浓度青蒿琥酯对培养活化的HSC均有明显抑制作用,且呈剂量-效应关系和时间-效应关系,作用24h时,125、150、175、200、225μmol/L青蒿琥酯对HSC的抑制率分别为6.06％±1.44％、21.47％±5.57％、42.00％±7.36％、67.12％±4.55％、79.83％±3.67％(P值均＜0.01).青蒿琥酯作用HSC 24h能明显抑制、下调HSC表达TGFβ1mRNA,呈剂量-效应关系(P＜0.01);并且明显降低细胞内TGFβ1蛋白及细胞上清液中TGFβ1水平,0、150、175、200μmol/L青蒿琥酯处理组TGFβ 1分别为(164.24±6.88) pg/ml、(102.68±4.45)pg/ml、(86.54±5.56)pg/ml、(56.55±5.66) pg/ml(P值均＜0.01).结论 青蒿琥酯呈剂量和时间依赖性地抑制原代分离培养活化的HSC,青蒿琥酯在体外具有抗肝纤维化的作用,与其下调TGFβ1基因及蛋白的表达、翻译与TGFβ1分泌至细胞外等环节有关.     

p38丝裂原活化蛋白激酶对急性坏死性胰腺炎大鼠低钙血症的影响

目的 探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号转导通路对急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠低钙血症和甲状旁腺激素受体1(PTHR1)表达的影响.方法 将雄性SD大鼠72只按完全随机法分为ANP组、SB203580干预(SB)组和假手术(SO)组,每组分3、6、12 h 3个时间点,每个时间点8只.以5%牛磺脱氧胆酸钠逆行胰胆管注射建立ANP模型,SB组在造模前30 min腹腔注射p38MAPK特异抑制剂SB203580 10 mg/kg体重.观察各组血清钙浓度,蛋白质印迹法(Western blotting)分析骨组织磷酸化p38MAPK(P-p38 MAPK)和TNF-α变化,实时RT-PCR检测骨组织PTHR1 mRNA表达.结果 制模后6 h,SO组、ANP组和SB组血清钙浓度分别为(2.50±0.08)mmoL/L、(2.11±0.06)mmol/L和(2.35±0.10)mmol/L;骨组织P-p38 MAPK表达量分别为0.14±0.04、0.80±0.06和0.33±0.05;骨组织TNF-α表达量分别为0、0.91±0.04和0.44±0.03;骨组织PTHR1 mRNA表达量分别为1.00±0.12、0.23±0.04和0.44±0.06.SB组骨组织P-p38 MAPK及TNF-α表达较ANP组显著降低(P＜0.01);骨组织PTHR1 mRNA表达量及血清钙浓度较ANP组显著增加(P＜0.01).结论 p38MAPK信号转导通路可介导ANP低钙血症的发生,抑制该通路可改善ANP低钙血症.     

转化生长因子β1的小干扰RNA对肝纤维化大鼠Smad蛋白表达的影响

目的 研究转化生长因子(TGF) β1的小干扰RNA (siRNA)对CCl4诱导肝纤维化大鼠TGFβ1/Smad信号通路的影响.方法 以前期研究的TGFβ1siRNA治疗前后肝纤维化大鼠肝脏组织作为研究对象,分为正常组、模型组、TGF β 1 siRNA 0.125 mg/kg组、TGFβ1 siRNA 0.25 mg/kg组和阴性对照组(0.25 mg/kg非特异性靶序列).用免疫组织化学和Western blot检测Smad2、3、4、7的蛋白表达;Real-time PCR法检测Smad2、3、4、7的mRNA表达.多组间数据比较用方差分析,两两比较采用q检验. 结果 免疫组织化学结果显示TGF-β1 siRNA 0.25mg/kg组及0.125 mg/kg组Smad2/3、4的蛋白表达量较模型组、阴性对照组明显减少(F值分别为115.538,117.178,P＜ 0.01),TGFβ 1 siRNA 0.25 mg/kg组表达量较0.125 mg/kg组少(P＜0.05).TGFβ 1 siRNA 0.25 mg/kg组及0.125 mg/kg组Smad7的蛋白表达量较模型组、阴性对照组增加(F=125.34,P＜ 0.01),TGFβ 1 siRNA 0.25mg/kg组表达量较0.125 mg/kg组多(P＜0.05).Western blot结果与之相似.Real-time PCR结果显示,与模型组和阴性对照组比较,TGFβ1 siRNA可以明显抑制Smad 2、3、4基因的表达,且TGFβ1 siRNA 0.25 mg/kg组Smad2、3、4的mRNA表达量(相对表达量分别为2.870±0.705、2.904±0.414、2.667±0.466)较TGF β1siRNA 0.125 mg/kg组(相对表达量分别为5.998±0.329、5.827±0.781、5.102±0.102)明显减少(P＜0.05).TGFβ1 siRNA 0.25mg/kg组及0.125 mg/kg组Smad7的mRNA表达量较模型组、阴性对照组增加(F=29.615,P＜0.01),TGFβ1 siRNA 0.25 mg/kg组表达量较0.125mg/kg组多(P＜0.05).结论 TGFβ1 siRNA干扰大鼠TGFβ1表达后,Smad2、3、4表达量明显降低,而Smad7表达仍维持在较高水平,这利于肝纤维化的改善.     

