多重PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌

目的　建立鼠疫耶尔森氏菌多重PCR鉴定系统 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定。方法　针对分别存在于pFra、pRst质粒上毒力基因caf1和pla ,以及一段 2 76bp染色体序列 3a分别设计引物。采用多重PCR技术 ,同时检测caf1、pla、3a三个靶序列。结果　应用该多重PCR反应体系 ,对我国鼠疫耶尔森氏菌 17个生态型及新发现的青海田鼠鼠疫疫源地菌株的多重PCR扩增结果表明 ,实验菌株中除 2株分别缺失pFra、pPst质粒而扩增出 2条产物带外 ,其余 5 2株均扩增出预期的 3条产物带 ,相关菌株均阴性 ,其检测灵敏度为 1× 10 -4ngDNA。 结论　该方法用于鼠疫耶尔森氏菌的鉴定简便、快捷 ,具有很高的特异性和敏感性 ,为鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定提供了有力手段     

2种致病性耶尔森氏菌与鼠疫菌EV株的相互拮抗作用

目的研究3种对人致病性耶氏菌在试管内的拮抗作用,以探讨目前雷州半岛的鼠疫疫源性。方法分别将小肠结肠炎菌、假结核菌与鼠疫菌EV株等量同时混合接种于赫金格尔溶解血肉汤,在不同时间点取样并进行菌落计数。结果小肠结肠炎菌0：3、0：9、猪盲株、假结核519株抑制了EV株,而EV株抑制了假结核277株。结论所选3种致病性耶尔森氏菌株存在相互拮抗作用。     

利用分子生物学技术对鼠疫耶尔森菌的分类鉴定

目的 对4株可疑菌株进行系列验证实验,以确定其是否为鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)自然分离株.方法 用鼠疫细菌学常规方法和分子生物学手段确定其生物学表型特征、特异性基因及基因组特征.结果 4株菌具备鼠疫菌的典型形态特征;能被鼠疫噬菌体完全裂解;主要生化特性为阿胶糖(+)、鼠李糖(-)、麦芽糖(+)、蜜二糖(-)、甘油(-)、脱氮(+),与鼠疫菌同源菌株菌苗株(EV76)一致;其毒力因子为F1(+),VW(+),Pgm(-),PstⅠ(+),与鼠疫菌菌苗株(EV)特征完全一致;109个/ml可疑菌对实验动物小白鼠无致死能力.具有鼠疫标识基因;差异片段(DFR)分型结果,4株菌的24个DFR扩增,DFR谱不同于任何鼠疫菌自然分离菌株基因组型.结论 尽管4菌株具备鼠疫菌自然分离株的一些表型特征,但基因组特征表明其不是鼠疫菌自然分离株,而是鼠疫菌同源菌株菌苗株(EV菌).     

广东鼠疫静息期小肠结肠炎、假结核耶尔森氏菌流行病学调查

目的查明广东省鼠疫静息期动物间及蚤小肠结肠炎、假结核菌感染情况。方法采集鼠类回盲部内容物和猪、牛粪便分别放入改良PBS缓冲液中,置4℃增菌3周,经KOH溶液处理后,涂布IN培养基; 蚤类直接拉胃接种IN培养基,置28℃24 h,挑取可疑菌落鉴定。结果疫源地从鼠、猪粪、蚤、死猪分离出小肠结肠炎耶尔森氏菌61株,血清型0：3（40株）,0：9（21株）和假结核耶尔森氏菌1株。非疫源地从鼠分离出小肠结肠炎耶尔森氏菌2株、中间型耶尔森氏菌1株。结论广东目前动物间小肠结肠炎耶尔森氏菌感染普遍,猪感染率最高,局部已暴发流行,假结核耶尔森氏菌偏低,鼠疫处于静息期。     

用UDPE技术检测和鉴定鼠疫耶尔森氏菌

我们建立了用ＵＤＧ（尿嘧啶糖基化酶）防ＰＣＲ产物污染,以两个不同基因为靶序列扩增检测同一病原菌和用微孔板杂交－酶联显色检测ＰＣＲ产物的ＵＤＰＥ（ＵＤＥ－ＤｕｐｌｅｘＰＣＲ－ＥＩＡ）技术并用于鼠疫耶尔森氏菌的检测与鉴定。结果表明,该系统可以特异地检测和鉴定鼠疫耶尔森菌,检测灵敏度可以达到１ＣＦＵ／ｍｌ。     

鼠疫耶尔森氏菌快速检测研究进展

目的论述一套对鼠疫耶尔森氏菌特异性强、快速、灵敏度高的快速检测方法,对鼠疫做到早发现、早预防、早诊断、早治疗,预防和控制鼠疫的发生和流行。方法查阅和收集国内外相关鼠疫耶尔森氏菌快速检测的文献和资料。结果鼠疫耶尔森氏菌检测技术向着快速、敏感、特异的标准化和国际化方向发展,其检测技术更加先进、齐全、完备。结论鼠疫耶尔森氏菌的检测技术从细菌学、血清学及分子生物学等正向更快速、更先进的方向发展,这对鼠疫防治将发挥重要作用。     

