不同浓度肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向肝细胞分化******

背景：研究证实在多种微环境下可以将骨髓间充质干细胞诱导分化为成熟肝细胞,但诱导条件及诱导分化率尚无定论,选择合适的诱导剂及诱导剂浓度尤为重要。 目的：观察肝细胞生长因子和表皮细胞生长因子体外联合诱导兔骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的最适浓度。 方法：不同浓度肝细胞生长因子、表皮细胞生长因子联合诱导培养原代兔骨髓间充质干细胞,观察细胞形态学变化,并检测肝细胞表面标志物甲胎蛋白、白蛋白表达及肝细胞合成功能。 结果与结论：随诱导时间延长,可观察到多极性的肝细胞样细胞。7 d时甲胎蛋白表达阳性,14 d达最大值后即开始下降(P < 0.05),此后各浓度组间表达无差别(P > 0.05)。14 d时白蛋白表达阳性,随时间延长,阳性细胞数递增(P < 0.05),且细胞生长因子浓度越高,阳性细胞数越高(P < 0.05)。诱导早期(9~15 d) 白蛋白上清液中白蛋白水平与诱导剂浓度成正比(P < 0.05)。18 d或21 d达高峰后下降,此时各浓度组间含量无差别(P > 0.05)。结果显示高浓度的肝细胞生长因子及表皮细胞生长因子可提高骨髓间充质干细胞向肝细胞的分化率,诱导剂最适浓度为肝细胞生长因子60 μg/L、表皮细胞生长因子4.5 mg/L。     

microRNA-16在脂肪基质细胞脂向分化过程中的表达变化

背景：触发和控制脂肪基质细胞脂向分化的调控研究将有助于人为控制脂肪基质细胞的分化方向，促进对细胞分化的深入了解。 目的：了解脂肪基质细胞脂向分化过程中microRNA-16的表达变化情况。 设计、时间及地点：观察对比试验，2007-10/2008-03在四川大学口腔疾病研究国家重点实验室完成。 材料：出生30 d雄性体健SD幼鼠8只。成脂诱导培养液[DMEM培养液中加入地塞米松(1 μmol/L)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(0.5 mmol/L)、胰岛素(10 mg/L) ]。 方法：从SD幼鼠体内取出脂肪，采用密度梯度离心结合贴壁培养法获得了纯度高的脂肪基质细胞，采用脂向诱导液对第3代的脂肪基质细胞进行诱导培养，并以未诱导的细胞为对照。 主要观察指标：应用microRNA芯片技术检测脂肪基质细胞脂向诱导后7 d和未诱导microRNA-16的表达差异。采用实时定量PCR检测microRNA-16在脂肪基质细胞脂向分化前后表达量变化。 结果：①成功获得纯度较高的脂肪基质细胞，成功诱导其脂向分化，诱导培养后7 d观察到细胞形态学上表现出典型的脂肪细胞改变：细胞相互融合，成片生长，变为细长纺锤形；PPARγ免疫细胞化学染色呈阳性；油红O染色脂滴被染成橙红色。②成脂诱导前后microRNA-16表达明显下调，诱导前microRNA-16表达量为90.25。诱导后microRNA-16表达量为56.75，③实时定量PCR结果显示microRNA-16表达显著下调，与microRNA芯片结果一致。 结论：PCR及芯片结果一致支持microRNA-16在脂肪基质细胞脂向分化过程中表达显著下调，可能在脂肪基质细胞脂向分化过程参与调控。     

成年大鼠骨髓基质细胞与划痕损伤星形胶质细胞相互作用后的形态学观察

目的通过研究骨髓基质细胞(MSCs)与星形胶质细胞的相互作用,探索MSCs修复中枢神经系统损伤的机制.方法体外培养Wistar大鼠MSCs和Wistar乳鼠海马来源的星形胶质细胞,并将两种细胞共培养,然后在相差显微镜下观察其生长状态,扫描电镜下观察其超微结构变化,对照组为单一的MSCs与星形胶质细胞.结果共培养后第6天的MSCs、星形胶质细胞与对照组比较,存活状态良好;超微结构观察显示星形胶质细胞损伤明显减轻,可见明显的微绒毛、长突起、丝状伪足,其周围及表面聚集大量的MSCs,二者关系密切,部分MSCs呈典型的神经元样外观,并与星形胶质细胞有类突触样结构形成.结论①MSCs与星形胶质细胞能够在体外相互促进生长;②星形胶质细胞具有调控神经元分化的功能.     

