细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95疫苗的构建及鉴定

目的 构建和鉴定细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(rBb)-Eg95疫苗.方法 自行设计引物,从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得Eg95抗原编码基因,采用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切,定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌(E.coli-Bb)穿梭表达载体pGEX-1λT中,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,构建重组质粒pGEX-Eg95.抽提质粒进行双酶切鉴定后,电穿孔转化到Bb中,构建细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定.结果 RT-PCR扩增出471 bp的Eg95抗原编码基因;重组质粒用双酶切鉴定可切出4947 bp的载体片段和471 bp的目的 基因片段:以具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板进行PCR扩增可得到471 bp的Eg95基因片段.结论 成功构建了细粒棘球绦虫rBb-Eg95疫苗,为该疫苗的开发利用奠定了理论基础.     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31融合基因疫苗。方法自行设计引物,从细粒棘球蚴包囊中分离原头节,超声粉碎后提取总RNA为模板,通过RT-PCR分别扩增Eg95和EgA31抗原编码基因,然后采用基因拼接法(gene SOEing)剪接Eg95和EgA31,得到Eg95-EgA31融合基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,构建重组质粒pGEX-Eg95-EgA31,抽提质粒进行双酶切鉴定,电穿孔法转化两歧双歧杆菌(Bifidobacteria bifidum,Bb),构建细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定。结果RT-PCR扩增出约1 016bp的Eg95-EgA31融合基因;重组质粒用双酶切鉴定可切出预期大小片段,以具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提的质粒为模板进行PCR扩增可得到约1016bp的Eg95-EgA31融合基因片段。结论成功构建了细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31融合基因疫苗,为该疫苗的开发利用奠定了实验基础。     

铜绿假单胞菌重组Ef-LasR疫苗的构建、鉴定及表达

目的构建以粪肠球菌为载体的铜绿假单胞菌重组Ef-LasR疫苗,并研究其表达效率。方法采用PCR扩增铜绿假单胞菌标准株PA01的LasR基因,然后克隆至pGEX-1λT载体,构建重组质粒pGEX-LasR。将重组质粒电穿孔转化感受态粪肠球菌构建重组Ef-LasR疫苗,抽提质粒进行PCR和双酶切鉴定。重组疫苗用IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 PCR扩增出717 bp的LasR基因;双酶切和PCR证实重组疫苗(rEf-LasR)构建正确;SDS-PAGE显示rEf-LasR能够高效表达分子质量单位为53 ku的目的蛋白,Western blot显示该蛋白能被铜绿假单胞菌感染的鼠血清识别。结论成功构建了重组Ef-LasR疫苗,其表达产物具有反应原性,为铜绿假单胞菌疫苗的进一步研究奠定了基础。     

铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF的构建及其表达

目的构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,研究该质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中的表达。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株总RNA为模板,自行设计引物,采用RT-PCR方法扩增OprF抗原编码基因,经酶切、连接后定向克隆入大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-OprF,转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达后用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析和鉴定。结果 RT-PCR扩增出1 016 bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切和测序鉴定证实OprF基因成功插入pGEX-1λT中;SDS-PAGE分析表达产物分子质量单位约为61 ku,与预期结果一致,表达的蛋白质占菌体总蛋白的16%;Western blot鉴定重组蛋白能被Pa外膜粗抗原免疫小鼠血清识别。结论成功构建了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF,该质粒在E.coliBL21(DE3)中高效融合表达,表达的融合蛋白具有抗原特异性。     

铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I构建、鉴定及其在大肠埃希菌中的表达效率

目的构建并鉴定铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I,观察其在大肠埃希菌中的表达效率。方法以铜绿假单胞菌PA01株的DNA为模板,PCR扩增OprF和OprI抗原编码基因,采用基因拼接法(gene SOEing)剪切OprF和OprI得到OprF-I融合基因,酶切后与表达载体pGEX-1λT连接,构建重组质粒pGEX-OprF-I并转化入大肠埃希菌中,抽提质粒进行双酶切和PCR鉴定。重组菌用异丙硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,采用SDS-PAGE和western blot分析和鉴定表达产物。结果基因拼接法获得1289 bp的OprF-I融合基因;其连接产物经双酶切和PCR鉴定证实该基因成功插入pGEX-1λT中。重组质粒转化DE3后经IPTG诱导,SDS-PAGE检测显示重组菌表达预期约68×10~3的融合蛋白,该蛋白约占菌体总量的18%。Western blot检测Pa感染的鼠血清可特异性识别该融合蛋白。结论成功构建并鉴定了铜绿假单胞菌重组质粒pGEX-OprF-I,转化大肠埃希菌后高效表达OprF-I融合蛋白,该蛋白具有反应原性。     