广东省65株耶氏菌的系统鉴定与鼠疫疫源地性质的探讨

目的鉴定65株耶氏菌,了解菌株的生物学特性,抗原抗体与鼠疫菌的相关性,探讨疫源地的现状和性质。方法65株菌用3种致病性耶氏菌诊断血清,分别做玻片、试管凝集试验、生化试验、生长特性,挑选14株菌做毒力因子、毒力基因、致病性、交叉免疫原性、动物试验和血清学、药敏试验。结果 63株小肠结肠炎耶氏菌血清型42株O∶3、21株O∶9,中间型1株,假结核血清II型1株;VW+2株,VW±10株,VW-2株;14株菌F1Ag、F1Ab全阴;小肠结肠炎5株菌均有2个毒力基因(ail、ystA)阳性,VW+和VW±对小白鼠、家兔有致病性,动物感染一种耶氏菌后有交叉免疫力,抗原、活菌交叉吸收鼠疫抗血清后血清学IHA、RIHA没有交叉性,常用抗菌素敏感。结论目前动物感染小肠结肠炎菌普遍,猪感染最高,局部已爆发流行,假结核菌偏低,鼠疫处于静息期。     

鼠疫耶尔森氏菌质粒提取方法的改进

大多数鼠疫耶尔林菌均含有三种质粒，分子量分别为６５，４５和６Ｍｄａｌ。其中两种属大质粒，分离提取较困难。本实验在参照Ｃａｓｓｅ法基础上对质粒提取中诸多影响因素逐一进行测试比较，选择出质粒提以的最适条件：细菌培养于２８℃，１８－２２小时，菌液浓度为２００ｍｇ／ｍｌ，溶菌液ＳＤＳ终浓度２％，每１０ｍｌ溶菌液加０．１ＮＮａＯＨ１．３５ｍｌ，４５℃温育３０－４０分钟。建立了一种简便，快速且重复性较高的提取     

鼠疫耶尔森氏菌外膜蛋白研究进展

耶尔森氏菌属中致病性细菌有3种，即鼠疫耶尔森氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌。其中鼠疫耶尔森氏菌是致病性最强的一种。随着分子生物学的研究进展，人们对鼠疫菌有了深入的了解。鼠疫菌外膜蛋白（Yops）是近些年对鼠疫菌的基础研究内容焦点之一。国内在世界上首先发现鼠疫菌锡林郭勒高原型病原体缺少32Kd外膜蛋白和40Kd蛋白位于膜内，     

鼠疫菌6MD质粒在假结核菌中的表达及其对假结核菌毒力的影响

使用电穿孔转化技术,将鼠疫耶尔森氏菌所携带的6MD 质粒转移到假结核耶尔森氏菌中,获得了杂交菌株。该杂交菌株能够表达鼠疫菌素Ⅰ及凝固酶,但其毒力却仍与作为受体的假结核菌株类似,而没有向鼠疫菌的毒力水平接近。本文对这种现象的可能原因进行了分析。     

鼠疫诊断芯片的探针制备

目的 探索制备鼠疫诊断芯片特异性探针的新方法。方法 直接采用限制性核酸内切酶Sau3A Ⅰ消化鼠疫耶尔森菌3个致病性质粒，克隆在T载体上，再经巢式PCR扩增制备成打印芯片的探针。结果 该法收集到250条探针用于打印芯片。分别与鼠疫耶尔森菌，同属的假结核耶尔森菌和小肠结肠炎耶尔森菌杂交，可筛选出杂交信号强阳性的特异点阵。结论 该法简便可行，适于制备鼠疫诊断芯片的探针。     

鼠疫耶尔森杆菌YPO0388蛋白的原核表达与鉴定

目的构建表达鼠疫耶尔森杆菌(Yersinia Pestis)的假想蛋白YPO0388的重组质粒,为鼠疫耶尔森杆菌的诊断方法的发展提供支持。方法用PCR方法扩增出ypo0388基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中转化到大肠杆菌(E.co-liBL21(DE3)),用IPTG诱导目的基因表达,用SDS-PAGE方法对表达产物进行分析,用WesternBlot鉴定其免疫原性,并纯化出目的蛋白。结果根据单、双酶切鉴定和DNA测序结果显示,目的基因ypo0388已成功连接到表达载体pET32a(+)上,SDS-PAGE结果显示表达产物rYPO0388相对分子质量约为69.71kDa。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗鼠疫菌EV株血清识别。结论成功克隆并构建了pET32a-ypo0388重组基因原核表达系统,所表达的重组蛋白rYPO0388具有较好的可溶性与抗原性,有可能做为研制新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

