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1.
将外源基因直接注入动物体内并获得表达,是近几年发展起来的一种新的基因疗法。该方法操作简便,临床易于接受。天然GM-CSF在体内产生的量极少,本研究将hGM-CSF基因直接注入小鼠体内,以使小鼠体内产生自身所需要的天然hGM-CSF。首先将PCR扩增的hGM-CSFcDNA片段平端插入真核表达质粒pCDS中,构建成重组质粒pCGI;然后采用电击法转染COS-7细胞,ELISA法检测结果显示转染后24,48,71和96小时细胞上清有hGM-CSF的表达分泌。说明重组质粒pCGI能表达分泌hGM-CS… 相似文献
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用RT PCR从CVB3 感染细胞中扩增出VP1 片段,重组入真核表达质粒pcDNA3 中,转化大肠杆菌C600,扩增后的质粒经CsCl 密度梯度离心纯化,体外转染COS 7 细胞,用SDS PAGE和Western blotting 检测表达产物;并经胫骨前肌注射小鼠,每鼠100μg/ 次,隔4 周加强一次,共3 次。免疫后不同时间检测抗体、淋巴细胞增殖反应等免疫指标。结果显示重组质粒体外转染真核细胞表达VP1 蛋白,免疫小鼠后产生了特异性抗体和淋巴细胞增殖反应。表明CVB3 VP1 DNA疫苗获得初步有效结果。 相似文献
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应用重组PCR技术克建人单链白细胞介素12融合基因 总被引:9,自引:0,他引:9
目的 构建人单链白细胞介素12(hscIL-12)融合基因并在真核细胞中进行表达,为进一步研究hscIL-12融合蛋白的生物学活性奠定基础。方法 应用重组PCR技术将hIL-12p40和p35亚单位两段编码序列的cDNA通过一疏水性多肽接头(Gly4Ser)3碱基序列进行前后拼拼(IL-12p40-多肽接头-p35),构建hscIL-12融合基因,并进行核苷酸序列测定,进一步将hscIL-12融合基因插入pcDNA3.1真核表达载体中,转染COS-7细胞表达hscIL-12融合蛋白,并行Western blot分析。结果 该融合基因经DNA序列分析表明:p40、p35、linker的连接顺序、方向及序列完全正确,融合基因可在COS-7细胞中表达hscIL-12融合蛋白。Western blot显示该融合蛋白分子 相似文献
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丙型肝炎病毒核心蛋白基因重组质粒的构建及其在真核 … 总被引:2,自引:2,他引:0
目的:构建包含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(C)基因片段的重组真核表达载体,并在肝细胞癌细胞株7721细胞中表达。方法:将从pBRTMHCV1-3011质粒切下的HCV C基因片段插入pcDNA3质粒的CMV启动子下游,构建真核表达质粒pcDNAHCV-C,然后,采用脂质体转染技术,转染7721细胞进行瞬时表达,转染细胞裂解煮沸后,通过SDS-PAGE及Western blot检测表达的核心抗原 相似文献
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目的:构建包含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(C)基因片段的重组真核表达载体,并在肝细胞癌细胞株7721细胞中表达。方法:将从pBRTMHCV1-3011质粒切下的HCVC基因片段插入pcDNA3质粒的CMV启动子下游,构建真核表达质粒pcDNAHCV-C,然后,采用脂质体转染技术,转染7721细胞进行瞬时表达,转染细胞裂解煮沸后,通过SDS-PAGE及Westernblot检测表达的核心抗原。结果:用限制性内切酶酶切后,片段大小与计算值相符。Westernblot证实,表达抗原的Mr约为22000。结论:HCVC基因能够插入pcDNA3真核表达载体,并使其在真核细胞中表达,为进一步HCV基因疫苗的研制和探讨抗HCV感染打下了基础。 相似文献
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目的 构建人源抗-HAVFab真核表达载体并进行表达。方法 采用DNA重组技术将抗体重轻链基因与信号肽基因连接,并分别插入真核表达载体pCdhfrl、pCDNA3.1;以脂质体介导法转染CHO细胞,经G418筛选细胞,ELISab基因的表达。结果 成功地构建了Fab表达载体。转染细胞后,经ELISA检测,细胞增养上清中有抗原结合活性的Fab片段。结论Fab真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达 相似文献
