广东省外观健康犬携带狂犬病毒情况调查结果分析

目的了解广东省外观健康犬狂犬病病毒带毒率情况。方法使用DFA法对随机采取的外观健康犬脑组织进行抗原筛查,再以RT-PCR和MIT法对DFA阳性样品进行复检,RT-PCR阳性的样品进行狂犬病毒N基因片段的扩增、测序和比较分析。结果在1 833份样品中,检出阳性样品2份,狂犬病病毒阳性率0.11%。序列分析显示这两株广东分离株属于狂犬病毒I型,基因同源性为99.7%。结论广东省外观健康犬中存在狂犬病毒感染情况,分离毒株与湖南和广西分离株有高度的亲缘关系。     

江西省黄鼬和鼬獾狂犬病流行病学监测

目的 为确定江西省除鼬獾外夜行肉食类野生动物黄鼬是否携带狂犬病病毒,对该地区黄鼬和鼬獾进行狂犬病流行病学监测,分析其感染状况。方法 在江西部分地区采集黄鼬和鼬獾脑组织样品,直接免疫荧光法（FAT）检测样品中狂犬病毒抗原,小鼠颅内接种实验（MIT）分离病毒,RT-PCR扩增其核蛋白和糖蛋白全基因进行测定,并与我国其他地区狂犬病病毒的核酸序列进行对比分析。结果 黄鼬脑组织样品FAT结果阳性率为0（0/1 102）,鼬獾阳性率为1.9 %（4/210）。经MIT分离到4株狂犬病病毒之间N基因和G基因的同源性较高,分别为99.6%～100%和99.7%～100%,与浙江和江西其它鼬獾狂犬病病毒分离株同源性为96.0%～99.3%和98.7%～99.1%,与浙江和福建犬源分离株（ZJ-QZ,D01,FJ008,FJ009等）同源性为88.2%～88.8%和87.6%～87.7%。结论 采样地区黄鼬样品中未发现狂犬病病毒感染,而鼬獾感染狂犬病病毒阳性率较高,说明其种群内存在狂犬病的流行;犬与鼬獾狂犬病病毒株同源性较低,二者交叉传播或溢出的可能性较低;黄鼬和鼬獾尽管同属夜行动物,但二者交互感染的可能性很低。有必要对该地区野生动物狂犬病进行长期监测。     

狂犬病病毒基质蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的以原核表达的狂犬病病毒M蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测狂犬病病毒抗体。方法为表达狂犬病病毒(RV)基质蛋白(M),采用RT-PCR方法从狂犬病病毒Flury-LEP株中扩增RV基质蛋白基因,双酶切后定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-M。将重组质粒pET-M转化至宿主菌E.coli Rosetta中进行表达。SDS-PAGE和Western blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的重组M蛋白作为包被抗原建立检测犬RV抗体的间接ELISA方法,通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量、血清的最佳稀释度、Protein A-HRP的最佳稀释度。结果经PCR、双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-M构建成功,将重组质粒进行转化后诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析得到高效表达的M蛋白,重组蛋白可被RV阳性血清特异性识别,表明基质蛋白具有良好的反应原性。用表达的狂犬病病毒M蛋白建立了检测RV抗体的间接ELISA方法,用该间接ELISA方法与以狂犬病病毒作为诊断抗原的商品化ELISA试剂盒分别对93份临床血清样品进行检测,结果两者的符合率为89.2%。结论用原核表达的重组M蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用做检测犬RV抗体水平的参考。     

山东省4株狂犬病病毒核蛋白基因序列分析

目的通过对山东省4株狂犬病病毒核蛋白(N)全基因序列的测定与分析,了解近年山东省狂犬病病毒流行株的遗传变异情况。方法直接免疫荧光法(DFA)和RT-PCR法检测2007-2008年在山东省采集的14份疑似狂犬病病毒感染的犬脑组织标本,检测阳性标本进行N基因序列测定、序列同源性比较和种系发生分析。结果 DFA和RT-PCR法检测均为阳性的标本为12份,其中4份得到N基因编码区全序。4株病毒N基因核苷酸序列的同源性在97.9%～99.9%之间,推导出的氨基酸序列同源性为98.7%～99.8%。结论近年山东省狂犬病病毒具有地域性特征,进化变异不大,与我国各地流行株相近。     

