阿霉素诱导的足细胞转分化中β-catenin及TGF-β的变化及活性维生素D_3的干预作用

目的:探讨阿霉素诱导的足细胞转分化(EMT)中β-catenin及TGF-β的变化及活性维生素D3干预作用。方法:以体外培养的小鼠足细胞系为研究对象,分6组进行实验:正常组(C组)、阿霉素组(即模型组,ADR组)、低剂量活性维生素D3组(LVD组)、高剂量活性维生素D3组(HVD组)、缬沙坦组(ARB组)、缬沙坦+高剂量活性维生素D3组(AHVD组)。各实验组干预24 h、48 h时通过RT-PCR检测β-catenin、TGF-βmRNA的表达,Western Bolt检测β-catenin蛋白的表达。结果:用药物干预24 h及48 h时,与正常对照组相比,ADR组足细胞β-catenin mRNA及蛋白表达均上调(P<0.01);与ADR组相比,四个药物干预组(ARB组、LVD组、HVD组、AHVD组)β-catenin mRNA及蛋白表达均下调(P<0.05)。24 h时与正常对照组相比,ADR组TGF-βmRNA表达上调(P<0.01);与ADR组相比,四个药物干预组TGF-βmRNA表达明显下调(P<0.01)。48 h时与正常对照组相比,ADR组TGF-βmRNA表达上调(P<0.01);与ADR组相比,HVD组与AHVD组TGF-βmRNA表达明显下调(P<0.01),而LVD组及ARB组无显著下降(P>0.05)。结论:活性维生素D3通过抑制信号转导通路中β-catenin、TGF-β的表达而抑制足细胞发生EMT。     

高糖对足细胞转分化和Smad7表达的影响

目的：通过观察高糖刺激下的足细胞表达synaptopodin、desmin和Smad7的变化,探讨高糖对足细胞的损伤机制。方法：将培养的小鼠足细胞分为正常糖组、高糖组、甘露醇组。倒置显微镜下观察足细胞的形态变化,采用RT—PCR和Western印迹技术分别检测synaptopodin、desmin、Smad7mRNA和蛋白的表达。结果：高糖刺激48h后的足细胞形态发生改变,并且synaptopodin、Smad7mRNA和蛋白表达较对照组减少,desminmRNA和蛋白表达较对照组增加（P〈O．01）。结论：高糖能够诱导足细胞发生转分化,并且这一作用可能与Samd7表达减少有关。     

活性维生素D_3对高糖环境下小鼠足细胞巢蛋白表达的影响

目的:探讨活性维生素D3是否与高糖环境下小鼠足细胞巢蛋白(nestin)的表达调控有关。方法:采用体外培养永生化小鼠足细胞,将分化成熟的足细胞分为正常糖(糖5 mmol/L)组、高糖(糖25 mmol/L)组、甘露醇对照组、高糖+活性维生素D3(10-7,10-8,10-9mol/L)组,应用Western blot及RT-PCR半定量检测nestin蛋白水平及其mRNA水平的表达情况。结果:高糖+活性维生素D3组较高糖组小鼠足细胞nestin蛋白水平及其mRNA水平表达均增高(P0.05)。结论:活性维生素D3能上调高糖环境下nestin mRNA和蛋白水平的表达而发挥保护作用。     

雷公藤甲素对PAN致足细胞损伤中mTOR/p70S6K/4EBP1信号通路的影响

目的:探讨雷公藤甲素(triptolide,TP)对m TOR/p70S6K/4EBP1信号通路的影响及其保护足细胞的可能机制。方法:氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN)刺激体外培养的足细胞24 h建立模型。细胞增殖检测试剂盒(CCK-8法)检测不同浓度雷公藤作用下PAN损伤足细胞的细胞存活率。后将足细胞随机分组:(1)对照组;(2)PAN组(PAN组,PAN 50μg/ml);(3)TP组(PAN 50μg/ml+TP 10 ng/ml),予以相应刺激24 h。采用实时荧光定量PCR检测足细胞m TOR、4EBP1、p70S6K、Akt、synaptopodin mRNA表达量,western blot检测足细胞p-mTOR、p-4EBP1、p-p70S6K、p-Akt、synaptopodin蛋白表达量。结果:(1)CCK-8结果显示,PAN造成足细胞损伤时加入浓度为3、10 ng/ml雷公藤甲素浓度均使足细胞活性上升,10 ng/ml时作用最明显(均P0.05)。(2)PAN增加m TOR、4EBP1、p70S6K、Akt mRNA及蛋白的表达量,减少synaptopodin mRNA及蛋白表达水平(均P0.05)。(3)雷公藤甲素共处理细胞后,m TOR、4EBP1、p70S6K、Akt mRNA及蛋白的表达水平明显下降,而synaptopodin mRNA及蛋白表达水平明显升高(均P0.05)。结论:雷公藤甲素可能通过抑制m TOR/p70S6K/4EBP1信号通路,减轻足细胞损伤。     