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HBsAg S与GM—CSF融合基因在L929细胞中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
将乙肝病毒表面抗原(HBsAg)主蛋白的编码基因S与人GM-CSF基因融蛤 后,插入真核表达质粒pcDNA1中,经质粒酶切鉴定及DNA序列分析证明,目的基因插入pcDNA1的CMV启动子下降。以获得的重组质粒pSGM转染L929细胞,经RT-PCR及细胞原位杂交证实目的基因的转录。 相似文献
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利用全长人C1-INH cDNA片段构成建功可在COS-7细胞中瞬间表达重组人C1-INH的表达质粒pSVLC1。通过DEAE-Eextran法转染COS-7细胞,经体外标记、免疫沉淀和Western印迹后发现,转染细胞可分泌一条分子量约110kD的免疫活性蛋白带。 相似文献
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利用全长人C1-INHcDNA片段构建成功可在COS-7细胞中瞬间表达重组人C1-INH的表达质粒pSVLC1。通过DEAE-Dextran法转染COS-7细胞,经体外标记、免疫沉淀和Webtern印迹后发现,转染细胞可分泌─条分子量约110kD的免疫活性蛋白带。ELISA测定其表达水平,在转染后72h可达2μ/(ml·107细胞)。功能活性测定表明重组C1-INH具有抑制C1s酯裂解的作用。 相似文献
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目的 :构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并在哺乳动物细胞COS 7和Rlc310中进行瞬时和稳定性表达。方法 :从含hIL 18基因的中介载体 pGEM TEasy( pGEM T/hIL 18)中 ,以限制性内切酶酶切方法获得目的片段 ,克隆入真核表达质粒 pcDNA3.1( )中。以脂质体法转染COS 7和Rlc310细胞 ,用RT PCR检测IL 18mRNA的水平 ,免疫组化染色法检测蛋白表达。结果 :构建了hIL 18基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/IL 18,并可在哺乳动物细胞中瞬时、稳定表达 ,获得了可稳定表达hIL 18基因的Rlc310细胞株。结论 :pcDNA3.1/IL 18的构建及表达 ,为IL 18抗肿瘤作用的研究奠定了基础 相似文献
12.
背景:体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要。
目的:构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础。
方法:采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72 cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。
结果与结论:重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72 cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达。 相似文献
13.
利什曼原虫的 L ACK抗原是利什曼原虫活性蛋白激酶 C受体同源物 ,是一种新发现的抗原蛋白。我们以本实验室的重组质粒 T- L ACK为模板 ,PCR扩增获得 L ACK基因 ,与真核表达载体 pc DNA3.1( )定向重组 ,重组质粒经酶切和 PCR分析 ,含有约 95 0 bp的 L ACK基因 ,成功构建含有 L ACK基因的真核表达重组质粒 pc D-NA3- L ACK。将此重组质粒转染 COS- 7细胞 ,通过 RT- PCR及免疫荧光检测 L ACK基因在真核细胞中的表达。实验结果显示转染了重组质粒的 COS- 7细胞 ,其 RT- PCR及免疫荧光检测均呈阳性反应 ,证实重组质粒 pc DNA3-L ACK能在 COS- 7细胞中有效表达 L ACK蛋白。 相似文献
14.
