狂犬病病毒P基因的原核表达及间接ELISA方法的应用

目的以狂犬病病毒P蛋白作为检测抗原,用间接ELISA方法检测狂犬病病毒抗体。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)LEP-Flury株的基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出P基因的全长序列,克隆于pGM-T载体中,获得重组质粒pGM-T-P,将重组质粒用限制性内切酶NotI和EcoRI进行双酶切,酶切产物定向克隆于原核表达载体pET-32a(+)中,构建原核重组表达质粒pET-32a-P,阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的蛋白作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步将间接ELISA方法应用于狂犬病病毒抗体的检测中。结果扩增RV P基因,构建了克隆质粒pGM-T-P、原核表达质粒pET-32a-P,高效表达了主要以可溶性形式存在的P蛋白,并能与RV阳性血清发生特异性反应。用表达的狂犬病病毒重组P蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法。结论成功表达了磷蛋白,用其作为固化抗原以间接ELISA方法检测RV抗体。     

狂犬病病毒基质蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

目的以原核表达的狂犬病病毒M蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测狂犬病病毒抗体。方法为表达狂犬病病毒(RV)基质蛋白(M),采用RT-PCR方法从狂犬病病毒Flury-LEP株中扩增RV基质蛋白基因,双酶切后定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-M。将重组质粒pET-M转化至宿主菌E.coli Rosetta中进行表达。SDS-PAGE和Western blot分析确定蛋白表达量和特异性。用纯化的重组M蛋白作为包被抗原建立检测犬RV抗体的间接ELISA方法,通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量、血清的最佳稀释度、Protein A-HRP的最佳稀释度。结果经PCR、双酶切及测序鉴定,重组质粒pET-M构建成功,将重组质粒进行转化后诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析得到高效表达的M蛋白,重组蛋白可被RV阳性血清特异性识别,表明基质蛋白具有良好的反应原性。用表达的狂犬病病毒M蛋白建立了检测RV抗体的间接ELISA方法,用该间接ELISA方法与以狂犬病病毒作为诊断抗原的商品化ELISA试剂盒分别对93份临床血清样品进行检测,结果两者的符合率为89.2%。结论用原核表达的重组M蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用做检测犬RV抗体水平的参考。     

埃博拉病毒VP40蛋白的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立北大核心CSCD

目的以埃博拉病毒(EBOV)VP40基因原核表达产物为抗原建立检测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法。方法在分析EBOV VP40基因稀有密码子(大肠埃希菌系统)的基础上去除5′和3′端稀有密码子,合成VP40基因,构建VP40蛋白原核表达载体pET22b-VP40,并转化至BL21(DE3)菌,在1.0mmol/L IPTG和37℃条件下诱导表达目的蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化蛋白为抗原,建立检测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法。结果成功构建重组质粒pET22b(+)-VP40,表达的VP40蛋白经SDS-PAGE鉴定分子质量单位为40ku,与预期值相符;Western blot检测证实VP40重组蛋白能被抗VP40单克隆抗体识别。以该蛋白为包被抗原建立监测埃博拉出血热抗体的间接ELISA方法,其敏感性和特异性均为100%。结论成功构建了pET22b(+)-VP的重组质粒,并诱导表达VP40蛋白。该蛋白具有免疫反应性,以该蛋白为抗原建立的ELISA方法具有较高的特异性和稳定性,可用于埃博拉出血热的诊断和流行病学调查。     

西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ的原核表达及间接ELISA方法的建立

目的 建立西尼罗河病毒(West Nile Virus, WNV)抗体检测方法。方法 人工合成了WNV NY99株E蛋白结构域Ⅲ(DⅢ)基因序列,构建了重组表达载体PET-28a-DⅢ。结果 重组质粒转化BL21宿主菌后诱导表达,SDS-PAGE分析表明,表达产物相对分子量17 kD,以包涵体形式存在。对表达产物作变性和复性及纯化处理,Western-blot鉴定结果表明,纯化产物可被WNV血清识别。将纯化重组蛋白包被酶标板,优化间接ELISA反应条件,抗原最佳包被浓度为3.75 μg/mL、血清最佳稀释度为1∶1 600、酶标二抗最佳稀释度1∶6 000、阴阳血清临界值为0.148。特异性、敏感性及重复性试验结果表明,本方法特异性强、敏感性高、重复性良好。结论 本研究为WNV感染的血清学诊断提供了技术储备。     