日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(pGEX-Sj32)疫苗构建及鉴定

目的 构建和鉴定日本血吸虫重组两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)pGEX-Sj32疫苗.方法 从重庆医科大学附属第一医院传染病寄生虫病研究所构建的重组大肠埃希菌BL21 (pET28α-Sj32)中抽提质粒pET28α-Sj32,通过PCR扩增Sj32抗原编码基因;将Sj32基因定向克隆至大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Sj32,将该重组质粒转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞(DE3),抽提质粒后进行双酶切鉴定;采用电穿孔法,将重组质粒pGEX-Sj32转化至Bb,构建Bb(pGEX-Sj32)疫苗,再从该疫苗中抽提重组质粒pGEX-Sj32,以其为模板进行PCR鉴定.结果 从抽提质粒pET28α-Sj32中PCR扩增出长度约为1 270 bp的Sj32基因片段;重组质粒pGEX-Sj32经双酶切鉴定,获得长度为4 947 bp的载体片段和长度为1 270 bp的Sj32基因片段;以抽提的疫苗质粒pGEX-Sj32为模板进行PCR扩增,得到了长度约为1 270 bp的Sj32基因片段,与预期结果相符.结论 成功构建了日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj32)疫苗.     

铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株的构建

目的 构建铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。方法 分别以质粒pUCGM和铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板PCR扩增庆大霉素抗性基因(GM)和铜绿假单胞菌clpP基因及其3'、5'侧翼序列,将clpP基因及其3'、5'侧翼序列克隆至pMD19T载体, EcoRV切除clpP基因37 bp~453 bp片段后,引入庆大霉素抗性基因,构建重组质粒pCKR2;EcoRⅠ/HindⅢ双酶切重组质粒pCKR2,回收FclpP-GM-clpPR片段,与自杀质粒pEX18Tc连接,得到clpP基因缺陷的同源重组载体pCKR3;将pCKR3质粒转化大肠埃希菌SM10,与铜绿假单胞菌PAO1双亲杂交,庆大霉素筛选得到铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株。结果 经酶切鉴定同源重组载体pCKR3构建正确;PCR和DNA测序鉴定铜绿假单胞菌clpP基因缺陷株构建成功。结论 本研究成功敲除了铜绿假单胞菌clpP基因,为进一步研究clpP基因的生物学功能奠定了基础。     

猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定猪带绦虫重组双歧杆菌(Bb)(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗。方法用疏水甘氨酸接头连接TSO45W-4B和TSOL18编码基因,通过全基因合成方法合成猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因。将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18。电穿孔法将该质粒导入Bb,构建猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗,从具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。结果全基因合成789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段。从具有氨苄青霉素抗性的rBb中抽提质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切得到4 944bp的pGEX-1λT载体片段和789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段,与预期结果相符;以该重组质粒为模板进行PCR扩增得到789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段,经测序基因片段为789bp,与预期大小相符。结论成功构建了猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗,为该疫苗的表达及免疫原性研究奠定了基础。     

铜绿假单胞菌重组Ef-PopB疫苗的构建、鉴定及表达

目的构建铜绿假单胞菌重组屎肠球菌(Enterococcus faecium,Ef)-PopB疫苗并观察其表达效率。方法以铜绿假单胞菌PA01株基因组DNA为模板,PCR扩增PopB基因,然后定向克隆至载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-PopB。将该质粒电穿孔转化Ef,构建rEf-PopB疫苗,抽提质粒,经双酶切和PCR鉴定后,加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,采用SDS-PAGE和Western blot分别对表达产物进行分析和鉴定。结果 PCR成功扩增出1 200 bp的PopB基因;双酶切证实PopB基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rEf-PopB疫苗构建成功。SDS-PAGE检测重组疫苗表达相对分子质量约66×10~3的融合蛋白;Western blot检测Pa感染鼠血清能特异性识别该重组疫苗表达蛋白。结论成功构建了rEf-PopB疫苗,其表达产物具有免疫反应性,为Pa疫苗的研制奠定了基础。     

日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗的构建及鉴定

目的构建并鉴定日本血吸虫重组双歧杆菌属两歧双歧杆菌(Bb)(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗。方法从本室保存的BL21(DE3)(pET28α-Sj26GST-Sj32)重组菌中抽提质粒pET28α-Sj26GST-Sj32,PCR扩增Sj26GST-Sj32融合基因,将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32。将此重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中,抽提质粒并进行BamHⅠ及EcoRⅠ双酶切,鉴定载体片段及目的基因片段长度。用电穿孔法将重组质粒pGEX-Sj26GST-Sj32转化至Bb,构建重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32),抽提质粒,进行PCR鉴定。结果 PCR成功扩增出长度为1 991bp的Sj26GST-Sj32融合基因;双酶切证实Sj26GST-Sj32融合基因成功插入质粒pGEX-1λT中;PCR证实从重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗中扩增出1991bp的Sj26GST-Sj32融合基因。结论成功构建重组Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗。     