雷公藤甲素抑制阿霉素肾病大鼠足细胞凋亡的机制研究

目的:观察雷公藤甲素对阿霉素肾病(ADRN)大鼠足细胞凋亡的影响并初步其可能机制。方法:将45只Wistar大鼠随机分为对照组(N)、模型组(ADR)及治疗组(T)。其中ADR组和T组给予一次性尾静脉注射阿霉素6.5 mg/kg构建ADRN模型大鼠,T组给予雷公藤甲素(200μg·kg~(-1)·d~(-1))干预8周。于2、4、6、8周分别检测24 h尿蛋白定量,观察各组大鼠的生化指标及肾组织学改变,TUNEL法测足细胞凋亡,WT-1免疫组织化学染色检测肾小球足细胞数,RT-PCR检测Synaptopodin、p53、Notch1 mRNA表达变化,western印迹测定Synaptopodin、Notch1、Hes1的蛋白表达。结果:(1)ADR组各时间点24 h尿蛋白定量、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)胱抑素C(Cys C)均高于N组,而足细胞计数显著降低,肾小球系膜区增宽,且系膜细胞增生,T组Scr、Cys C低于ADR组(P0.05),足细胞数明显增加(P0.05),同时病理改变较其减轻。(2)8周末时ADR组Synaptopodin mRNA和蛋白表达降低,p53 mRNA表达升高,足细胞体积肿胀增大,凋亡足细胞数目比N组明显增多(P0.05);与ADR组相比,T组Synaptopodin mRNA和蛋白表达增加,p53 mRNA表达下降,凋亡足细胞数目较ADR组明显减少(P0.05)。(3)ADR组Notch1 mRNA和蛋白的表达以及Hes1蛋白的表达均高于N组(P0.05),T组Notch1mRNA和蛋白的表达及Hes 1蛋白的表达低于ADR组(P0.05)。结论:雷公藤甲素可抑制ADRN的足细胞凋亡,其保护足细胞的作用可能与降低Notch信号通路的表达有关。     

高糖刺激对体外培养小鼠足细胞snail表达和转分化的影响

目的：研究高糖刺激对体外培养的小鼠足细胞snail表达及上皮细胞-间充质细胞转分化的影响.方法：以体外培养的小鼠永生化足细胞为研究对象,将其分为正常糖组、高糖刺激组、甘露醇对照组,培养时间为48 h.倒置显微镜下观察各组足细胞形态,采用荧光定量PCR法检测各组足细胞snail、synaptopodin、α-平滑肌肌动蛋（α-SMA）mRNA的表达,采用免疫细胞化学和western blot检测各组足细胞snail、synaptopodin、α-SMA蛋白的表达量.结果：正常状态下足细胞呈树枝分叉状,几乎不表达snail,高糖刺激48 h后足细胞形态发生明显改变,并且snail、α-SMA mRNA和蛋白表达量较对照组明显上调,synaptopodin表达较对照组减少（P＜0.05）.结论：高糖刺激可诱导足细胞snail的表达和转分化的过程,这可能参与了糖尿病肾病的发生、发展过程.     