基于塔姆德病毒NP蛋白间接ELISA方法的建立北大核心CSCD

目的原核表达和纯化Tamdy病毒(TAMV)核蛋白(NP),以此为抗原建立间接ELISA方法,以期用于TAMV感染血清流行病学调查。方法采用PCR法扩增NP基因,构建重组质粒(pET-32a-NP)并转化至E.coli BL21中诱导表达NP蛋白,15%SDS-PAGE鉴定和镍柱亲和层析纯化重组NP蛋白,以TAMV阳性羊血清为一抗,采用ELISA检测其抗原性。以纯化的pET-32a-rNP作为包被抗原,通过方阵滴定优化反应条件,建立检测TAMV血清抗体的间接ELSIA方法,评价其重复性、敏感性和特异性。检测采自新疆部分地区动物血清,采用建立的ELISA方法检测TAMV抗体。结果成功构建pET-32a-NP重组质粒和表达菌株pET-32a-rNP,重组蛋白大小约为72 ku并具有反应原性;ELISA优化试验确定的最佳包被浓度为4μg/ml、封闭液浓度为3%、血清稀释度为1∶100、血清孵育时间为100 min,酶标抗体稀释度为1∶3000,TMB显色时间为6 min;通过检测30份阴性样品确定临界值,当样品吸光充A450值≥0.268时判定为阳性;重复性试验结果表明,批内和批间变异系数(CV)<10%。敏感性试验表明,阳性血清稀释度达1∶600,具有良好的敏感性。特异性试验表明,该方法不与GTV、CCHFV和SFTSV发生交叉反应。取464份采自新疆不同地区的羊、狗和鼠血清标本进行ELISA检测,检出TAMV阳性血清68份,阳性率14.66%。结论建立的检测TAMV血清抗体的间接ELISA方法敏感、特异,且重复性良好,可用于TAMV的血清流行病学调查。     

狂犬病毒N基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

目的用表达的狂犬病核蛋白建立检测狂犬病抗体的间接ELISA方法。方法根据GenBank发表的狂犬病病毒(Rabies Virus,RV)ERA株N基因序列设计引物,利用PCR的方法从重组质粒pMD-N中扩增RV N基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体pET28a(+)中,构建原核表达载体pET-N。阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达并确定表达N基因的最佳诱导时间。通过凝胶薄层扫描分析和Western-blot分析确定表达蛋白的表达量和特异性。用纯化的表达产物作为诊断抗原,通过对各反应条件的优化,初步建立检测RV抗体的间接ELISA方法。结果扩增了RV N基因,构建了原核表达载体pET-N和原核表达菌,表达了N基因且目的蛋白以包涵体形式存在表达菌中,最佳诱导时间为4 h。重组蛋白表达量占菌体总蛋白的56.8%,并能与RV阳性血清发生特异性反应。用表达的狂犬病重组N蛋白建立了用于RV抗体检测的间接ELISA方法。结论成功表达了狂犬病核蛋白,用表达的狂犬病核蛋白建立的间接ELISA方法可以用于RV抗体的检测。     

家养野猪源EMCV VP1基因的原核表达及其间接ELISA方法的建立和应用

目的以原核表达的脑心肌炎病毒(EMCV)VP1蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测EMCV抗体。方法应用原核表达载体pET-28a构建家养野猪源EMCV VP1基因的重组表达质粒,并在感受态细胞BL21中表达,将该重组蛋白纯化后作为包被抗原,建立间接ELISA标准化检测程序,并应用于临床检测。结果经双酶切、PCR和测序鉴定,重组质粒pET-28a-VP1构建成功,转化后诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析得到高效表达的VP1蛋白,该重组蛋白可被EMCV阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性;通过优化反应条件,确定抗原浓度为1.25 ug/mL、待检血清以1∶80倍稀释为最佳抗原包被浓度和待检血清最佳稀释度,5%脱脂乳作为封闭液,待检血清的最佳作用时间为37 ℃作用60 min,酶标抗体稀释度的最佳工作浓度和最佳作用时间分别为1∶8 000和37 ℃ 30 min,底物最佳显色时间为20 min,特异性强,敏感性较高,重复性良好;应用该间接ELISA方法分别检测河南省126个猪场送检的1 618份血清和527份PCV-2抗体阳性血清,发现阳性场检出率为65.87%,血清总阳性率为45.30%,不同规模和不同阶段猪群均存在EMCV感染,中小型猪场的阳性率显著高于规模化猪场,EMCV与猪圆环病毒2型的混合感染率高达75.14%。结论应用原核表达的重组VP1蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法可用于检测EMCV抗体水平,临床检测结果填补了河南省EMCV血清流行病学监测的空白。     