幽门螺杆菌重组Bb-hpaA-vacA疫苗的构建

目的 构建幽门螺杆菌( Hp) 重组双歧杆菌( Bb) Bb-hpaA-vacA疫苗。方法 通过 PCR 分别扩增hpaA和vacA抗原编码基因, 然后采用gene SOEing 剪接hpaA和vacA, 得到hpaA-vacA融合基因;将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT, 构建重组质粒 pGEX-hpaA-vacA,电穿孔法将该质粒导入Bb, 构建幽门螺杆菌重组hpaA-vacA 疫苗。结果 PCR成功扩增出分子量约为1500 bp的 hpaA-vacA融合基因,双酶切证实hpaA-vacA融合基因成功插入pGEX-1λT中,并成功转化入双歧杆菌,构建rBb-hpaA-vacA疫苗。结论 成功构建螺杆菌rBb-hpaA-vacA疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定了基础。     

日本血吸虫重组两歧双歧杆菌pGEX-Sj14-3-3疫苗构建及鉴定

目的 构建日本血吸虫重组双歧杆菌属两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)pGEx-Sj14-3-3疫苗,并进行鉴定.方法 从日本血吸虫成虫中提取总RNA,通过RT-PCR扩增Sj14-3-3抗原编码基因.将Sj14-3-3基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中,构建重组质粒pGEX-Sj14-3-3.用重组质粒将大肠埃希菌BL21(DE3)转化为感受态细胞,抽提重组质粒进行双酶切,鉴定载体片段和基因片段长度:采用电穿孔法,用重组质粒pGEX-Sj14-3-3转化Bh,构建Bb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗,抽提疫苗的质粒进行PCR鉴定,比较重新构建的pGEX-Sj14-3-3基因片段长度与日本血吸虫成虫中Sjl4-3-3基因片段长度是否相同.结果 RT-PCR扩增出的日本血吸虫成虫Sj14-3-3基因片段长度为399 bp;双酶切鉴定,重组质粒pGEX-Sj14-3-3载体片段长度为4947 bp,Sj14-3-3基因片段长度为399 bp;在重组的Bb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗中,得到Sj14-3-3基因片段长度为399 bp,与预期的结果一致.结论 成功构建了日本血吸虫重组Bb(pGEX-Sj14-3-3)疫苗.

Abstract：

Objective To construct and identify recombinant vaccine Bifwlobacterium bifidum(Bb)pGEX-Sj14-3-3 of Schistosoma japonicum(Sj). Methods Total RNA was extracted from adult Sj, antigen encoding gene Sj14-3-3 was amplified by RT-PCR and cloned into Escherichia coli (E. coli)-Bb shuttle expression vector pGEX-1λT to construct recombinant plasmid pGEX-Sj14-3-3. The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3).The plasmid was extracted and identified by using BamH I and EcoR I. Then pGEX-Sjl4-3-3 was electroporated into Bb to construct recombinant Bb (pGEX-Sj14-3-3) vaccine. The extracted plasmid of the recombinant Bb (pGEX-Sj14-3-3) vaccine was identified by PCR, and the size of the products was compared with Sj14-3-3 gene of adult worms.Results Sj14-3-3 of 399 bp in length was amplified by RT-PCR. The products were digested by BamH I and EcoR I , and the fragments length of plasmid pGEX-Sj14-3-3 vector was 4947 bp, and of Sj 14-3-3 gene was 399 bp.The product of 399 bp Sj14-3-3 gene was also amplified by PCR from template of the extracted plasmid of the recombinant Bb(pGEX-Sj14-3-3 ) vaccine. The size of the product obtained was just the same as expected.Conclusion The recombinant Bb(pGEX-Sj14-3-3) vaccine of Sj is successfully constructed.     