温阳活血利水法对足细胞骨架及相关蛋白影响

目的:观察温阳活血利水方含药血清对嘌呤霉素损伤小鼠永生系足细胞组织蛋白酶L(cathepsin L,Cat L)的转录因子Dendrin、膜相关鸟苷酸激酶转化蛋白2(membrane-associated guanylate kinase inverted2,MAGI-2)、下游底物synaptopodin、Rho A mRNA与蛋白表达变化以及足细胞骨架蛋白actin、中间丝分布情况的影响,探讨温阳活血利水方的作用改善肾病综合征蛋白尿及足突融合的机制。方法:体外培养小鼠足细胞,采用嘌呤霉素45 mg/L、中药含药血清或地塞米松与足细胞孵育12 h,荧光定量PCR检测Cat L、synaptopodinmRNA表达变化; western blotting测定MAGI-2、synaptopodin、Cat L、Rho A的蛋白表达;细胞免疫荧光观察Dendrin的分布以及细胞骨架蛋白微丝和中间丝的荧光分布变化。结果:嘌呤霉素作用足细胞12 h后,Dendrin转核比例增多(与正常组对比P 0. 01),MAGI-2、Rho A、synaptopodin蛋白的表达显著性下降(与正常组对比,均P 0. 01),Cat L mRNA与蛋白的表达显著性升高(与正常组对比,均P 0. 01),synaptopodin mRNA表达没有变化(与模型组比较P 0. 05),足细胞伪突回缩变短,中间丝和微丝结构紊乱,杂乱无章排列,结构不清晰。地塞米松、10%与20%含药血清干预后Cat L mRNA与蛋白表达减少,MAGI-2、Rho A、synaptopodin蛋白的表达有所增多,Dendrin转核比例减少(与模型组对比,均P 0. 01),均改善了足细胞骨架结构。结论:温阳活血利水方能减少足细胞受损后Dendrin核内转移,降低胞质cat L水平,从而减少synaptopodin降解,使Rho A表达增加,改善微丝(F-actin)和中间丝的重构,稳定细胞骨架结构,减少足突融合,从而减少蛋白尿。     

通络益肾方不同给药时期对DN大鼠足细胞损伤的影响

目的:观察通络益肾方对糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞超微结构及骨架蛋白表达的影响。方法:60只SD大鼠随机抽取10只为假手术组,余大鼠采用右肾切除+腹腔注射链脲佐菌素制备DN模型。成模后的大鼠随机分为DN模型组(模型组),缬沙坦治疗组(西药组),通络益肾方早期给药组(中药早期组)、6周给药组(中期给药组)、8周给药组(晚期给药组)。每组10只。西药组予缬沙坦7.2 mg/kg灌胃,中药组予通络益肾方水煎液13.6 g/kg灌胃。中药早期组在造模成功后即予中药灌胃,中药中期和晚期组分别在造模成功后第6周、第8周开始中药灌胃。假手术组及模型组予蒸馏水灌胃。每日1次,共6周。检测大鼠24 h尿蛋白定量(24 h PRO)、尿白蛋白、肾功能;透射电镜观察足细胞超微结构,免疫组化法检测α-actintin-4、synaptopodin、F-actin表达,RT-PCR检测Nephrin、CD_2AP、α-actinin-4、synaptopodin、F-actin mRNA的表达。结果:(1)与假手术组比较,模型组24 h PRO、尿白蛋白、血尿素氮、血肌酐均明显升高(P0.01)。与模型组比较,西药组、中药早期组、中药中期组上述指标均明显下降(P0.01);与中药早期组比较,中药中期和晚期组各检测指标均不同程度升高(P0.01,P0.05);(2)足细胞超微结构的变化:模型组足细胞结构不清、数目减少、密度降低,骨架纤维排列紊乱;西药组及中药各治疗组足细胞病变减轻,足细胞较为完整,足突排列相对整齐,细胞骨架纤维排列相对整齐,足突融合减轻;中药早期组优于中药中期组和中药晚期组;(3)免疫组化结果显示:与假手术组比较,模型组α-actintin-4、synaptopodin、Factin表达显著下降(P0.01)。与模型组比较,西药组、中药早期组、中期组上述指标均明显升高(P0.01,P0.05),中药晚期组差异无统计学意义(P0.05);(4)与假手术组比较,模型组Nephrin、CD2AP、α-actinin-4、synaptopodin、F-actin mRNA表达均明显下降(P0.01)。与模型组比较,西药组及中药早期、中期组的各基因表达均显著升高(P0.01,P0.05),中药晚期组synaptopodin和F-actin表达差异无统计学意义(P0.05)。结论:通络益肾方可通过上调DN大鼠足细胞裂孔隔膜蛋白及骨架蛋白的表达而发挥其保护足细胞,抑制DN进展的作用,且给药时间越早,持续时间越长,效果愈显著。     