胶体金免疫层析检测犬、猫抗狂犬病病毒IgG抗体的研究

目的建立检测犬、猫抗狂犬病病毒(RV)IgG抗体的胶体金免疫层析方法。方法采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金用以标记SPA,同时将重组RVN蛋白、抗SPA抗体分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上,制备一种检测犬、猫抗RVIgG抗体的胶体金检测卡,进行了特异性和灵敏度试验,并与ELISA同时检测临床样品、统计结果。结果 GICA试纸条检测灵敏度为0.5IU/mL,与犬瘟热病毒、犬细小病毒等阳性血清无交叉反应,并与ELISA相比,两者的符合率为94.6%。结论成功建立了检测犬、猫抗RVIgG抗体的通用型胶体金免疫层析方法 ,该方法灵敏度高,特异性强,检测速度快,操作简便,可广泛应用于基层。     

狂犬病病毒核酸RT-LAMP检测方法的建立

目的建立RT-LAMP方法,实现对狂犬病病毒核酸的快速、灵敏、简便的检测。方法针对狂犬病病毒的核衣壳蛋白基因（N基因）和大转录酶蛋白基因（L基因）中的高度保守区段分别设计了一套引物,建立了检测狂犬病病毒的快速一步式反转录-环介导恒温扩增（RT-LAMP）方法。样品提取总RNA后,加入BstDNA聚合酶、各种反应成分,于63℃恒温水浴箱中放置60min,80℃5min终止反应,加入荧光染料SYBR GREEN I,根据颜色变化肉眼判定结果。结果两套引物对狂犬病病毒RNA进行RT-LAMP检测,均有良好的特异性,灵敏度均比RT-巢式PCR高10倍以上。结论该方法简单、快速,不需电泳,利用染色剂肉眼判定结果,不需要大型仪器,能在70min内完成对狂犬病病毒RNA的检测,适用于可疑动物的快速检测,尤其适合基层使用。     

狂犬病病毒荧光定量RT—PCR检测方法的建立与初步应用

目的建立狂犬病病毒快速检测法。方法根据狂犬病病毒核蛋白基因的保守序列分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针。构建pMD-N重组质粒,建立荧光定量RT-PCR绝对定量标准品,并对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;作重复性和特异性检验后进行临床标本的检测。结果构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.998。狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测反应的灵敏度为10个TCID_(50);5种非狂犬病病原体检测均为阴性。结论建立的狂犬病病毒的荧光定量RT- PCR检测方法快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好,可以应用于临床样品的检测。     

狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用

目的以狂犬病病毒P蛋白作为检测抗原,用间接ELISA方法检测狂犬病病毒抗体。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)LEP-Flury株的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出P基因的全长序列,克隆于pGM-T载体中,获得重组质粒pGM-T-P,将重组质粒用限制性内切酶NotI和EcoRI进行双酶切,酶切产物定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核重组表达质粒pET-32a-P,阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的蛋白作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步将间接ELISA方法应用于狂犬病病毒抗体的检测中。结果扩增RV P基因,构建了克隆质粒pGM-T-P、原核表达质粒pET-32a-P,高效表达了主要以可溶性形式存在的P蛋白,并能与RV阳性血清发生特异性反应。用表达的狂犬病病毒重组P蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法。结论成功表达了磷蛋白,用其作为固化抗原以间接ELISA方法检测RV抗体。     

RT-PCR和ELISA在检测小儿病毒性腹泻中的应用比较

[目的]RT-PCR和ELISA在检测小儿病毒性腹泻中的效能分析。[方法]收集我院2018年6月～2019年1月在门诊及住院的1个月～5岁400例儿童的腹泻粪便标本。利用RT-PCR和ELISA方法检测标本中的RV、NV、AstV和AdV病毒性病原。具体操作方法,严格按照试剂盒说明书进行操作。[结果]采用RT-PCR检出至少有132份标本含有至少1种病毒核酸:116份单一病毒核酸呈现阳性,14份双重病毒核酸呈现阳性,2份三重以上病毒核酸阳性。核酸阳性的检出率为36.7%。采用ELISA的方法检出98份标本含有至少1种病毒核酸:86份单一病毒核酸阳性,12份双重病毒核酸阳性。核酸阳性的检出率为27.2%。2种检测方法检测RV、NV、AstV和AdV病毒性病原差异有统计学意义。[结论]RT-PCR和ELISA 2种检测方法的检测结果具有很好的一致性。RT-PCR和ELISA此2种检测方法均以RV、NV的阳性检出率较高,RT-PCR法除对EAdV阳性检出率低于ELISA外,对其他3种病毒的检出率均高于ELISA。     