星形胶质细胞诱导成年骨髓基质细胞分化成神经元样细胞的实验研究

目的探讨星形胶质细胞能否在体外诱导成年大鼠骨髓基质细胞向神经元方向分化。方法采用新生鼠海马组织来源的星形胶质细胞与转染有绿色荧光蛋白基因的骨髓基质细胞(MSCs)进行共培养,并分成三组:共培养组、共培养 脑源性神经营养因子(BDNF)组、单纯碱性成纤维生长因子(bFGF) BDNF诱导分化组,在相差显微镜下每日观察、记录MSCs的诱导分化状况,并应用免疫荧光染色技术对分化后的MSCs进行鉴定,同时应用流式细胞术测定MSCs分化前后及星形胶质细胞的DNA含量。结果共培养第4天,部分MSCs已初步具备神经元形态:折光性强的锥形或圆形胞体及长的多极突起,免疫荧光染色呈微管相关蛋白(MAP-2ab)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)阳性;DNA的含量测定结果显示诱导分化后第7天未发现有四倍体、六倍体细胞。结论(1)星形胶质细胞可以在体外诱导成年大鼠MSCs向神经元方向分化,这种分化并不是由细胞融合引起的。(2)星形胶质细胞具有调控神经元的分化、促进神经元成熟的功能。     

星形胶质细胞与Aβ1-40诱导凋亡的PC12细胞共育条件培养液对神经干细胞分化的影响机制

目的 将星形胶质细胞与β-淀粉样蛋白(Aβ1-40)诱导凋亡的PCI2细胞共育,观察星形胶质细胞条件培养液(ACM)对胚胎大鼠皮层神经干细胞(NSCs)体外定向分化为神经元的比例影响及机制,探讨神经营养素家族蛋白[包括脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养素-3(NT-3)]是否参与此过程. 方法 PC12细胞分别经10 μg/mLAβ1-40诱导不同时间(0、4、6、12、24h)后分为两部分,第一部分应用流式细胞技术检测不同时间点PC12细胞凋亡率;第二部分分别与星形胶质细胞共育2 d,将收集的ACM分为两部分.一部分应用ELISA法检测ACM中BDNF、NGF、NT-3蛋白含量,另一部分以1;3比例同DMEM/F12堵养基混合,对NSCs进行体外诱导分化,应用激光共聚焦显微镜、NSE免疫荧光技术鉴定和计数神经元分化比例. 结果 在Aβ1-40作用6 h时间点,PC12细胞凋亡率达高峰,与其共育的ACM中BDNF蛋白总量明显增高,诱导的NSCs神经元分化比例明显升高,与其他组比较,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 星形胶质细胞与Aβ1-40诱导凋亡的PCI2细胞共育后.ACM提高了NSCs向神经元的分化比例,ACM中BDNF可能参与了这一过程.     

星形胶质细胞条件培养液体外诱导胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元的分化

背景：在神经干细胞移植治疗神经系统退行性变及修复神经系统功能损伤过程中,有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的定向诱导分化尤为关键。 目的：以星形胶质细胞条件培养液为诱导剂,观察胎鼠室管膜前下区神经干细胞体外向多巴胺能神经元的分化。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2006-12/2007-08在解放军第三军医大学新桥医院实验中心完成。 材料：清洁级新生2 d龄KM小鼠15只,孕16 d Wistar大鼠40只,均由解放军第三军医大学实验动物中心提供。 方法：采用差速黏附法和振荡分离法纯化培养KM小鼠星形胶质细胞,收集传至第3代、培养5 d的星形胶质细胞条件培养液,-20 ℃冻存待用。体外分离Wistar胎鼠室管膜前下区神经干细胞,加入含B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12无血清培养基进行原代培养,传至第3代后按0.5×108 L-1密度接种,设立2组：对照组单纯加入含体积分数0.1为胎牛血清的DMEM/F12培养基予以自然分化,实验组加入已制备的星形胶质细胞条件培养液进行诱导分化。 主要观察指标：免疫细胞化学染色鉴定胎鼠室管膜前下区神经干细胞,流式细胞仪检测胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化的阳性率。 结果：培养的神经球细胞表达巢蛋白,可分化为神经元特异性烯醇化酶、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。诱导分化7 d后,实验组可见酪氨酸羟化酶阳性细胞,胞体呈圆形或椭圆形,酪氨酸羟化酶位于胞质及突起中;对照组酪氨酸羟化酶阳性细胞在数量、细胞成熟形态上均未达到实验组水平。实验组酪氨酸羟化酶阳性细胞分化率明显高于对照组（t=35.296,P < 0.01）。 结论：在体外星形胶质细胞条件培养液可显著促进胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元分化。     