TRPC6在糖尿病肾脏疾病大鼠肾组织的表达及缬沙坦的作用

目的观察瞬时受体阳离子通道6（transientreceptorpotentialcationchannel6,TRPC6）在糖尿病肾脏疾病（diabetickidneydisease,DKD）鼠肾组织的表达及缬沙坦的作用。方法通过单肾切除联合链脲佐菌素（streptozotocin,sTZ）诱导的DKD模型随机分为糖尿病组（diabetesmellitus,DM）和缬沙坦治疗组,每组10只。另以10只大鼠作对照组（normalcontrol,NC）。缬沙坦组每天给予缬沙坦20mg／kg于饮水中,于8周、16周、24周检测不同时间点24h尿蛋白、血肌酐和血糖。24周处死动物,PAS染色和透射电镜观察肾组织学改变,激光共聚焦检测TRPC6、synaptopodin的表达和分布,免疫组化、RT-PCR检测nephrin、TRPC6mRNA和蛋白的表达。结果与NC组比较,DM组24h尿蛋白、肾质量／体质量指数、TRPC6的表达均显著高于NC组（P〈O．01）,而内生肌酐清除率（endogenouscreatinineclearancerate,Ccr）、nephrin的表达显著低于NC组（P〈0．01）。激光共聚焦显示TRPC6与足细胞标志蛋白synaptopodin高度融合,沿毛细血管袢线形分布。缬沙坦组24h尿蛋白、肾质量／体质量、TRPC6的表达较DM组显著降低,Ccr、nephrin免疫组化积分和mR-NA的表达显著增加,肾脏病理改变减轻。结论DKD大鼠足细胞TRPC6的表达显著升高,缬沙坦可能通过抑制TRPC6的表达来减轻足细胞的损伤。     

缬沙坦联合苯那普利对糖尿病大鼠足细胞损伤的影响及肾脏保护机制的研究

目的：研究缬沙坦联合苯那普利对糖尿病大鼠足细胞损伤的影响及肾脏保护机制的作用。方法：将SD大鼠随机分为正常对照组（A组），糖尿病对照组（B组），糖尿病苯那普利治疗组（C组），糖尿病缬沙坦治疗组（D组），缬沙坦联合苯那普利（E组）。分别于实验第4、6周末各组随机取8只测定大鼠平均动脉压、血糖、血肌酐、尿肌酐、肾重／体重、尿白蛋白排泄率，对肾脏标本进行光镜、电镜观察，用图像分析仪测量各组大鼠的平均肾小球横截面积、平均肾小球体积，并于6周末用逆转录-PCR（RT-PCR）方法检测各组肾皮质TGF-β1 mRNA表达。采用免疫组织化学染色检查足细胞特异标记物nephrin、desmin，对足细胞进行准确的定位及其密度定量观察，同时结合临床和肾组织病理有关指标进行分析。结果：苯那普利、缬沙坦、缬沙坦联合苯那普利治疗均使Ccr、肾重／体重、尿白蛋白排泄率、TGF-β1mRNA表达降低，而缬沙坦联合苯那普利组对TGF-β1mRNA抑制程度最大，同时肾脏病理变化亦最轻。B组、E组均伴肾小球足细胞数目及密度的减少，其中以B组最为显著，C组、D组次之，E最轻。足细胞数目及其密度与尿蛋白量呈显著负相关（P〈0．01）。nephrin、desmin在A组沿肾小球基底膜呈连续、线形分布。C组、D组、E组nephrin、desmin的表达量降低，与正常组织比较，无统计学意义，B组nephrin、desmin的表达呈点状、短线条状，与正常组织比较，有统计学意义（P〈0．05）。糖尿病大鼠足细胞数目的减少还与肾小球病理改变相关，足细胞融合、微绒毛化改变较多，肾小球硬化数明显增多。结论：糖尿病大鼠表现出肾小球足细胞数目及其密度的减少，肾小球足细胞中nephrin、desmin的表达和分布的减少，足细胞病变不仅导致大量白蛋白尿的发生，而且还与肾小球硬化和肾功?     