检测蓝氏贾第鞭毛虫病毒表达的绿色荧光蛋白间接ELISA方法的建立

目的 建立蓝氏贾第鞭毛虫病毒(GLV)介导的绿色荧光蛋白(GFP)表达定量检测方法，为GFP在寄生性原虫病毒研究中的应用奠定基础。方法 以GFP兔抗血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔血清为二抗，建立GFP定量检测的间接ELISA方法。结果 定量检测GFP的问接ELISA方法最适反应条件为以10％正常胎牛血清作为封闭剂，一抗的最佳稀释度为1：3200，二抗的最佳稀释度为1：1600。结论以GFP兔抗血清为一抗成功建立GFP定量检测的间接EI。ISA方法，检测结果能正确反映GLV介导的GFP表达情况。     

检测蓝氏贾第鞭毛虫病毒表达的绿色荧光蛋白间接ELISA方法的建立

目的建立蓝氏贾第鞭毛虫病毒(GLV)介导的绿色荧光蛋白(GFP)表达定量检测方法,为GFP在寄生性原虫病毒研究中的应用奠定基础。方法以GFP兔抗血清为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔血清为二抗,建立GFP定量检测的间接ELISA方法。结果定量检测GFP的间接ELISA方法最适反应条件为以10%正常胎牛血清作为封闭剂,一抗的最佳稀释度为1∶3200,二抗的最佳稀释度为1∶1600。结论以GFP兔抗血清为一抗成功建立GFP定量检测的间接ELISA方法,检测结果能正确反映GLV介导的GFP表达情况。     

乙型脑炎病毒E基因在杆状病毒中的表达及其初步应用

目的克隆表达日本乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)的E基因,研究其抗原性,并初步作为诊断抗原建立JEV抗体检测方法。方法用RT-PCR方法扩增E基因全长,然后克隆到pFastbacTM载体中,转化宿主菌DH5a中,提取阳性克隆质粒转导到DH10Bac,利用通用引物鉴定阳性,提取其基因组转染昆虫细胞sf9,而后经IFA和Western blot进行鉴定。挑蚀斑纯化获得高纯度和高滴度的重组病毒,收集细胞裂解上清作为抗原建立间接ELISA方法,对不同年龄段猪血清进行检测。结果从JEV中成功克隆E基因,并在昆虫细胞中得到表达,分子量约53kD,具有良好的抗原性。建立的ELISA方法的抗原最佳包被浓度为30μg/ml,待检血清的最佳稀释度为1:40,阳性判定标准初步定为OD450≥0.3,且OD值待检血清/OD值阴性血清≥2。结论JEV的E基因经过体外昆虫细胞表达,获得抗原性良好的蛋白作为诊断抗原,用其建立的ELISA方法能很好用于猪群JEV抗体水平的检测。     

狂犬病病毒糖蛋白重组表达及其基因工程疫苗研究进展

狂犬病病毒糖蛋白(RVGP)是唯一暴露于病毒颗粒表面的抗原,能够诱导宿主产生中和抗体,也是唯一存在于所有新型狂犬病疫苗中的病毒成分。本文综述了国内外学者利用原核系统,以及包括酵母系统、植物系统、昆虫细胞系统在内的真核系统和哺乳动物细胞系统、病毒载体系统来表达具有免疫原性的重组狂犬病病毒糖蛋白(rRVGP),并对其与天然RVGP在结构和激发机体免疫反应方面的相似性进行的相关研究,为狂犬病基因工程新型疫苗提供研究思路。     

优化密码子以提高狂犬病病毒糖蛋白基因在原核细胞的表达

目的探讨提高狂犬病病毒(RV)HEP-Flury株糖蛋白(GP)基因在原核细胞中表达的水平和与抗体的反应水平。方法以RVHEP-Flury株的全长质粒为模板,采用PCR方法扩增获得去除信号肽基因的GP(G1)、GP的膜外区基因(G2)。选取膜外区基因中抗原表位富集区基因,对氨基酸密码子进行修饰并合成其序列(G3)。分别将G1、G2及G3基因亚克隆到表达载体pET32a(+),构建融合表达质粒pET32a-G1、pET32a-G2及pET32a-G3,转化表达宿主菌BL21,并利用IPTG诱导表达。经SDS-PAGE,Western-blotting和薄层扫描分析,比较重组蛋白的表达量。结果 G3基因的表达量比G1、G2基因明显提高。结论通过密码子优化,能显著提高G基因在原核细胞中的表达水平。     

