ERK1/2在曲普瑞林逆转卵巢癌OVCAR-3细胞顺铂耐药中的作用

目的:研究曲普瑞林在抑制卵巢癌OVCAR3细胞增殖的同时可否逆转顺铂耐药,并探讨MAP-ERK1/2在其中的变化及调节机制。方法:筛选建立耐顺铂的亚细胞系OVCAR3-DDP;采用MTT、流式细胞术及Western blot比较不同浓度下顺铂、曲普瑞林及两药联合对耐药卵巢癌OVCAR3-DDP细胞生长的影响,测定ERK1/2蛋白的表达。结果:卵巢癌OVCAR3-DDP细胞耐药指数为3.87;顺铂与曲普瑞林联合化疗增敏倍数为2.23;ERK1/2蛋白活性在顺铂处理组升高,在曲普瑞林处理组、顺铂与曲普瑞林联合处理组降低。结论:曲普瑞林增加了卵巢癌OVCAR3-DDP细胞对顺铂的敏感性,此作用可能与细胞内ERK1/2信号转导通路有关。     

促性腺激素释放激素类似物对耐药卵巢癌细胞血管形成的抑制作用

目的:研究促性腺激素释放激素(GnRH)类似物曲普瑞林(triptorelin)联合顺铂(c DDP)对卵巢癌顺铂耐药细胞血管生成的抑制效果,并探讨其作用机制。方法:体外筛建卵巢癌OVCAR-3细胞系的顺铂耐药模型OVCAR-3/c DDP,并建立其裸鼠皮下荷瘤模型。实验分为对照组(NS组)、曲普瑞林组、顺铂组、曲普瑞林+顺铂组。采用实时定量PCR(real-time PCR)和Western blot法分别检测VEGF mRNA和蛋白表达。采用鸡胚尿囊膜实验(CAM)检测用药后对荷瘤组织血管生成的影响。结果:曲普瑞林+顺铂组的VEGF mRNA和蛋白表达显著低于曲普瑞林组、顺铂组及NS组(P0.05)。鸡胚尿囊膜实验结果显示,曲普瑞林和顺铂单独用药均能抑制耐药荷瘤组织的血管形成,抑制率分别为20.76%和16.66%;两药联合作用后抑制作用更显著,抑制率达36.50%。结论:GnRH类似物曲普瑞林联合顺铂可明显抑制顺铂耐药卵巢癌细胞的血管生成,其机制可能与下调VEGF表达有关。     

小干扰RNA抑制多药耐药基因表达并逆转耐药

目的探讨小干扰RNA（small interference RNA，siRNA）影响卵巢癌耐药细胞株MDRl基因的表达并逆转其多药耐药的功能。方法2004年10月至2005年6月于山东省立医院中心实验室采用浓度梯度诱导法建立人卵巢癌阿霉素耐药细胞株OVCAR／AR。根据MDRl基因的编码区域设计了2个含19个碱基的MDR1基因特异性siRNA，脂质体介导下转染OVCAR／AR细胞。RT—PCR分析MDR1 mRNA的表达；流式细胞术（FCM）检测P-糖蛋白（P-gp）的表达；MTT法检测OVCAR／AR细胞的多药耐药性。结果MDR1特异性siRNA转染后，OVCAR／AR细胞MDR1 mRNA和P-gp的表达减少，分别以转染后48h和72h下降最著；转染mdr1a和mdr1b siRNA可不同程度地逆转OVCAR／AR细胞对阿霉素、泰素的耐药性，但对非P-gp介导耐药的顺铂无影响。结论阿霉素所致的卵巢癌细胞多药耐药与MDR1基因过度表达有关，体外实验中应用MDR1特异性siRNA能部分逆转OVCAR／AR细胞的多药耐药。     

人卵巢癌细胞系A2780及顺铂耐药系蛋白质双向电泳图谱的差异分析

近年来，生命科学研究领域的热点，蛋白质组学理论和技术的迅速发展和完善，可望从组织或细胞蛋白质整体水平这一全新角度，探讨卵巢癌顺铂耐药的机理。本研究应用固相pH梯度双向凝胶电泳技术，分离人卵巢癌细胞系A2780及顺铂(DDP)耐药系(A2780-DDP)的总蛋白，建立双向凝胶电泳(2-DE)图谱，再应用基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术，及数据库鉴定部分差异蛋白质，希望发现与顺铂耐药有关的特异性蛋白质。     

siRNA LSINCT5联合顺铂对卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨沉默LSINCT5联合顺铂对人卵巢癌SKOV3细胞增殖及凋亡的影响。方法:选取SKOV3细胞株,采用小干扰技术将LSINCT5基因片段转入卵巢癌SKOV3细胞中,同时联合顺铂作用于卵巢癌细胞。按不同处理因素将SKOV3细胞分为5组:对照组、NC-siRNA组、顺铂组、LSINCT5-siRNA+顺铂组和LSINCT5-siRNA组。CCK-8检测转染后SKOV3细胞对顺铂的敏感性。显微镜下观察细胞的生长状况及形态变化。Western blot和RT-PCR法分别检测与凋亡相关的Caspase 3蛋白和基因表达水平。结果:CCK-8显示,3μg/ml顺铂作用于卵巢癌细胞的抑制率较为适中,故作为后续实验的处理浓度。沉默LSINCT5能显著提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。LSINCT5-siRNA+顺铂组中Caspase 3蛋白和mRNA相对表达量均明显高于其他各组(P0.05)。结论:沉默LSINCT5提高了卵巢癌细胞对顺铂的敏感性。沉默LSINCT5联合顺铂能明显抑制卵巢癌细胞的增殖,促进卵巢癌细胞凋亡。     