骨髓基质细胞诱导后与神经细胞的比较研究

目的 通过体外诱导骨髓基质细胞（BMSCs)与神经细胞作比较。探索BMSCs体外诱导分化为神经细胞的可行性。方法 应用bFGF,BHA,EGF,Forskolin等配成诱导前剂，诱导剂和长期诱导剂，对大鼠BMSCs进行诱导，全程观察其变化，并聚诱导后4d细胞行神经元特异烯醇化酶（NSE），胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的免疫组化染色和Western Blot检测，与大鼠脊髓来源的神经细胞对比。结果 BMSCs诱导前后细胞形态。免疫组化，West-ern Blot检测有明显区别；诱导后细胞与神经细胞极为相似；诱导后细胞13-17d凋亡。结论 BMSCs诱导前后细胞形态，生长，凋亡和NSE，GFAP表达变化支持BMSCs可以体外诱导成神经细胞。     

黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞对

背景：实验室前期研究表明黄芩苷可以提高体外培养的神经干细胞分化为神经元的比例。但考虑到体内实验中血脑屏障的存在,黄芩苷能否通过血脑屏障主要细胞成分而发挥诱导神经干细胞定向分化为神经元的能力还不清楚。 目的：分别将大鼠脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞与神经干细胞共培养,观察在模拟体内复杂微环境条件下,黄芩苷能否定向诱导神经干细胞向神经元分化并促进分化神经元的成熟。 设计、时间及地点：细胞水平的体外对照观察,于2007-09/2008-03在天津中医药大学中医药研究院中药药理学重点实验室和南开大学医学院完成。 材料：取孕14 d SD大鼠,用以分离培养神经干细胞。 方法：利用Transwell装置,分别将脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞和神经干细胞共培养。用含有10 μmol/L黄芩苷的培养基作用7 d,并设置空白对照组。以β-tubulinⅢ标记未成熟神经元,MAP-2标记成熟神经元,胶质纤维酸性蛋白标记星形胶质细胞。 主要观察指标：应用细胞免疫荧光化学染色检测神经干细胞分化后β-tubulinⅢ、MAP-2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例,以实时荧光定量反转录-聚合酶链反应技术检测黄芩苷对脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞血管内皮细胞生长因子、神经生长因子和血小板衍生生长因子 mRNA表达的影响。 结果：与脑微血管内皮细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷可显著增加β-tubulinⅢ阳性细胞比例（P < 0.05）。与星形胶质细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷对β-tubulinⅢ、MAP-2和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞比例均无明显影响（P > 0.05）。与脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞共培养条件下,与空白对照组比较,黄芩苷可显著增加MAP-2阳性细胞比例（P < 0.01）。黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞48 h,可以显著上调血小板衍生生长因子基因表达（P < 0.01）;作用72 h可显著上调星形胶质细胞血管内皮细胞生长因子、神经生长因子和血小板衍生生长因子基因表达（P < 0.01）。 结论：黄芩苷作用于脑微血管内皮细胞可诱导神经干细胞向神经元分化,黄芩苷同时作用于脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞可诱导神经干细胞向神经元定向分化并促进其成熟,可能与黄芩苷调控脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞生长因子分泌,改善微环境有关。     

胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞与共培养多巴胺能神经元的存活

背景：目前尚未见脂肪间质干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的报道,且有关脂肪间质干细胞维持多巴胺能神经元存活的机制也缺乏实验证据。 目的：观察腺病毒介导胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞对共培养条件下多巴胺能神经元存活的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2007-03/12在吉林省耳鼻咽喉研究所和教育部吉林大学人兽共患病重点实验室完成。 材料：3周龄Wistar大鼠、孕14 d Wistar大鼠由吉林大学白求恩医学院实验动物中心提供。 方法：采用pAdTrackCV和pAdEasy-1系统构建重组胶质细胞系源性神经营养因子腺病毒。取孕14 d大鼠,采用酶消化法培养中脑多巴胺能神经元。取Wistar大鼠腹股沟处脂肪,酶消化法分离培养脂肪间质干细胞,体外培养至第3代当细胞生长至60%融合时,以病毒滴度为1×109 vp/mL的胶质细胞系源性神经营养因子重组腺病毒作用细胞1 h后,转移到生长培养基继续培养,通过ELISA法检测培养上清胶质细胞系源性神经营养因子水平。设立3组：Ad-GDNF转染共培养组、Ad-GFP转染共培养组分别在脂肪间质干细胞经相应病毒转染24 h后加入分离的多巴胺能神经元,继续培养7 d;单纯多巴胺能神经元培养组不加入脂肪间质干细胞。 主要观察指标：采用免疫荧光技术检测共培养环境对多巴胺能神经元存活的影响,共培养环境对胶质细胞系源性神经营养因子修饰脂肪间质干细胞分化的影响。 结果：脂肪间质干细胞在pAd-GDNF转染24 h后细胞上清中出现胶质细胞系源性神经营养因子蛋白,72 h达高峰,pAd-GDNF对脂肪间质干细胞的转染效率约为80%。酪氨酸羟化酶免疫荧光染色结果发现,Ad-GDNF转染共培养组多巴胺能神经元存活率明显高于单纯多巴胺能神经元培养组、Ad-GFP转染共培养组(55%,15%,25%,P < 0.01)。对共培养7 d的细胞进行酪氨酸羟化酶免疫荧光染色,分别以波长为488 nm和563 nm进行单通道扫描,未发现同时表达绿色荧光蛋白和酪氨酸羟化酶的细胞,表明此共培养环境可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的条件。 结论：胶质细胞系源性神经营养因子基因修饰的脂肪间质干细胞与胚胎中脑分离出的多巴胺能神经元共培养,能够维持和促进多巴胺能神经元的存活,但可能不具备诱导脂肪间质干细胞分化为多巴胺能神经元的作用。     

大鼠骨髓基质细胞体外培养向神经干细胞的诱导分化

目的：已证实骨髓基质细胞可分化为中胚层组织细胞，实验予进一步探讨体外分离培养的骨髓基质细胞向神经干细胞分化的可能性，以及是否能继续定向分化为神经细胞及神经胶质细胞，为神经系统疾病细胞移植治疗提供种子细胞。 方法：实验于2007-02/09在泸州医学院神经生物学研究室进行。①动物：选择5只普通级SD大鼠，由泸州医学院实验动物中心提供，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。②实验方法：大鼠戊巴比妥钠腹腔麻醉，取双侧胫骨和股骨，磷酸盐缓冲液冲洗骨髓腔，采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞，胰蛋白酶与EDTA联合消化，传至第4代，用含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20 μg/L表皮生长因子、N2辅助因子的DMEM/F12培养液向神经干细胞诱导分化。③实验评估：观察原代、传代培养及诱导分化后的骨髓基质细胞生长情况和形态变化，采用SABC法进行免疫细胞化学检测神经细胞特异性标志的表达。 结果：①骨髓基质细胞形态观察：原代细胞接种1 d后开始贴壁增殖，3 d后多数贴壁，贴壁细胞呈梭形或扁平形；10 d后90%细胞融合，以长梭形为主，突起粗大，形成网状、片状；传代后细胞贴壁速度加快，增殖能力更强，7 d左右达到融合。②诱导分化后细胞生长情况和形态变化：第4代骨髓基质细胞向神经干细胞诱导分化7 d，成球的细胞脱离瓶底，悬浮在细胞液中。将细胞离心弃上清，换成血清分化液后，细胞球逐渐贴壁，球周围很快发出突起，分化为星形胶质细胞样细胞、神经元样细胞及少突胶质细胞样细胞。③神经细胞特异性标志的表达：骨髓源性细胞球表达巢蛋白，呈棕黄色，为神经干细胞；从细胞球分化的细胞抗胶质纤维酸性蛋白、微管相关蛋白2及半乳糖脑苷脂均呈阳性。 结论：骨髓基质细胞能在体外诱导分化出神经干细胞，且骨髓源性神经干细胞可进一步定向分化为神经细胞及神经胶质细胞。     

Apoptosis is an obstacle to the differentiation of adipose-derived stromal cells into astrocytes

Previous studies have demonstrated that nerve cells differentiated from adipose-derived stro-mal cells after chemical induction have reduced viability;however, the underlying mechanisms remained unclear. In this study, we induced the differentiation of adult adipose-derived stromal cells into astrocytes using chemical induction. 3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetra-zolium bromide assay and flow cytometry showed that, with increasing induction time, the apoptotic rate gradually increased, and the number of living cells gradually decreased. Im-munohistochemical staining demonstrated that the number of glial fibrillary acidic protein-, caspase-3- and caspase-9-positive cells gradually increased with increasing induction time. Transmission electron microscopy revealed typical signs of apoptosis after differentiation. Taken together, our results indicate that caspase-dependent apoptosis is an obstacle to the differentia-tion of adipose-derived stromal cells into astrocytes. Inhibiting apoptosis may be an important strategy for increasing the efifciency of induction.     