贵州省狂犬病病毒糖蛋白基因序列特征分析

目的 分析贵州省狂犬病病毒的糖蛋白基因（G基因）序列特征,为狂犬病的有效预防和控制提供科学依据。方法 以RT- PCR扩增贵州省近年来不同地区的人和犬狂犬病病毒阳性脑组织标本狂犬病病毒G基因序列,对扩增产物测序后采用生物信息学软件进行序列分析。结果 贵州省狂犬病毒阳性标本经RT-PCR扩增、测序与拼接后得到8份狂犬病病毒阳性样本的G基因序列。同源性分析显示,8份狂犬病病毒阳性样本的G基因序列在核苷酸及氨基酸水平上彼此的同源性分别为87.4%～99.9%和83.3.%～100%,与狂犬病毒基因1型病毒株G基因的核苷酸和氨基酸序列同源性最高（分别为86.5%～87.0%和83.3%～100%）。进化树分析显示,贵州省狂犬病病毒G基因的亲缘进化关系较近,且与狂犬病毒基因1~7型中的基因1型代表毒株的亲缘进化关系最近;除GZ01和GZ09外,其余狂犬病毒G基因与国内湖北、湖南、安徽、广西、江苏和上海毒株相距较近。除GZ09与国外的马来西亚和泰国代表毒株亲缘进化关系最近外,其与毒株与印度尼西亚毒株亲缘进化关系最近。结论 本研究从狂犬病病毒G基因水平证明贵州省狂犬病毒株属于基因1型,揭示了我省贵州省狂犬病毒与国内外已报道毒株的亲缘进化关系,该研究结果将为贵州省狂犬病的有效预防和控制提供科学依据。     

A comparative evaluation of a new immunoenzymatic test (RREID) with currently used diagnostic tests (DME and FAT) for dog rabies.

Diagnosis of rabies in dogs was performed in microplates which had been coated with immunoglobulin G previously sensitized to purified rabies virus antinucleocapsids. Homogenized brain suspensions were incubated in the plates and the specific binding rabies antigen was revealed by the use of the same IgG conjugated with horseradish peroxidase. Samples from the same specimens were subjected to standard rabies diagnostic tests--the direct microscopic examination (DME) or Sellers staining for Negri bodies and the fluorescent antibody test (FAT). FAT was used as the reference test or gold standard because of its proven sensitivity and accuracy. The concordance of FAT with RREID was 98.89% while that with DME was 96.67%. Sensitivity of both DME and RREID compared with FAT in this study was 100% while specificity of RREID versus FAT was 98.46% as compared with 95.38% DME versus FAT. The positive predictive value of RREID versus FAT was 96.15% while that of DME versus FAT was 89.29% although the negative predictive value of both RREID and DME compared with FAT was 100%. In the overall assessment, RREID results were demonstrated to approximate closely those of FAT. It is therefore concluded that RREID can be used in diagnostic laboratories to corroborate DME and where MIT and FAT cannot be done. RREID would also be useful in epidemiological studies where large samples are tested.     

尼帕病毒巢式RT-PCR方法的建立和初步应用

目的 建立灵敏、特异的检测尼帕病毒的巢式RT-PCR方法。方法 根据GenBank公布的尼帕病毒N基因序列,设计2对特异性引物(外引物和内引物),建立巢式RT-PCR方法,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行临床样品的检测。结果 该方法扩增的片段序列与源序列同源性均为100%。特异性试验结果表明本试验设计的内外侧引物不能从新城疫病毒、牛瘟病毒和日本乙型脑炎病毒中扩增出条带。敏感性试验结果表明,该方法最低能检测出的标准模板RNA浓度为39 fg/μL。100份临床样品检测结果全部为阴性。结论 初步建立了快速、灵敏、特异的检测尼帕病毒 N基因的巢式RT-PCR方法,可用于动物疫病监测和检验检疫等领域。     