骨成形蛋白7对大鼠肝星状细胞增殖的抑制作用

目的 研究骨成形蛋白7 (BMP7)对大鼠肝星状细胞(HSC)增殖的抑制作用.方法 体外培养HSC-T6细胞,分为对照组、TGFβ1组、TGFβ1+ BMP7组和TGFβ1+ BMP7+ Noggin组.RT-PCR法检测果蝇蛋白质1(smad1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、gremlin和纤维连接蛋白(FN)mRNA的表达,Western印迹法检测磷酸化smad1/5/8(P-smad1/5/8)、α-SMA、gremlin蛋白的表达.采用单因素方差分析、LSD检验、Dunnett T3检验和Pearson直线相关分析进行统计学处理.结果 对照组HSC-T6细胞中可见P-smad1/5/8、α-SMA、gremlin及FN的表达,TGFβ1刺激后表达量明显增加,差异有统计学意义(均P＜0.05).与TGFβ1组比较,TGFβ1+ BMP7组α-SMA、gremlin及FN表达下调,但P-smad1/5/8蛋白表达增加(1.613±0.031比2.503±0.014;t=34.89,P＜0.05).TGFβ1+ BMP7+ Noggin组α-SMA、gremlin及FN表达较TGFβ1+ BMP7组增加,而P-smad1/5/8蛋白表达下调(t=34.05,P＜0.05).smadl mRNA在各组表达均无显著变化.结论 BMP7对α-SMA、gremlin和FN均有较强的抑制作用.     

β-连环蛋白对转化生长因子β 1活化HSC-T6细胞的影响

目的 观察β-连环蛋白对转化生长因子β 1(TGF β1)活化肝星状细胞(HSC)的影响. 方法通过脂质体介导,将β-连环蛋白真核表达质粒[pcDNA3.1(+)-β-catenin]和绿色荧光质粒pEGFP-N1共转染体外培养的HSC-T6细胞株,用逆转录PCR和Western blot法检测经TGF β1刺激后两组细胞smad3、β-连环蛋白mRNA及蛋白质的表达.组间比较采用方差分析.结果 β-连环蛋白转染阳性的HSC-T6细胞株经TGF β 1刺激后表达smad3、β-连环蛋白及其mRNA明显强于未转染β-连环蛋白基因的HSC-T6细胞,更强于正常培养的HSC-T6细胞,smad3mRNA相对表达量分别为;0.642±0.011、0.501±0.021、0.511±0.019、0.356±0.017,F=135.304,P<0.05;β-连环蛋白mRNA相对表达量分别为:0.783±0.021、0.543±0.033、0.538±0.024、0.212±0.019,F=267.340,P值均<0.05.smad3蛋白质相对表达量分别为:0.892±0.012、0.124±0.011、0.130±0.021、0.003±0.001,F=2823.813,P<0.05;β-连环蛋白相对表达量分别为:0.921±0.020、0.210±0.010、0.208±0.008、0.002±0.001,F=3440.982,P<0.05.β-连环蛋白和smad3蛋白质的表达均与α-平滑肌肌动蛋白的表达显著相关(r=0.901,P<0.01;r=0.939,P<0.01).结论 β-连环蛋白基因转染体外培养的HSC-T6细胞株,促使HSC表达smad3、α-平滑肌肌动蛋白增强,提示β-连环蛋白能增强TGF β1的致纤维化作用.     