抗汉坦病毒核衣壳蛋白单链抗体基因的克隆与鉴定

目的将已筛选出的抗汉坦病毒核衣壳蛋白（NP）抗原单链抗体基因克隆入原核表达载体pGEX-6p-1,构建重组表达质粒pGEX-6P-1-scFv。方法提取含抗NP抗原单链抗体基因的T7噬菌体DNA,此为模板,PCR扩增单链抗体基因,BamHI和SalⅠ双酶切,经连接酶与BamHⅠ和SalⅠ双酶切的表达载体pGEX-6p-1连接;重组DNA转化入宿主菌E．coli BL-21（DE3）,琼脂糖凝胶电泳初筛选阳性重组质粒,并用PCR法、双酶切法及DNA测序鉴定。结果重组质粒pGEX-6P-1-scFv经BamHⅠ和SalⅠ双酶切,片段大小分别为5000bp和750bp,与预期值一致;重组质粒PCR产物大小为750bp,与预期值一致;测定重组质粒序列,并与scFv序列比较,结果相一致。抗NP单链抗体基因序列克隆人表达载体pGEX-6p-1。结论成功构建了含抗汉坦病毒NP抗原单链抗体基因的重组原核表达质粒pGEX-6P-1-SCFv。     

多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗的构建及鉴定

目的构建和鉴定多房棘球绦虫(Em)重组双歧杆菌(Bb)-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗。方法通过PCR扩增EmⅡ/3和Em14-3-3抗原编码基因,然后采用基因拼接法(geneSOEing)剪接EmⅡ/3和Em14-3-3,得到EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;将该融合基因定向克隆到大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT,构建重组质粒pGEX-EmⅡ/3-Em14-3-3;用电穿孔法将该质粒导入Bb,构建多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗。结果PCR成功扩增出2554bp的EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因;双酶切证实EmⅡ/3-Em14-3-3融合基因成功插入pGEX-1λT中;PCR证实rBb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗构建成功。结论成功构建了多房棘球绦虫重组Bb-EmⅡ/3-Em14-3-3疫苗,为该疫苗的开发和利用打下了坚实的实验基础。     

细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗构建及鉴定

目的构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗并鉴定。方法从包囊中分离原头节,超声粉碎后抽提总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增Eg95编码基因并鉴定。将该基因片段定向克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pBCG中构建pBCG-Eg95重组质粒。用电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rBCG-Eg95疫苗,用HgCl2筛选经PCR鉴定。结果经电泳及测序证实从原头节扩增出471bp Eg95蛋白编码基因。重组质粒pBCG-Eg95经酶切及PCR证实,并经PCR鉴定已成功转入BCG。结论成功构建细粒棘球绦虫重组BCG-Eg95疫苗,为rBCG-Eg95疫苗进一步研究奠定基础。     

盆腔炎患者感染大肠埃希菌中重组质粒pGEX-SrtA△N59的构建及测序分析

目的构建盆腔炎患者感染大肠埃希菌重组质粒pGEX-SrtA△N59并进行测序鉴定,为寻找盆腔炎患者感染大肠埃希菌的治疗新方法和新药研发奠定基础。方法分别提取pMD20-SrtA和pGEX-4T-1质粒并进行鉴定。然后根据SrtA基因序列来设计特异性引物,以pMD20-SrtA为模板进行SrtA△N59基因PCR扩增。将目的片段克隆至pGEX-4T-1中,构建pGEX-SrtA△N59重组质粒,进行酶切和测序分析。结果 pMD20-SrtA酶切目的基因片段约为618bp,与预期SrtA基因片段大小相符合,可作为模板扩增SrtA△N59。pGEX-4T-1经单、双酶切均获得5 000bp片段,大小与预期值（4 900bp）相符合,该质粒可应用于构建重组质粒。PCR扩增产物约460bp,与SrtA△N59基因的大小符合。构建的pGEX-SrtA△N59重组质粒经双酶切,获得460bp目的基因片段,表明SrtA△N59基因成功插到载体pGEX-4T-1中;基因测序显示,其与AF162687基因序列100%匹配。SrtA△N59基因大小应为441bp,但本实验设计引物时在其两端分别加有酶切位点以及保护性基团,所以所得扩增产物的目的片段大小约为460bp。结论构建的pGEX-SrtA△N59中成功插入SrtA基因,重组质粒构建正确。     

刚地弓形虫致密颗粒蛋白GRA7基因的重组、表达及鉴定

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7)基因重组质粒并在大肠埃希菌中进行表达。方法根据GRA7基因序列设计合成引物,用PCR方法从弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因片段,再克隆到pGEX-4T载体中,重组质粒经酶切、PCR鉴定并测序;重组质粒在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析并纯化,Western blot分析其反应原性。结果 GRA7基因PCR产物大小约为714bp,与预期相符;重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合;重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的GRA7融合蛋白分子质量单位约为53ku,该蛋白可被His标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫GRA7基因,表达蛋白具有反应原性,为弓形虫诊断抗原试剂盒的制备奠定了基础。