鼠疫耶尔森杆菌蛋白YPO1996的融合表达与鉴定

目的在比较蛋白质组结果的基础上选择并构建pET32a-ypo1996,表达鼠疫耶尔森杆菌（Yersinia pestis）特异的假想蛋白YPO1996重组蛋白（rYPO1996）,为新鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的研究提供备选抗原。方法根据鼠疫菌CO92株全基因组序列设计引物,用PCR方法扩增目的基因YPO1996,将其定向插入表达载体pET32a（＋）上,转化至大肠埃希菌BL21（DE3）,用IPTG诱导,使重组质粒在工程菌中稳定高效地表达带组氨酸标签的融合蛋白,并亲和纯化该目的蛋白。通过SDS-PAGE方法对表达的蛋白产物进行初步分析,并用Western blot分析其抗原性。结果单、双酶切鉴定及DNA测序显示,目的基因YPO1996成功连接到表达载体pET32a（＋）上,SDS-PAGE显示表达产物分子质量单位约为53.11 ku,与预期值相符。重组蛋白经Western blot鉴定,能被兔抗免疫鼠疫菌EV株血清识别。结论成功构建了pET32a-ypo1996重组基因原核表达系统,表达的重组蛋白rYPO1996具有较好的可溶性及抗原性,可作为研发新型鼠疫耶尔森杆菌诊断试剂的备选抗原。     

几种鼠疫菌培养基的筛选试验

比较了鼠疫菌在胰酶消化液琼脂培养基、市售普通营养琼脂培养基和以胰蛋白Ｓｉ为主要万分自制的５种培养基上的生长情况。结果显示,鼠疫菌在上述７种培养基上均生长良好,可培养出具有鼠疫菌特点的典型菌落,其中营养琼脂培养基和胰蛋白Ｓｉ（２、３号）培养基操作简便、经济,便于基层使用和实验条件的质量控制。     

胶体金免疫层析法诊断鼠疫的特异性试验

目的研究胶体金免疫层析法用于鼠疫快速诊断的特异性。方法采用胶体金免疫层析测试条和鼠疫反向间接血凝试验(RIHA)平行检测。结果检测鼠疫菌F1抗原具有很强的特异性,不与包括小肠结肠炎和假结核耶尔森等其他细菌发生交叉免疫反应。结论该方法简便、快速、敏感,适合现场鼠疫监测。     

贵州省鼠疫耶尔森菌生物学特征研究

目的研究贵州省鼠疫耶尔森菌的生物学特征,探讨疫源地性质。方法对37株鼠疫菌进行生化试验、营养需求试验、毒力基因检测、随机扩增多态性DNA分析和脉冲场电泳分析。结果37株鼠疫菌均不发酵鼠李糖和甘油,发酵麦芽糖和阿拉伯糖,脱氮阳性。选择20株代表菌株检测均为苯丙氨酸依赖(Phe )、谷氨酸半依赖(Glu±);用Pla、Cafl、inv、hms4对引物分别进行PCR扩增,均得到456、249、1000和700bp的目标基因条带;随机引物(RAPD)分析均获得505、790、1140和1680bp的条带;脉冲场电泳图谱显示338、242.5、168和77kbp的条带。结论贵州省鼠疫菌株的生物学特征与云南省滇闽居民生态型鼠疫菌相同。     

中国鼠疫耶尔森菌染色体结构特征的研究

目的 了解中国鼠疫耶尔森菌不同分离株之间的染色体结构差异,探索染色体重排在鼠疫菌中发生的原因及用于菌株遗传特征识别和亲缘关系分析的可能性.方法 以完成全基因组测序的首株鼠疫菌株CO92(美国)为参考株,以从中国分离出的已完成全基因组测序的4株鼠疫菌株(内蒙古91001、云南剑川D182038、云南玉龙D106004、西藏那曲Z176003)为对比株,根据美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)上公布的这5株鼠疫菌的染色体序列及染色体上所有编码基因序列间的相似性,将鼠疫菌染色体人为的划分成多个大的DNA节段(染色体板块),确定这些板块在不同鼠疫菌株间排列方式的差异以及板块之间的断裂区片段的基因组成;根据菌株两两比较所得的重排差异结果,分析菌株间的亲缘关系.结果 除Z176003菌株外,CO92、D182038、D106004、91001菌株可被分成44个相对独立的染色体板块,板块内部基因组成和排列高度稳定,板块之间可以相对移动.与参考株CO92菌株比较,D182038、D106004菌株染色体均存在13处重排,Z176003菌株染色体存在14处重排,91001菌株染色体存在37处板块排列顺序的改变.菌株间两两比较,D106004与Z176003菌株之间仅有8处染色体板块排列方式不同,表明二者的亲缘关系最为接近.CO92菌株染色体上的相邻板块之间存在43个断裂区,有39个断裂区的DNA片段含有插入序列,其中25个插入序列为IS100.结论 鼠疫菌基因组具有一定的流动性,不同菌株间的染色体结构存在较大差异,染色体重排事件发生的原因与其拥有的插入序列密切相关.菌株间染色体的重排差异,能用于菌株遗传特征的识别和亲缘远近关系的分析.