帕立骨化醇对糖尿病肾病大鼠蛋白尿的影响

目的 研究维生素D类似物帕立骨化醇对糖尿病肾病(DN)大鼠蛋白尿的影响,并探讨其可能机制.方法 用链脲菌素(STZ)腹腔注射法构建DN大鼠动物模型,将造模成功的大鼠随机分为帕立骨化醇组(P组)、DN组(D组),并设置健康对照组(N组).给药12周后检测24 h尿蛋白量及血生化指标.用ELISA法检测肾组织肾素和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平.免疫组化和实时PCR检测肾小球基底膜乙酰肝素酶(HPA)、足细胞podocin蛋白及mRNA的表达.结果 D组和P组24h尿蛋白量、Scr、肾素及AngⅡ水平均显著高于N组,而D组显著高于P组,差异均有统计学意义(均P＜ 0.05).D组和P组HPA蛋白及mRNA表达均显著高于N组,而D组显著高于P组；D组和P组podocin蛋白及mRNA表达较低,D组显著低于P组,差异均有统计学意义(均P＜ 0.05).肾素水平与HPA蛋白表达呈正相关(r=0.78,P＜0.05)；与podocin蛋白表达呈负相关(r=-0.63,P＜0.05)；而与两者mRNA表达无相关.结论 帕立骨化醇可显著减少DN大鼠早期蛋白尿,其机制可能与通过抑制肾组织肾素表达,下调肾小球基底膜HPA,上调足细胞podocin蛋白表达有关.     

KLF4通过mTOR/P70S6K途径激活细胞自噬减轻高糖诱导的足细胞损伤

目的:分析Krüppel样转录因子4(KLF4)对高糖诱导的足细胞损伤的影响及相关分子机制。方法:体外培养MPC5细胞,将MPC5细胞分为对照组(Control组)、高糖组(HG组)、高糖+空载质粒对照组(HG+NC组)、高糖+KLF4过表达组(HG+KLF4组)。采用qRT-PCR法检测细胞中KLF4 mRNA表达水平,CCK-8法测定细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中相关蛋白表达水平。结果:与Control组比较,HG组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量降低,细胞增殖活性降低,细胞凋亡率升高,细胞中突触足蛋白(synaptopodin)、足蛋白(podocin)、肾蛋白(nephrin)、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin1蛋白表达量降低,P62蛋白表达量、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)/mTOR和磷酸化核糖体40S小亚基S6蛋白激酶(p-P70S6K)/P70S6K比值升高;差异均有统计学意义(P<0.05)。与HG组比较,HG+KLF4组MPC5细胞中KLF4 mRNA和蛋白表达量升高,细胞增...     

EGCG对高糖环境下小鼠足细胞增殖和P21^Cip1、P27^Kip1表达的影响

目的：研究作为绿茶主要活性成分的EGCG对高糖环境下足细胞增殖和周期素激酶抑制剂P21^Cip1和P27^Kip1表达的影响,从而探讨其作用机制。方法：以高糖（25mmol/L）培养的小鼠足细胞为研究对象,维生素E为对照,以不同浓度EGCG（0.2,10,100μmol/L）培养24h、48h、72h,首先以相差显微镜观察足细胞形态改变;其次,以BrduELISA法检测细胞增殖;流式细胞仪分析足细胞G1/G0、S期、G2/M期百分比;RT-PCR检测细胞周期依赖型蛋白激酶抑制剂P21^Cip1mRNA和P27^Kip1mRNA表达。结果：（1）相差显微镜下观察,高糖刺激后24h,部分足细胞脱落,呈不规则形态。（2）BrduELISA法以正常糖为对照,高糖刺激24h后,足细胞增殖无统计学差异,48h和72h后足细胞增殖减少,有统计学差异（P〈0.05）;以高糖组为对照,高糖刺激24h,维生素E组和维生素E＋EGCG协同作用组促进足细胞增殖有统计学差异（P〈0.05）,EGCG（0.2,10,100μmol/L）作用组无统计学意义;48h实验结果和24h相同;72hEGCG（100μmol/L）维生素E组和维生素E＋EGCG协同作用组促进足细胞增殖作用有统计学差异（P〈0.01）。（3）不同浓度EGCG对高糖刺激后足细胞周期G1/G0期、S期、G2/M期百分比无统计学差异（P〉0.05）。（4）RT-PCR高糖刺激后24h,足细胞P21^Cip1mRNA表达有上升,但无统计学意义（P〉0.05）;随EGCG浓度增加,以维生素E为对照,P21^Cip1mRNA表达无统计学差异（P〉0.05）。正常糖组为对照,高糖刺激后24h足细胞P27^Kip1mRNA表达上调,有统计学差异（P〈0.01）,随EGCG浓度增加,P27^Kip1mRNA表达无统计学差异（P〉0.05）。结论：EGCG（100μmol/L）作用72h促进高糖环境下足细胞增殖,对细胞周期作用不明显,高糖刺激后24h足细胞P27^Kip1mRNA表达上调,EGCG对足细胞细胞周期依赖型蛋白激酶抑制P21^Cip1mRNA和P27^Kip1表达无明显影响,提示EGCG促高糖环境下足细胞增殖作用可能还存在其他机制。     