干扰素α对Ⅰ型胶原及转化生长因子β1基因表达的影响

目的 观察干扰素α(IFN α)对血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)刺激的大鼠肝星状细胞(HSC)分泌Ⅰ型胶原及转化生长因子β1(TGF β1)基因表达的影响,探讨IFN α抗肝纤维化的可能机制.方法 体外培养大鼠HSC系rHSC-99,分别用0、0.0125、0.0250、0.0500,0.1000、0.2000,0.4000 ng/ml IFN α,PDGF-BB干预和两者共同干预,用四甲基偶氮唑盐实验观察各组对HSC细胞活力的影响,采用逆转录聚合酶链反应方法测定各组对HSC细胞Ⅰ型胶原mRNA和TGF β1 mRNA表达的影响.结果 (1)HSC细胞活力(A值)PDGF-BB干预组为1.35±0.22,空白对照组为0.89±0.12,两组比较,F=16.311,P＜0.05,差异有统计学意义,说明PDGF-BB可提高HSC细胞活力.0.025,0.050、0.100、0.2000,0.400ng/ml IFN α加PDGF-BB共干预组,A值分别为0.84±0.18.0.45±0.15、0.26±0.01、0.33±0.07,0.30±0.06,较空白对照组明显降低,F=7.430,P＜0.05,差异有统计学意义,说明IFN α与PDGF-BB共同作用可抑制HSC细胞活力,且在0.025-0.100 ng/ml范围内随着IFN α浓度的增加其抑制作用越明显.(2)0.050、0.100、0.200ng/ml IFN α加PDGF-BB共干预各组Ⅰ型胶原mRNA相对表达值分别为0.94±0.19、0.61±0.12,0.52±0.02,空白对照组为1.41±0.01,共干预各组比空白对照组均明显降低,F=127.921,P＜0.05,差异有统计学意义.0.050、0.100,0.200ng/mlIFN α加PDGF-BB共干预组各组TGFβ1 mRNA相对表达值分别为1.18±0.06、1.15±0.10、1.39±0.04,空白对照组为1.62±0.12,共干预各组比空白对照组均明显降低,F=82.115,P＜0.05,差异有统计学意义,说明IFN α与PDGF-BB共同作用对HSC细胞Ⅰ型胶原、TGFβ1基因的表达有抑制作用,且随着浓度的增加其抑制作用越明显.结论 IFN α对PDGF-BB诱导的HSC细胞活力及Ⅰ型胶原、TGF β1基因的表达有抑制作用,且随着浓度的增加其抑制作用越明显.这可能是IFN α发挥抗肝纤维化作用的途径之一.     

胰高糖素样肽-1受体激活对肝星状细胞p38MAPK信号通路的影响

目的 探讨肝星状细胞(HSC)上胰高糖素样肽-1(GLP-1)受体激活对胞内p38MAPK信号通路的影响. 方法 体外培养人HSC并进行形态学鉴定,随机选取样本用Western blot法检测其GLP-1受体蛋白的表达情况;设立对照组和实验组HSC进行体外培养,实验组予以GLP-1受体激动剂-利拉鲁肽,对照组予以等量等渗盐水,细胞培养120 h后用RT-PCR检测各样本的p38MAPK mRNA表达水平,用Western blot检测各样本磷酸化p38MAPK蛋白表达水平.对数据进行两独立样本均数t检验分析. 结果 人HSC上存在GLP-1受体蛋白的表达.实验组和对照组相比,磷酸化p38MAPK蛋白相对表达水平下降,差异具有统计学意义(18.0±2.8与21.2±2.5,t=3.814,P＜0.01);p38MAPK mRNA相对表达水平亦下降,差异亦具有统计学意义(37.9±2.4与43.3±4.7,t=4.478,P＜0.01). 结论 HSC上GLP-1受体激活后能够下调HSC内p38MAPK mRNA的表达,也能够降低胞内磷酸化的p38MAPK蛋白水平,起到抑制p38MAPK信号通路的作用.     