The Effect of Autophagy in the Process of Adipose-Derived Stromal Cells Differentiation into Astrocytes

Autophagy plays different roles in the growth and development process of different cells. The role of autophagy in the differentiation process of adult adipose-derived stromal cells (ADSCs) into astrocytes is unclear. We researched the role of autophagy in the induction process by adding autophagy agonist rapamycin, which was not added in the control group. Immunocytochemistry showed that the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) was increased gradually with the extending reaction time and had reached the peak on the 14th day. Typical autophagy ultrastructure, including autophagic bodies and self-macrophage lysosomal, was shown under transmission electron microscopy (TEM) when cells were induced for 14 days. By methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay, we found that the number of living cells was reduced gradually, and early apoptosis rate was increased by flow cytometry. We observed that the differentiation ratio, the number of living cells, and the positive expression rates of GFAP in the rapamycin group were higher than those in the control group when ADSCs were induced for 48 h and 7 days (P?<?0.01); however, the rates of early apoptosis were lower than those in the control group. The positive rate of microtubule-associated protein light chain 3 (LC3) in the rapamycin group had been up to 88.87 % on the 7th day (P?<?0.01), but not obvious with extending time. After 14 days of induction, the optical density (OD) value of surviving cells was declined, and early apoptosis rate was increased gradually. The results showed that adding autophagy agonist to the inducers may enhance intensity of autophagy, shorten the induction time, and improve the efficiency of differentiation.     

Autophagy and apoptosis during adult adipose- derived stromal cells differentiation into neuron-like cells in vitro

β-mercaptoethanol can induce adult adipose-derived stromal cells to rapidly and efficiently differentiate into typical neuron-like cells in vitro.Immunohistochemistry showed that neuron specific enolase and neurofilament-200 expression gradually increased with the extension of induction time,and peaked at 5 hours.By contrast,glial fibrillary acidic protein was negatively expressed at all time points.Induced cells possessed a typical Nissl body,apoptosis showing condensed chromatin in the nucleus,autophagosomes with a bilayered membrane and autolysosomes in the cytoplasm at 5 hours.TUNEL assay and immunohistochemistry and immunofluorescence demonstrated that apoptosis and caspase-3 expression increased and peaked at 8 hours.Immunohistochemistry and immunofluorescence showed that microtubule-associated protein light chain 3 gradually increased with induction and reached a peak at 5 hours.These results indicate that autophagy played an important role in protecting cells during adult adipose-derived stromal cells differentiation into neuron-like cells in vitro.     

不同方法诱导大鼠脂肪基质细胞定向分化为神经细胞的比较研究

目的 探索提高大鼠脂肪基质细胞(ADSCs)向神经细胞定向诱导分化比例的实验方法.方法 根据所采用的不同细胞诱导分化方法分为A组(直接诱导组:以含血清及神经营养因子的Neurobasal培养基直接诱导ADSCs向神经细胞分化)和B组[神经球诱导组:先以无血清Neurobasal培养基将ADSCs诱导为神经干细胞(NSCs)球,再以含血清及营养因子的Neurobasal培养基诱导神经球干细胞向神经细胞分化].通过细胞形态学观察以及免疫细胞化学检测巢蛋白(nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)、微管相关蛋白2(MAP2ab)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达,鉴定细胞分化结果.结果 免疫细胞化学结果证实,两组细胞均有效表达nestin和β-tubulinⅢ.A组细胞在诱导6 h时nestin表达可达高峰(73.8%±6.5%),并很快下降(24 h为50.3%±3.8%,72 h为10.5%±3.0%),72 h后即检测不到;β-tubulinⅢ在诱导后24 h开始表达(33.5%±6.6%),1周达高峰(84.3%±33%).B组nestin的高表达持续整个神经球阶段,β-tubulinⅢ在神经球阶段有少量表达(成球后7 d为14.1%±3.3%),神经球细胞分化后其表达明显增加(分化后3 d为46.4%±6.1%);B组存由NSCs向神经细胞诱导一定时间后可检测到一定比例的MAP2ab阳性细胞(24.5%).结论 ADSCs在体外稳定扩增传代并在适宜诱导条件下,可以向神经细胞定向分化.应用神经球诱导法和直接诱导法均可得到较高比例的nestin及β-tubulinⅢ阳性细胞,神经球诱导组nestin表达稳定,并有一定比例MAP2ab阳性细胞出现.     