地塞米松通过稳定podocin的表达和分布抑制嘌呤霉素对小鼠肾小球足细胞的损伤

目的 观察嘌呤霉素（PAN)和地塞米松（DEX）对足细胞分子podocin表达和分布的影响,探讨DEX改善蛋白尿的机制。 方法 体外培养小鼠足细胞（MPC5）,分为对照组、PAN组和DEX组。对照组用含0.02% DMSO的RPMI-1640培养液培养;PAN组加入PAN;DEX组同时加入PAN和DEX。处理后8 h、24 h和48 h,观察细胞形态并摄像,用图像处理软件分析各组细胞形态及胞体面积的差异。用RT-PCR、Western印迹和间接免疫荧光染色检测各时间点podocin mRNA和蛋白的表达及分布。 结果 正常足细胞呈星形,胞体大并有树样突起,细胞相互连接。PAN刺激8 h,足细胞胞体面积缩小,为对照组的43%;24 h为10%;48 h为5.7%（P < 0.01）;部分足细胞足突及细胞连接消失。DEX组在8 h、24 h和48 h,足细胞胞体面积显著大于PAN组,分别为对照组的43.9%、26.2%及29.6%（P < 0.05）, 足突形态正常。PAN组podocin mRNA表达量呈下降趋势,蛋白表达量显著降低（P < 0.01）,分布异常。DEX组podocin mRNA和蛋白的表达量及分布与对照组相似,48 h时mRNA和蛋白的表达量均显著高于PAN组（P < 0.05）。 结论 DEX直接作用于足细胞,稳定podocin mRNA和蛋白的表达量及分布,该作用可能与其能保护足细胞及改善蛋白尿有关。     

陈氏益气活血化湿方通过调控足细胞自噬减轻PAN诱导的足细胞损伤

目的:本研究旨在观察陈氏益气活血化湿方水溶剂对氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN)诱导足细胞损伤的保护作用,并探讨这一作用与足细胞自噬(autophagy)的关系。方法:体外培养永生化小鼠足细胞系作为研究对象,采用细胞增殖检测试剂盒(CCK-8法)、western bloting法检测不同浓度PAN对足细胞的存活率的影响,建立PAN诱导的足细胞损伤模型。后将足细胞分为:正常组、PAN组、PAN+中药低剂量组、PAN+中药高剂量组,采用western bloting法检测足细胞p-mTOR、mTOR、LC3、synaptopodin蛋白的表达情况。结果:(1) CCK-8、western bloting检测结果显示50μg/ml浓度时P-mTOR表达最明显(P 0. 001),确定为造模浓度;(2) PAN造成足细胞p-mTOR表达升高,LC3II、synaptopodin蛋白表达降低(P 0. 05),mTOR磷酸化水平升高,足细胞自噬功能受到抑制,足细胞骨架蛋白表达降低(P 0. 01),足细胞受损;(3)陈氏益气活血化湿方水溶剂处理细胞后p-mTOR表达降低,LC3II、synaptopodin蛋白表达升高(P 0. 05),且高剂量组效果优于低剂量组。结论:陈氏益气活血化湿方水溶剂可能是通过上调足细胞自噬功能,发挥足细胞保护作用。     

雷公藤内酯醇干预高糖影响小鼠肾脏足细胞Nephrin蛋白表达的研究

目的：通过观察雷公藤内酯醇（triptolide,TP）及对照药物缬沙坦（valsartan,Val）干预高糖环境培养的足细胞肾小球足细胞裂孔隔膜（GPSD）核心蛋白nephrin的表达,来深入探讨雷公藤治疗糖尿病肾病（DN）蛋白尿的分子生物学机制。方法：（1）将培养成熟的足细胞分为对照组1、对照组2、模型组、雷公藤内酯醇干预组及缬沙坦干预组（干预组均设低、中、高3个剂量）,培养24h后以RT-PCR法检测各组足细胞nephrin mRNA的表达。（2）将培养成熟的足细胞设为对照组、模型组、雷公藤内酯醇干预组及缬沙坦干预组,培养24h后行间接免疫荧光法检测nephrin蛋白的表达。结果：（1）与模型组相比,不同剂量TP和Val组均能提高nephrin mRNA表达（P〈0.05）,并且中剂量TP组和高剂量Val组效果最好（P〈0.05）。（2）与对照组相比,间接免疫荧光法可见模型组nephrin表达下降。经TP和Val干预24h后,TP和Val组足细胞nephrin蛋白的表达均有一定程度提高。结论：雷公藤内酯醇和缬沙坦均能上调高糖诱导的足细胞nephrin的表达下降,这可能是雷公藤及缬沙坦在临床上有效治疗DN蛋白尿的机制之一。     