铁死亡激活剂Erastin通过活化凋亡增强卵巢癌细胞顺铂敏感性的研究

目的:探讨铁死亡激活剂Erastin对人上皮性卵巢癌细胞顺铂(DDP)敏感性的影响及其机制。方法:CCK-8法检测上皮性卵巢癌细胞株HEY、SKOV3、OVCAR3、ES2对Erastin的敏感性,选择Erastin不敏感的细胞株,CCK-8法测定联合Erastin前后顺铂半数抑制浓度(IC_(50)),流式细胞学检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白caspase 3的表达情况。结果:人上皮性卵巢癌HEY、SKOV3、OVCAR3、ES2细胞株中,HEY、SKOV3细胞株对Erastin引起的细胞死亡较不敏感。在联合Erastin后,细胞顺铂的IC_(50)值显著降低(P0.05)。流式结果提示Erastin可以增加顺铂诱导的HEY、SKOV3凋亡细胞数,Western blot结果显示促凋亡蛋白cleaved-caspase 3表达升高。结论:铁死亡激活剂Erastin可能通过活化凋亡通路进而提高HEY、SKOV3细胞对顺铂的敏感性。铁死亡激活剂可为改善临床EOC铂类耐药提供全新的思路。     

β-连环素对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响

目的:探讨信号分子β连环素(β-catenin)在多个卵巢癌耐药细胞系中的表达及其对顺铂耐药性的影响。方法:首先在2个卵巢癌耐药细胞系(C13K,SKOV-3),2个卵巢癌敏感细胞系(OV2008,A2780),A2780顺铂敏感株、A2780-cis顺铂耐药株,COC10顺铂敏感株、COC1-cis顺铂耐药株中检测β-catenin蛋白的水平。通过小干扰RNA(si RNA)介导的RNA干扰技术靶向沉默细胞中β-catenin的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)和蛋白质印迹法(Western blotting)验证β-catenin基因沉默效果。台盼蓝染色方法分析β-catenin基因沉默对细胞化疗药物顺铂敏感性的影响,流式细胞术检测顺铂处理后β-catenin基因沉默细胞的凋亡率。Western blotting筛选多个凋亡相关信号分子的改变。结果:β-catenin在2个卵巢癌耐药细胞系C13K,SKOV-3中蛋白水平较敏感细胞系明显上调。与亲本A2780和COC10细胞相比,在耐药株A2780-cis和COC1-cis中表达水平也明显增高。β-catenin si RNA能显著抑制细胞中β-catenin蛋白的水平。β-catenin基因沉默后,卵巢癌耐药细胞C13K,SKOV-3对顺铂敏感性显著增高;流式细胞术进一步分析发现β-catenin基因沉默可以促进顺铂介导的卵巢癌耐药细胞的细胞凋亡。Western blotting发现β-catenin基因沉默后,顺铂处理可以显著上调促凋亡分子p53和caspase-3蛋白水平。结论:β-catenin在卵巢癌耐药细胞系表达明显增高,β-catenin沉默可以促进卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性,并同时促进了顺铂介导的细胞凋亡。     

卵巢癌细胞对顺铂耐药及其逆转的实验研究

目的：探明卵巢癌对顺铂耐药的发生机理，并筛选出逆转其耐药性的有效调节剂。方法：建立对顺铂耐药的人卵巢癌细胞系ＳＫＯＶ３／ｃｐ，采用微囊包裹肿瘤细胞技术建立人类卵巢癌小鼠异种移植耐药模型。比较耐药细胞和非耐药细胞生化特征的差异，采用相应的耐药调节剂来进行耐药逆转实验。结果：在ＳＫＯＶ３细胞内，铂（Ｐｔ）累积浓度、Ｐｔ－ＤＮＡ加合物、ＤＮＡ链间交联指数（ＩＳＣ）分别是ＳＫＯＶ３／ｃｐ细胞的５．１、２．４和４．８倍（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）；二性霉素Ｂ（ＡｍＢ）和新生霉素（ＮＶＢ）能提高ＳＫＯＶ３／ｃｐ细胞内铂浓度或Ｐｔ－ＤＮＡ加合物浓度，从而完全或部分逆转ＳＫＯＶ３／ｃｐ对顺铂的耐药性。结论：导致ＳＫＯＶ３／ｃｐ对顺铂耐药的主要原因是细胞内药物浓度下降和对Ｐｔ－ＤＮＡ清除能力增强。ＡｍＢ和ＮＶＢ能够逆转ＳＫＯＶ３／ｃｐ对顺铂的耐药性。     