Autophagy activator promotes neuronal differentiation of adult adipose-derived stromal cells

Preliminary research from our group found altered autophagy intensity during adipose-derived stromal cell differentiation into neuronal-like cells, and that this change was associated with morphological changes in differentiated cells. This study aimed to verify the role of rapamycin, an autophagy activator, in the process of adipose-derived stromal cell differentiation into neuronal-like cells. Immunohistochemical staining showed that expression of neuron-specific enolase and neurofilament-200 were gradually upregulated in adipose-derived stromal cells after 5 mM β-mercaptoethanol induction, and the differentiation rate gradually increased with induction time. Using transmission electron microscopy, induced cells were shown to exhibit cytoplasmic autophagosomes, with bilayer membranes, and autolysosomes. After rapamycin (200 μg/L) induction for 1 hour, adipose-derived stromal cells began to extend long processes, similar to the morphology of neuronal-like cells, while untreated cells did not exhibit similar morphologies until 3 hours after induction. Moreover, the differentiation rate was significantly increased after rapamycin treatment. Compared with untreated cells, expression of LC3, an autophagy protein, was also significantly upregulated. Positive LC3 expression tended to concentrate at cell nuclei with increasing induction times. Our experimental findings indicate that autophagy can significantly increase the speed of adipose-derived stromal cell differentiation into neuronal-like cells.     

骨髓源及脂肪源干细胞向神经元样细胞诱导分化潜力的比较研究

目的 比较骨髓源基质干细胞(BMSCs)和脂肪源间充质干细胞(ADSCs)向神经元样细胞诱导分化的潜力. 方法 体外分离培养来自成年SD大鼠的BMSCs和ADSCs,传至第5代时加入表皮生长因子(EGF,10ng/mL)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,20ng/mL),诱导6 h、12 h、24h、72 h、1周、2周后,用免疫荧光染色和Westernblot检测两种细胞的神经细胞特异性标志(巢蛋白和β.微管蛋白Ⅲ)的表达,并做统计学分析. 结果 BMSCs和ADSCs经诱导后,细胞形态发生变化,均表达神经细胞特异性标志.免疫荧光染色结果显示诱导后各时间点BMSCs和ADSCsnstin阳性率或β.tubulin Ⅲ阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05),且诱导后ADSCs表达nestin阳性细胞或β.tubulinⅢ的能力在各个时间点都比诱导后BMSCs强.说明诱导后的ADSCs向神经元样细胞方向分化的能力更强.Western blot结果也与免疫荧光染色结果类似. 结论 两种不同来源的干细胞在分化成神经元样细胞方面的能力不同.ADSCs比BMSCs具有相对更强的神经元样细胞分化能力.     

大鼠脂肪基质细胞的分离培养及二步法诱导分化神经细胞

目的 研究脂肪基质细胞体外培养扩增及向神经细胞诱导分化的新方法.方法 取SD大鼠的腹膜后脂肪组织,以Ⅰ型胶原酶消化离心,含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬细胞,增殖传代,取第5代细胞进行二步法诱导分化.首先以无血清Neurobasal培养基联合应用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF) 20 ng/mL、表皮生长因子(EGF)20 ng/mL和N2(1:100)添加剂将细胞先诱导成神经球;再取第二代神经球加入1%胎牛血清、5%马血清、0.5μmol/L的维甲酸(RA)和50ng/mL脑源性神经营养因子(BDNF),促进其向神经元和胶质细胞方向分化;免疫荧光染色鉴定细胞分化结果.结果 初接种的细胞大多呈圆球状,悬浮在培养基中,24 h后贴壁.随着细胞密度加大,形态变成单层成纤维样细胞,呈漩涡状排列.无血清Neurobasal培养基诱导5～7 d可见悬浮的神经球出现;神经球迅速增殖,14d时直径可达100μm.分化后的大部分细胞呈现典型的神经元样改变,细胞体为圆形,内可见明显的细胞核,细胞伸出细长突起或网状突起,可见较多的细胞形成网络连接.免疫荧光染色鉴定结果证实,除了神经球可以高表达巢蛋白(nestin)(阳性率75.62%±1.34%)之外,分化细胞还可有效表达β-mbulinⅢ(未成熟神经元标记物,阳性率达57.62%±4.92%)或微管相关蛋白2(MAP2ab)(成熟神经元标记物,阳性率11.25%±3.87%);有少量细胞表达胶质纤维酸性蛋白(GFAF)(阳性率18.34%±3.87%)和GalC(阳性率14.35%+3.98%).结论 从成年大鼠脂肪中分离得到的脂肪基质细胞可在体外培养得到大量分化潜能稳定的子代细胞.应用本实验二步诱导法,可得到较高比例的nestin及β-mbulinⅢ阳性细胞,并有一定比例MAP2ab阳性细胞出现.     