目的:构建真核表达质粒pcDNA3.1-PSCA,通过稳定转染建立高效表达人前列腺干细胞抗原(PSCA)的小鼠黑色素瘤B16细胞系。方法:利用PCR扩增出人PSCA全长基因的cDNA编码区序列,使用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,得到重组表达质粒pcDNA3.1-PSCA。双酶切及测序鉴定后,利用脂质体法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,G418加压筛选后得到阳性克隆。通过流式细胞术、免疫荧光及Western blot检测PSCA在细胞系中的表达情况。结果:经测序及双酶切鉴定,pcDNA3.1-PSCA重组质粒构建正确;稳定转染人PSCA的B16细胞系表达率接近100%。结论:建立的稳定转染人PSCA的B16细胞系能够高效表达PSCA基因,为抗前列腺癌疫苗的功能研究奠定了基础。 相似文献
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目的构建SEDL基因及其突变体与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体的融合表达质粒pEGFP-C3-SEDL并获得表达。方法分别提取X连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(SEDT)患者和正常对照外周血淋巴细胞RNA,RT-PCR方法扩增SEDL基因cDNA,双酶切后克隆至pEGFP-C3空载体,构建表达质粒pEGFP-C3-SEDL。双酶切和DNA测序鉴定后,转染COS-7细胞,通过流式细胞仪和荧光显微镜观察重组蛋白表达情况。结果 DNA测序显示重组真核表达载体pEGFP-C3-SEDL构建成功,SEDL基因c.370-371ins A突变位点被成功克隆到突变体重组质粒中。荧光倒置显微镜观察证实重组质粒均能在细胞内进行蛋白表达。结论 SEDL基因及其突变体真核表达载体的成功构建为其进一步研究SEDL基因突变致SEDT的分子机制奠定了基础。 相似文献
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目的:构建赖型钩端螺旋体LipL41基因的真核重组表达质粒、并对其表达进行检测。方法: 以赖型钩端螺旋体017株基因组DNA为模板PCR扩增目的基因,克隆至原核表达质粒pGEX-4T-1上。测序分析后酶切,并连接至真核表达质粒pcDNA3上,构建真核重组表达质粒LipL41-pCDNA3。利用脂质体介导转染COS7细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR检测其表达。结果: PCR扩增出1 011 bp大小的目的片段,序列分析显示它与Leptospira kirschneri的LipL41基因成熟肽序列同源性高达98%。酶切鉴定证实真核重组表达质粒LipL41-pCDNA3构建成功,RT-PCR检测显示,LipL41-pCDNA3转染组在大约1kb处出现特异的扩增带,而空质粒组无此条带。结论:LipL41的真核重组表达质粒构建成功,并可在哺乳动物细胞中表达。 相似文献
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本研究旨在构建可溶性血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)受体1(soluble fmslike tyosine kinase-1,sFlt-1)的真核表达质粒pcDNA3.1-sFlt-1,并观察sFlt-1对血管内皮细胞增殖的影响。提取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)总RNA,扩增Flt-1基因胞外1-3结构域,构建真核表达质粒pcDNA3.1-sFlt-1,测序鉴定基因序列。将重组质粒转染Lewis肺癌细胞,采用RT-PCR和SDS-PAGE检测sFlt-1在基因及蛋白水平的表达情况。MTT法检测sFlt-1对VEGF诱导的HUVECs生长的影响。结果显示:①插入片段序列正确;②sFlt-1在基因水平成功表达且转染后的Lewis肺癌细胞能分泌表达sFlt-1;③含sFlt-1的细胞上清液可明显抑制VEGF诱导的HUVECs增殖。本研究成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1-sFlt-1,sFlt-1,在基因和蛋白水平均获得有效表达,且表达的蛋白可明显抑制由VEGF诱导... 相似文献
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目的:构建CD80/IgG真核表达载体,使其在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中呈分泌型表达,为白血病免疫基因治疗的研究奠定基础。 方法: 采用多聚酶链反应(PCR)技术分别从小鼠脾细胞和含小鼠CD80全长互补DNA(cDNA) 的质粒pcDNA/B7中扩增出免疫球蛋白IgG1的Fc段和CD80胞外区,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.0中,获得重组表达载体pcDNA/CD80-IgG;采用脂质体转染技术转染CHO细胞,G418筛选得到稳定表达细胞株;免疫印迹、斑点ELISA及流式细胞术鉴定融合蛋白的表达,并初步检测其活性。 结果: DNA测序证明两段基因正确克隆至pcDNA3.0的多克隆位点,CHO细胞的培养上清中可检测到融合蛋白的表达,其分子量大小和预期的基本一致,该融合蛋白可提高白血病细胞表面CD80的表达。 结论: 成功构建pcDNA/CD80-IgG真核表达载体,并在CHO细胞中分泌性表达有活性的CD80-IgG融合蛋白。 相似文献
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目的:构建大鼠葡萄糖转运体1(GLUT1)的真核表达载体。 方法: 以RT-PCR方法从大鼠脑组织中获取GLUT1全长cDNA片段,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1,随后用lipofectamineTM 2000介导转染HEK293细胞,以RT-PCR法检测重组质粒在mRNA水平的表达,以免疫组化的方法检测重组质粒在蛋白水平的表达。 结果: 以构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-Glut1转染293细胞后,在基因及蛋白表达水平均检测到了葡萄糖转运体1的表达。 结论: 成功构建了携带大鼠葡萄糖转运体1的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Glut1,且证实其可在293细胞中成功表达目的基因,为进一步研究外源性GLUT1表达对缺血缺氧脑细胞的保护作用奠定了基础。 相似文献