左归丸含药血清通过p38 MAPK信号通路诱导MC3T3-E1成骨细胞的分化

目的 探讨p38MAPK信号通路对左归丸含药血清干预MC3I3-E1成骨细胞分化的影响.方法 制备大鼠含药血清,选用p38特异阻滞剂SB203580,实验分为空白对照组、SB203580组、左归丸组、左归丸加SB203580组、倍美力组、倍美力加SB203580组.孵育48 h后,采用PNPP法检测碱性磷酸酶(ALP)活性,采用Westem印迹法分析ALP蛋白表达水平;孵育7d,采用改良钙钴染色法检测ALP活性;孵育14d,采用茜素红染色法测定矿化沉积情况.结果 与空白对照组比较,左归丸组显著促进MC3T3-E1成骨细胞分化,明显上调ALP蛋白表达水平(P＜0.01);与左归丸组比较,左归丸加SB203580组显著抑制左归丸含药血清对MC3T3-E1成骨细胞的分化的促进作用,明显下调ALP蛋白表达水平(P＜0.01).结论 左归丸含药血清可能部分通过p38MAPK信号通路干预MC3T3-E1成骨细胞分化.     

柴胡皂苷d对活化的HSC-T6细胞MMP-1、TIMP-1表达的影响及其分子机制

目的:研究柴胡皂苷d(saikosaponin-d,SSd)对活化的HSC-T6细胞内基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)、基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1,TIMP-1)表达的影响及其相关分子机制,探讨植物雌激素对肝纤维化的作用机制,为临床应用植物雌激素提供理论依据.方法:体外培养大鼠肝星状细胞系HSC-T6,细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养种板,细胞贴壁后加入雌激素受体阻断剂(1μmol/L)或P38 MAPK阻断剂SB203580(50μmol/L)预处理1h后,加入SSd(5μmol/L)或雌二醇(1μmol/L)孵育24h.采用ELISA法检测细胞培养上清液中的一型胶原(collagen type 1,COL-1)、MMP-1、TIMP-1的含量,Western blot法检测细胞MMP-1、TIMP-1、P38、PP38的表达.结果:与对照组(Control)比较,SSd、E_2单独给药组COL-1(140.95±12.14,143.58±4.81vs 198.98±15.08)、TIMP-1(0.23±0.01,0.21±0.01 vs 0.31±0.01)、P-P38(0.51±0.14,0.52±0.12 vs 1.00+0.11)明显降低(P0.01),MMP-1明显升高(0.0127±0.0008,0.0116±0.0004 vs 0.0049±0.0001,P0.01).抑制剂组COL-1、TIMP-1、P-P38较SSd、E_2单独给药组明显升高(P0.01),MMP-1明显降低(P0.01).我们采用P38阻断剂SB203580处理细胞,药物作用24 h后,SB203580组与对照组相比,MMP-1蛋白表达明显增高(3.58±0.35 vs 1.00±0.15,P0.01),TIMP-1蛋白表达明显降低(0.52±0.14 vs 1.00±0.18,P0.05).结论:SSd能够通过ERβ介导的效应抑制P38MAPK的激活,进而调节其下游的MMP-1、TIMP-1的表达,促进细胞外基质的降解,达到抗纤维化的作用.     

胰岛素样生长因子-1对大鼠结肠平滑肌细胞增殖、凋亡及MAPK通路的影响

目的 探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对大鼠结肠平滑肌细胞(SMCs)增殖、凋亡及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路的影响.方法 利用酶解法分离培养Sprague-Dawley大鼠结肠SMCs,进行免疫组化染色鉴定后,将其分为对照组、IGF-1组和IGF-1+ PD98059[细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂]组,分别采用噻唑蓝(MTT)法检测SMCs增殖,流式细胞术AnnexinV-FITC/PI检测SMCs凋亡,Western印迹检测磷酸化ERK、ERK、磷酸化p38MAPK、p38MAPK和磷酸化c-Jun氨基末端激酶(JNK)、JNK的表达.结果 分离培养的细胞经免疫组化鉴定为结肠SMCs,IGF-1组较对照组细胞增殖增强[(1.786 ±0.271)比(0.998±0.057),P＜0.01],凋亡率降低[(2.59±0.28)％比(20.68±2.48)％,P＜0.01],磷酸化ERK表达增强,磷酸化ERK/ERK比值升高[(42.71±3.74)％比(23.88±2.52％),P均＜0.01];磷酸化p38MAPK、p38MAPK、磷酸化JNK、JNK表达无差异(P均＞0.05).IGF-1+ PD98059组较对照组细胞增殖下降[(0.154±0.021)比(0.998±0.057),P＜0.01],凋亡率升高[(84.31±7.54)％比(20.68±2.48)％,P＜0.01],磷酸化ERK表达减弱,磷酸化ERK/ERK比值降低[(10.47±1.22)％比(23.88±2.52)％,P均＜0.01].结论 IGF-1可能通过激活结肠SMCs MAPK通路中的ERK途径,促进细胞增殖,抑制凋亡,可能与p38MAPK途径和JNK途径无关.     