狂犬病病毒CTN-1株在鸡胚细胞驯化过程中G基因和滴度分析

目的 研究狂犬病病毒CTN-1株在鸡胚细胞驯化过程中的特性。方法 利用RT-PCR反应扩增CTN-1株19个代次的G蛋白基因,获得cDNA进行序列测定;并以免疫荧光法测定各代次毒株在细胞中的滴度。结果 序列测定显示:CTN-1株在鸡胚细胞驯化过程中G蛋白基因序列发生不同程度变异且逐步积累,从第30代开始,G蛋白基因序列趋于稳定。与CTN-1株相比,CTN-1鸡胚细胞驯化株在G蛋白的第147、333、389、421和485位氨基酸发生了突变。与此相对应,CTN-1株鸡胚细胞驯化株滴度逐渐趋于稳定,并于第33-58代滴度维持在10~10^{1 g}细胞荧光转化灶单位/mL左右。G蛋白同源性分析表明,CTN-1株鸡胚细胞驯化株与我国近期不同区域分离得到的街毒株具有较高同源性,其G蛋白氨基酸同源性为89.3%~99.0%。结论 CTN-1株在鸡胚细胞驯化过程中G蛋白基因发生稳定变异,滴度在传代后33-58代达到较高水平,稳定性较好,适于我国狂犬病防治的实际应用。     

狂犬病毒核蛋白基因的克隆及表达

目的获得狂犬病毒CVS株核蛋白(N)基因并在大肠杆菌中表达,为进一步研发狂犬血清学检测试剂盒提供抗原。方法RT-PCR扩增狂犬病毒CVS株核蛋白测序、并定向克隆入原核表达载体pET-28a,构建原核重组表达质粒pET-28a-N,转化大肠杆菌E.coliBL21,并经IPTG诱导在大肠杆菌中表达CVS株核蛋白。结果与结论扩增的CVS株N基因与发表的CVS株N基因序列完全一致,并在大肠杆菌中得到了高效表达,且表达产物具有免疫反应性,为进一步研发狂犬血清学检测试剂盒提供了抗原。     

上海地区2004年疑似狂犬的病毒检测分析及其应用

目的对2004年上海地区疑似狂犬进行病毒检测,分析应用于狂犬伤多人应急事件的处理。方法收集126份疑似狂犬病的犬脑标本,用ELISA法快速检测狂犬病毒抗原、小鼠感染法(MIT)分离病毒和免疫荧光法(IF)鉴定病毒型别。对疑似狂犬进行地区和时间分布调查。结果3种方法完全一致。确诊狂犬的阳性率为22.2%(28/126),鉴定为1型狂犬病毒。6-8月检出率最高,为全年的75%(21/28)。病毒检测阳性的地区进行紧急防治措施。结论狂犬病毒检测3种方法,既可快速诊断,又可获得定型的毒株。便于对狂犬地区采取应急防治措施,利于控制预防狂犬病。     

4株狂犬病街毒的分离及其核蛋白和糖蛋白序列分析

目的以4株狂犬病街毒分离株及我国南北方不同地区狂犬病病毒街毒为研究对象,通过其核蛋白及糖蛋白基因的同源性及进化分析,比较我国狂犬病流行毒株与人用及兽用狂犬病疫苗株间的基因及抗原性差异,为相关疫苗的研究奠定理论基础。方法以直接免疫荧光法(DFA)检测疑似狂犬病的犬脑标本,以乳鼠颅内接种法(MIT)和细胞培养分离技术(CIT)分离狂犬病病毒,并进行TCID50和LD50测定;以RT-PCR法扩增其核蛋白(N)和糖蛋白(G)基因,克隆入T载体并测序后,下载GenBank内已有的狂犬病病毒数据资源,以(Clustal和MEGA3软件)进行基因同源性比对及系统发生分析。结果从广东、河北两省分离到狂犬病病毒街毒4株,分别命名为GN07、WJ07-1、WJ07-2、GC07;序列分析表明4株狂犬病病毒均为基因1型,其N基因与G基因核苷酸的同源性分别为89.5%~99.9%和87.9%~99.9%,其中GN07与WJ07-1、WJ07-2、GC07的同源性较低。与己知的基因1型狂犬病毒相比,WJ07-1、WJ07-2、GC07与湖南、湖北、云南、浙江等地分离株及印度尼西亚分离株核苷酸同源性最高,分别为97.8%~99.4%和92.2%;GN07与CTN疫苗株核苷酸同源性最高,为94.5%。系统发育分析表明,4株病毒与CTN疫苗株同源性较高,与人用狂犬病疫苗3aG、PV株及兽用狂犬病疫苗ERA株和Flury疫苗株的同源性相对较远。适应细胞培养后,四株街毒的LD50和TCID50最高者为GN07,而WJ07-1较低,差别较大。结论4株狂犬病分离株与我国南北方不同地区狂犬病流行毒株的基因和氨基酸序列存在一定差异,在进化关系上分属于不同的分支。