肝素结合表皮生长因子在顺铂耐药卵巢癌中的表达及相关性研究

目的检测肝素结合表皮生长因子（HB-EGF）在顺铂耐药卵巢癌中的表达水平并探讨HB-EGF与卵巢癌对顺铂耐药性的关系。方法①体外实验：蛋白印迹法检测卵巢癌亲本细胞株A2780和顺铂耐药株A2780/CDDP中HB-EGF蛋白的表达。分别予以HB-EGF抑制剂CRM197治疗,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞的增殖能力,酶标仪检测加药前后caspase-3蛋白的活性;②体内实验：建立A2780组和A2780/CDDP组卵巢癌裸鼠移植瘤模型,免疫组化法检测2组移植瘤中HB-EGF蛋白的表达。分别予以CRM197治疗观察移植瘤的生长情况并计算CRM197抑瘤率。结果体内外实验结果表明,与A2780组相比,HB-EGF在A2780/CDDP组中高表达。CRM197可有效地降低A2780/CDDP细胞的增殖能力和caspase-3的表达,抑制A2780/CDDP组裸鼠移植瘤的生长（P〈0.001）。结论 HB-EGF在顺铂耐药卵巢癌中高表达,并与卵巢癌对顺铂的耐药性相关。     

NAC-1通过自噬介导卵巢癌细胞顺铂耐药的研究

目的:探讨NAC-1在自噬介导的卵巢癌细胞顺铂耐药中的作用。方法:Western blot及流式细胞术检测顺铂诱导的耐药卵巢癌细胞(SKOV3/DDP)自噬及凋亡过程中,NAC-1蛋白的表达情况。采用siRNA下调NAC-1表达,检测其对SKOV3/DDP细胞自噬及凋亡的影响,并检测其对顺铂耐药性的影响。结果:顺铂处理SKOV3/DDP细胞后,细胞自噬及凋亡水平升高,NAC-1蛋白表达升高。siRNA下调NAC-1基因后,顺铂处理SKOV3/DDP细胞的自噬水平降低,凋亡升高,细胞顺铂耐药性降低。结论:NAC-1基因可能通过调节自噬参与卵巢癌细胞顺铂耐药,降低NAC-1基因表达有助于提高顺铂对卵巢癌细胞的杀伤作用。     

上推膀胱直肠后再次宫颈环形电切术对保留生育功能的价值

目的:探讨上推膀胱直肠后再次宫颈环形电切术(LEEP)在宫颈疾病治疗中的可行性,评价其对年轻患者保留子宫及生育功能的价值。方法:回顾性分析2010年1月至2014年4月在复旦大学附属妇产科医院就诊,因宫颈LEEP术后切缘阳性或术后随访复发、无法在门诊行常规LEEP而行上推膀胱直肠后再次LEEP的38例患者的临床资料。结果:38例患者均顺利完成了上推膀胱直肠后再次LEEP,术中均未出现膀胱、直肠损伤等并发症。手术时间38±7分钟,术中出血量20±5 ml,住院天数2.7±0.6天;其中1例患者术前病理检查为宫颈高度鳞状上皮内瘤变,术后升级为原位鳞癌合并原位腺癌行全子宫切除术,37例患者(97.4%)成功保留子宫,随访至今1例术后12个月低度鳞状上皮内瘤变行宫颈激光治疗,余均未见宫颈病变复发。12例患者有生育意愿,7例患者已成功妊娠,6例已分娩。结论:上推膀胱直肠后再次LEEP安全可行,可实现未生育妇女及年轻妇女保留子宫及生育能力的意愿。     

Responsiveness of gynecologic tumors to chemotherapeutic agents in the 6-day subrenal capsule assay

Various gynecologic malignancies have been tested in the 6-day subrenal capsule assay, which is an in vivo test of human tumor responsiveness to drug therapy. Fresh surgical explants of ovarian, endometrial, and cervical tumors were implanted as 1-mm³ fragments under the renal capsule of normal mice and tested against a spectrum of clinically active agents. Regardless of the site of origin, human tumors showed variations in growth rate when implanted under the renal capsule that appeared to reflect both the growth potential characteristic of each tumor as well as the heterogeneity of the cell populations comprising each tumor. An average of 60% of tumors showed positive growth and 11% demonstrated no measurable change in size. The response rates of 18 ovarian, 28 endometrial, and 20 cervical carcinomas to clinically active chemotherapeutic agents were determined. A range of responses, in terms of drugs indicated to be active and of the degree of responsiveness to active agents, was obtained with each histologic type. Response rates varied from 6% to tamoxifen in cervical carcinomas to 80% to 5-fluorouracil in ovarian carcinomas. The results of this study support the variability in chemotherapy responsiveness observed clinically with gynecologic tumors and suggest the feasibility of using the subrenal capsule assay as a predictive test.