福建省狂犬病毒街毒株分离鉴定及生物学特性研究

目的 分离福建省狂犬病毒街毒株,了解病毒株的生物学特性。方法 采集疑似狂犬的脑组织,通过细胞培养和乳鼠脑接种分离狂犬病毒,用直接免疫荧光和RT-PCR等方法进行鉴定,并对病毒的分子生物学特性进行研究。结果 从疑似狂犬的脑组织中分离出狂犬病毒,TCID₅₀的测定结果显示,细胞毒滴度不高,病毒株对BHK-21细胞的适应性不强,LD₅₀的测定结果显示,病毒株为狂犬病毒强毒株。结论 从福建省家犬中成功分离到狂犬病毒街毒株,为狂犬病的实验室研究奠定基础。     

一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的 建立一种汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)和汉城病毒(Seoul virus,SEOV)双重实时定量荧光RT-PCR检测方法。方法 根据HTNV和SEOV S基因设计引物和探针、优化反应条件,建立2种汉坦病毒的双重实时荧光定量RT-PCR方法。以甲型流感病毒、登革热病毒、新布尼亚病毒、寨卡病毒、新冠病毒阳性核酸为模板验证方法的特异性,将建立的方法与巢氏RT-PCR比较,确定方法对临床样本的适用性。结果 建立了一种HTNV和SEOV 双重实时定量荧光RT-PCR检测方法,该方法对2种型别病毒的最低检测限均为10 copies/μL,不同浓度标准品Ct值批内和批间差异均小于2%。与登革热病毒、新布尼亚病毒、寨卡病毒、新型冠状病毒、甲型流感病毒均无交叉反应。对10份肾综合征出血热急性期血清样本进行检测,结果9份为HTNV、1份为SEOV,与巢式RT-PCR方法结果一致。结论 建立的双重实时荧光定量RT-PCR方法可以快速对HTNV和SEOV 进行分型和定量检测,适用于肾综合征出血热临床早期诊断。     

Real-time PCR analysis of dog cerebrospinal fluid and saliva samples for ante-mortem diagnosis of rabies

The use of a 10-day observation to determine whether a dog is rabid is standard practice. This study was conducted in order to look for evidence of rabies vius in saliva and cerebrospinal fluid (CSF) of suspected live rabid dogs at the time of quarantine by using a SYBR Green real-time RT-PCR based assay for the detection of rabies virus RNA. Saliva and CSF of dogs were collected once on the day of admission for the 10-day quarantine. All test dogs were or became ill and died of rabies within the observation period. Thirteen of 15 dogs (87%) had saliva samples that were positive for rabies RNA. Two dogs with furious rabies had negative saliva samples. Positive CSF samples were found in 4 of 15 dogs (27%) whose saliva samples were positive. The time from sample collection to result was less than 5 hours. Because virus may be absent or present at very low level in both clinical fluids, samples taken for ante-mortem diagnosis cannot definitively rule out rabies.     

应用含内参的多重实时荧光RT-PCR方法快速检测登革病毒和基孔肯雅病毒

目的 建立一种登革病毒、基孔肯雅病毒并含人类基因内参检测的多重实时荧光RT-PCR方法,能在同一反应管内同时检测目前发现的所有来源的登革病毒或基孔肯雅病毒。方法 针对登革病毒3′端非编码区和基孔肯雅病毒结构蛋白E2-6K-E1区以及人体各类组织细胞中均能稳定表达的RNAse P基因,设计了3套特异性引物和探针,建立了1套能同时检测登革病毒、基孔肯雅病毒及含有人类基因检测内参的多重实时荧光RT-PCR方法,对其灵敏性和特异性进行了验证,并对临床发热病人标本进行了应用评估。结果 该方法对检测体外转录合成的登革病毒和基孔肯雅病毒RNA的灵敏性可达最低每个反应10～100拷贝,对检测登革1型病毒和基孔肯雅病毒的灵敏性分别可达最低每个反应0.1 TCID₅₀/mL和1 TCID₅₀/mL。用20株登革病毒、4株基孔肯雅病毒和日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒、盖塔病毒、辛德毕斯病毒各1株进行检测,方法的特异性均为100%。方法应用于189份发热病人血清标本检测,可准确地鉴定出其中登革病毒或基孔肯雅病毒核酸阳性的标本,且所有血清标本均能被内参引物和探针有效地扩增和杂交。结论 本研究建立了一种高灵敏性、高特异性且含人类基因内参检测的登革病毒和基孔肯雅病毒多重实时荧光RT-PCR检测方法,可作为登革热或基孔肯雅热病人早期快速鉴别诊断的有效工具,也可用于蚊媒携带登革病毒或基孔肯雅病毒的高通量快速筛查。