尿足细胞及其相关分子在肾小球疾病中的表达

目的：探讨尿液检测局灶节段性肾小球硬化足细胞损伤与其他足细胞病之间的特点和差异。方法：入选原发性局灶节段性肾小球硬化（KSGS）患者54例,膜性肾病（MN）23例及微小病变（MCD）12例,正常对照20例。免疫荧光法计数尿足细胞,荧光实时定量PCR法定量尿沉渣足细胞相关分子nephrin、podocin、synaptopodin mRNA的表达水平,Western印迹法检测尿液WilmsTumor1（WT1）蛋白水平,免疫荧光法检测肾脏组织podocalyxin的表达及分布。结果：（1）FSGS组、MN组、MCD组和对照组尿足细胞阳性率分别是63％、34．8％、33．3％和0,FSGS组与其余各组相比差异均有统计学意义（P〈0．05）。FSGS组足细胞脱落数目显著高于MCD组、MN组和对照组（P〈0．05）,伴足细胞尿FSGS患者与不伴足细胞尿FS—GS患者相比,24h尿蛋白和血清白蛋白（Alb）差异均有统计学意义（P〈0．05）。（2）FSGS组尿沉渣足细胞nephrin mRNA表达水平显著高于MCD和MN组（P〈0．05）;FSGS组尿沉渣足细胞podocinmRNA表达显著高于MCD组（P〈0．05）,与MN组相比有升高趋势但差异无统计学意义;尿沉渣足细胞synaptopodin mRNA表达各组间差异无统计学意义。尿沉渣足细胞nephrin、podocin．synaptopodin mRNA的表达与24h蛋白尿无相关性。（3）FSGS组尿WT1蛋白量显著高于MCD和MN组。部分足细胞阴性患者尿液检测到WT1分子。（4）FSC-S患者肾组织podocalyxin较对照组、MCD和MN有明显的节段缺失。结论：局灶节段性肾小球硬化病患者足细胞损伤严重,尿足细胞与FSGS疾病活动相关。尿沉渣足细胞nephrin mRNA表达可以把FSGS与MCD和MN区分开来,尿WT1蛋白可能是足细胞早期损伤指标。     

法舒地尔对血管紧张素Ⅱ诱导足细胞骨架重构的干预作用

目的 观察ROCK抑制剂法舒地尔对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导小鼠足细胞骨架重构的影响,探讨法舒地尔在足细胞病变中的保护机制.方法 体外采用AngⅡ(]0-7 mol/L)致足细胞损伤模型.不同浓度法舒地尔(10-8、10-7、10-6mol/L)与足细胞预孵育30 min或60 min后,再加入含AngⅡ(10-7 mol/L)的培养基,继续作用24 h.异硫氰酸荧光素(FITC)-鬼笔环肽荧光染色和Western印迹法分析足细胞骨架相关蛋白F-actin和synaptopodin 的变化,并进一步观察细胞内调节骨架装配的Rho-ROCK信号通路的活性,即采用Western印迹法检测Rho激酶1(ROCK-1)及磷酸化肌球蛋白磷酸酯酶靶点亚单位1(MYPT1)表达,代表ROCK的表达及活性.结果 与对照组相比,AngⅡ可明显降低足细胞synaptopodin的表达(P＜0.05),使F-actin重构,而法舒地尔预处理可减轻AngⅡ介导的synaptopodin的下调(P＜0.05)和F-actin的重构.法舒地尔可下调AngⅡ诱导的足细胞ROCK-1 (P＜ 0.05)及MYPT1蛋白表达(P＜0.05).结论 法舒地尔可稳定足细胞的细胞骨架,拮抗AngⅡ对足细胞的损伤.法舒地尔的上述作用可能与细胞内Rho-ROCK信号通路有关.     