软脂酸通过丝裂原活化蛋白激酶通路促进血管内皮细胞凋亡

目的探讨软脂酸(PA)诱导的血管内皮细胞凋亡中丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的作用。方法将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分对照组、PA组、MAPK通路干预组[分别先用p38抑制剂SB203580、氨基末端激酶(JNK)抑制剂PD98059、细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂SP600125干预]再分为PA+SB组、PA+PD组、PA+SP组。流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western blot法检测caspase-3、磷酸化p38、JNK和ERK1/2表达水平;分光光度法检测caspase-3的活性。结果与对照组比较,PA组、PA+SB组、PA+PD组、PA+SP组HUVEC凋亡及caspase-3表达和活性明显增加,PA组磷酸化p38MAPK表达明显增加(P<0.05)。与PA组比较,PA+SB组HUVEC细胞凋亡率、caspase-3表达和活性明显降低(P<0.05);而PA+PD组和PA+SP组HUVEC凋亡率、caspase-3表达和活性无明显变化(P>0.05)。结论 PA通过p38MAPK通路促进内皮细胞凋亡。     

沉默结缔组织生长因子对鼠转化生长因子β/Smads信号的影响

目的 研究小干扰RNA(siRNA)沉默结缔组织生长因子(CTGF)对大鼠转化生长因子(TGF)β/Smads信号通路的影响.方法 将化学合成CTGF siRNA转染肝星状细胞(HSC)T6和经门静脉注入CCl4诱导6周的肝纤维化大鼠,设空白及随机siRNA对照,抽提HSC T6及大鼠肝组织总RNA和蛋白质,应用Western blot和RT-PCR检测HSC T6及肝组织CTGF及TGF β1,Smad2、3、7蛋白质和基因表达. 结果与空白对照组相比,siRNA能显著下调HSC T6 CTGF蛋白表达,以48 h最明显,CTGF蛋白表达下调94%±4%(t=46.196,P<0.01),而TGF β1、Smad2,3,7 mRNA表达差异无统计学意义;模型组及对照siRNA组,CCl4诱导的大鼠肝组织CTGF和TGF β1蛋白表达明显上调,与模型组相比,CTGF siRNA组大鼠肝组织CTGF及TGF β1蛋白表达分别下调95%±2%(F=21.234,P<0.01)和74%±8%(F=13.464,P<0.05),但Smad2和Smad7蛋白表达无明显改变. 结论沉默CTGF基因表达对大鼠肝TGF β/Smads信号具有阻抑作用.     

硫化氢在外源性SB203580预处理人卵巢癌SKOV3细胞增殖中的作用

目的探讨硫化氢(H2S)供体硫氢化钠(Na HS)对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响及可能机制。方法体外培养SKOV3细胞,随机分为正常对照组、Na HS组、SB203580组、Na HS+SB203580组,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测各组SKOV3细胞增殖,流式细胞术检测各组SKOV3细胞周期分布,Western印迹检测各组SKOV3细胞中P-p38MAPK蛋白表达。结果与正常对照组比较,Na HS组SKOV3细胞增殖明显增加,G1期细胞明显减少,S期细胞明显增加,且p-p38MAPK表达明显增加(均P<0.01);SB203580组、Na HS+SB203580组SKOV3细胞增殖均明显减少,G1期细胞均明显增加,S期细胞均明显减少,且p-p38MAPK表达均明显降低(均P<0.01)。而与Na HS组比较,SB203580组、Na HS+SB203580组SKOV3细胞增殖均明显减少,G1期细胞均明显增加,S期细胞均明显减少,且p-p38MAPK表达均明显降低(均P<0.01);与SB203580组比较,Na HS+SB203580组SKOV3细胞的增殖明显增加,G1期细胞明显减少,S期细胞明显增加,且p-p38MAPK表达明显增加(均P<0.01)。结论 H2S可能通过活化p38MAPK信号通路促进SKOV3细胞增殖。     