Differentiation of human adipose-derived stem cells into neuron-like cells by Radix Angelicae Sinensis

Human adipose tissues are an ideal source of stem cells. It is important to find inducers that can safely and effectively differentiate stem cells into functional neurons for clinical use. In this study, we investigate the use of Radix Angelicae Sinensis as an inducer of neuronal differentiation. Primary human adipose-derived stem cells were obtained from adult subcutaneous fatty tissue, then pre-induced with 10% Radix Angelicae Sinensis injection for 24 hours, and incubated in serum-free Dulbecco＇s modified Eagle＇s medium/Nutrient Mixture F-12 containing 40% Radix Angelicae Sinensis to induce its differentiation into neuron-like cells. Butylated hydroxyanisole, a common in- ducer for neuronal differentiation, was used as the control. After human adipose-derived stem cells differentiated into neuron-like cells under the induction of Radix Angelicae Sinensis for 24 hours, the positive expression of neuron-specific enolase was lower than that of the butylated hydroxyani- sole-induced group, and the expression of glial fibrillary acidic protein was negative. Alter they were induced for 48 hours, the positive expression of neuron specific enolase in human adipose-derived stem cells was significantly higher than that of the butylated hydroxyanisole-induced group. Our experimental findings indicate that Radix Angelicae Sinensis can induce human adipose-derived stem cell differentiation into neuron-like cells and produce less cytotoxicity.     

脱钙骨支架与诱导培养的脂肪基质细胞复合修复兔胫骨缺损*

背景：脂肪基质细胞经诱导后具备成骨活性已被实验证实，因此，脂肪基质细胞修复骨缺损的研究已成为目前的热点，但脂肪基质细胞修复负重骨缺损修复的相关实验报道较少。 目的：通过兔脂肪基质细胞诱导培养为成骨细胞，并与牛脱钙骨复合培养，对兔胫骨骨缺损修复情况的观察，探讨脂肪基质细胞修复骨缺损的可行性。 设计、时间及地点：随机对照动物实验，于2008-01/09在天津市第三中心医院动物实验室完成。 材料：取新生小牛四肢长骨干干骺端的松质骨置于脱钙液中脱钙、脱脂、去细胞、去抗原和去蛋白等程序处理制备成脱钙骨支架。 方法：选取健康成年新西兰大白兔12只，随机选取1只提取腹腔内脂肪组织15 mL，体外分离培养脂肪基质细胞并行诱导培养证实为成骨细胞后，以1×109 L-1浓度种植于脱钙骨支架上，继续培养1周，制成组织工程骨。将12只新西兰大白兔手术制成双侧胫骨骨缺损模型，左下肢植入单纯脱钙骨作为对照组，右下肢植入组织工程骨作为实验组。 主要观察指标：X射线、CT检查观察骨缺损处骨痂形成情况，取材后行大体、组织学观察骨缺损处修复情况。 结果：大体观察及X射线显示实验组术后12周骨缺损区缺损消失，已骨性愈合，对照组术后12周骨缺损区缺损仍存在，未见完全愈合。组织学观察显示实验组术后12周可见新生骨小梁形成，对照组术后12周未见新生骨小梁形成。测量CT值行配对t检验显示实验组明显优于对照组(P < 0.05)。 结论：脂肪基质细胞经诱导培养具备成骨活性，与细胞支架复合具备修复骨缺损的能力。 关键词：脂肪基质细胞；诱导培养；脱钙骨；骨缺损