厄贝沙坦对高糖诱导的小鼠足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6表达的影响

目的研究血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(angiotensinⅡreceptor blockers,ARB)厄贝沙坦对高糖诱导的条件永生化小鼠足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6(transient receptor potential cation channel,TRPC6)表达的影响。方法首先体外培养条件永生化小鼠足细胞,分为高渗对照组(甘露醇30 mmol/L+葡萄糖5 mmol/L),正常对照组(葡萄糖5 mmol/L)、实验组(葡萄糖浓度分别为15 mmol/L、25 mmol/L和35 mmol/L),免疫细胞化学检测小鼠足细胞TRPC6分布,Western Blot和RT-PCR分别检测小鼠足细胞TRPC6蛋白和mRNA的表达;其次使用高糖(25 mmol/L)在不同时间点(0 h,12 h,24 h,48 h)作用于足细胞,Western Blot和RT-PCR分别检测小鼠足细胞TRPC6蛋白和mRNA的表达;最后将细胞分为5组:正常对照组、高糖组、高糖+厄贝沙坦组(10~(-7)mol/L)、高糖+厄贝沙坦组(10~(-6)mol/L)、高糖+厄贝沙坦组(10~(-5)mol/L),倒置显微镜下观察不同浓度厄贝沙坦对高糖诱导的足细胞形态学变化,Western Blot和RT-PCR分别检测小鼠足细胞TRPC6蛋白和mRNA的表达。结果①免疫细胞化学检测可见,随着葡萄糖浓度的增加,TRPC6主要集中表达于足细胞胞膜,沿足突分布更加明显;Western Blot和RT-PCR检测到TRPC6蛋白和mRNA表达量逐渐增加,以25 mmol/L变化最明显。②高糖刺激足细胞后,与0h比较,随着刺激时间的延长,足细胞TRPC6蛋白和mRNA表达量明显增加(P0.05),在48 h达到高峰,呈一定的时间依赖性。③与正常对照组比较,高糖诱导的TRPC6表达明显增高(P0.05)。与高糖组比较,高糖+厄贝沙坦组随厄贝沙坦浓度的增加,TRPC6蛋白和mRNA表达量明显下调(P0.05),呈浓度依赖性。结论高糖可诱导足细胞TRPC6表达增加,厄贝沙坦对高糖诱导的足细胞损伤具有保护作用,其机制可能是通过下调足细胞TRPC6的表达来实现的。     

甘西鼠尾草总酚酸提取物对嘌呤霉素氨基核苷诱导损伤的足细胞中Toll样受体4表达的影响

目的:探讨SPE及其单体对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的损伤足细胞中Toll样受体4(TLR4)通路表达的影响。方法:足细胞与含有甘西鼠尾草总酚酸提取物(SPE)、迷迭香酸(RA)、丹酚酸B(SalB)、RA+SalB混合及他克莫司的完全培养液预先孵育30 min,再加入PAN(100μg/ml)继续作用24 h,观察足细胞骨架结构F-actin变化,western blot及半定量RT-PCR检测足细胞中TLR4、myd88、phosphor-NF-κB(pp65)在蛋白及mRNA水平的表达量变化。结果:(1)PAN作用24 h后,足细胞骨架蛋白F-actin明显损伤,微丝解聚、胞体回缩,少数细胞尚存排列紊乱的丝状结构,而提前给予保护药物SPE、SalB、RA、SalB+RA混合药物及他克莫司组的足细胞损伤明显减弱。(2)western blot数据显示,PAN诱导的损伤足细胞中TLR4、myd88及pp65蛋白的表达与正常组相比均有明显上调(P0.05);保护药物组:TLR4蛋白表达较模型组有明显下降(P0.05);My D88蛋白表达除SalB高剂量组及SalB+RA低剂量组较模型组无显著下降外,其余均能明显下调其表达量(P0.05);pp65在保护药物组中的表达均较模型对照组低(P0.05)。(3)半定量RT-PCR结果显示,模型对照组中TLR4、My D88及NF-κB的mRNA表达量明显高于正常对照组;保护药物组中:TLR4 mRNA表达量在各药物处理组中均明显低于PAN组(P0.05),其中的SPE高、低剂量组,RA高、低剂量组,SalB+RA高剂量组与正常组相接近(P0.05);My D88 mRNA表达量在SPE及其单体处理后均有明显下调(P0.05);NF-κB mRNA表达量除SalB高剂量组中无明显下调外(P0.05),其余各保护药物组均下调(P0.05)。结论:SPE及其活性单体对PAN诱导损伤足细胞的保护作用机制可能部分通过抑制TLR4信号相关蛋白表达来实现;甘西鼠尾草总酚酸提取物中的单体迷迭香酸对TLR4及其下游信号分子My D88、NF-κB的抑制作用优于丹酚酸B和混合给药组。