辛伐他汀抑制肝星状细胞活化及其对腺苷酸活化蛋白激酶活性的影响

目的 研究辛伐他汀治疗非酒精性脂肪性肝纤维化的作用机制.方法 高脂饲料喂养大鼠复制非酒精性脂肪性肝纤维化模型,辛伐他汀灌胃治疗后,病理学染色观察肝组织病理改变,RT-PCR和Western blot法测定肝组织腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)α的mRNA和蛋白质表达水平,同时测定血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、ALT、AST和血清肿瘤坏死因子(TNF)α水平.体外用促进脂肪细胞分化的培养液诱导人肝星状细胞株LX-2获得静止表型,分别用转化生长因子β1(TGFβ1)、辛伐他汀、TGFβ1+辛伐他汀处理静止型LX-2细胞,RT-PCR和Western blot法检测AMPKα的mRNA及蛋白质表达变化.多组间数据比较用单因素方差分析或析因设计方差分析,两组间数据比较用q检验. 结果 高脂饮食24周成功复制大鼠非酒精性脂肪性肝纤维化模型.随造模时间的延长,肝组织炎症、脂肪变和纤维化程度加重,血清TC、TG、ALT、AST和TNFα水平逐渐升高(P值均＜0.01),肝组织AMPKα的mRNA相对表达量及活性逐渐降低(P＜0.01或P＜0.05).与模型对照组相比,辛伐他汀治疗组TC、TG、ALT、AST和TNF α[水平明显下降(P值均＜0.05),AMPKα mRNA(0.31±0.05比0.24±0.07)和AMPK α[活性(0.45±0.07比0.27±0.07)明显升高(q值分别为3.22和6.44,P＜0.01或P＜0.05);肝星状细胞的AMPKα活性明显增强(静止型为0.93±0.10比0.72±0.09,活化型为0.72±0.10比0.54±0.10,q值分别为7.00和6.00,P值均＜0.01),α-平滑肌动蛋白的mRNA和蛋白质表达明显减少(分别为0.30±0.02比0.36±0.02和0.30±0.03比0.38±0.02,q值分别为11.245和11.216,P值均＜0.01),I型胶原的mRNA和和蛋白质表达也明显减少(分别为0.30±0.03比0.37±0.03和0.25±0.03比0.33±0.03,q值分别为8.791和11.163,P值均＜0.01).结论 辛伐他汀可以通过提高AMPK活性,抑制肝星状细胞活化,延缓非酒精性脂肪性肝纤维化的发生和发展.     

吡格列酮对谷氨酸引起皮质神经元损伤的保护作用及其机制

目的观察吡格列酮对谷氨酸引起皮质神经元损伤的保护作用及机制。方法初生大鼠乳鼠的皮质神经元体外培养7 d后用于实验,建立谷氨酸损伤模型,用Hoechst33258核染色观察细胞凋亡的形态学改变,MTT法测定细胞活力,W estern印迹法检测磷酸化p38MAP激酶蛋白水平。结果谷氨酸组细胞存活率较对照组明显降低(P0.01),吡格列酮、SB203580和一氧化氮合酶抑制剂(SMT)提高细胞存活百分率(P0.01)。谷氨酸组细胞凋亡百分比较对照组增加(P0.01),吡格列酮SB203580和SMT均能降低细胞凋亡百分比(P0.01)。谷氨酸组磷酸化p38MAP激酶蛋白水平较对照组明显升高(P0.01),吡格列酮明显降低磷酸化p38MAP激酶蛋白水平(P0.01)。结论吡格列酮对谷氨酸引起体外培养皮质神经元损伤具有保护作用,此作用与降低磷酸化p38MAP激酶蛋白水平有关。