幼年和成年大鼠视皮层蛋白脂质蛋白质的基因表达

目的观察蛋白脂质蛋白质(proteolipid protein,PLP)基因在幼年和成年大鼠视皮层中的表达水平,探讨其在视觉可塑性关键期中的作用。方法采用半定量RT-PCR方法,分析处于视觉可塑性关键期内的幼年大鼠和处于视觉可塑性关键期后的成年大鼠视皮层中PLP基因的表达水平。结果幼年大鼠和成年大鼠视皮层间PLP mRNA表达量有显著性差异,PLP mRNA在幼年大鼠视皮层中表达水平显著高于成年大鼠。结论PLP基因在视觉可塑性关键期内的幼年大鼠视皮层中呈高水平表达,证实了PLP基因是视觉可塑性相关基因,参与了视觉可塑性关键期的调控。     

大鼠视觉可塑性相关cDNA文库的构建及筛选

目的筛选视觉可塑性相关基因,探讨视觉可塑性关键期形成及终止的分子机制。方法应用抑制性消减杂交技术构建幼年和成年大鼠视皮层差异表达的cDNA文库,并通过PCR筛选、反向Northern杂交验证、测序及同源性检索对差异表达基因进行分析。结果成功建立了高消减效率的幼年和成年大鼠视皮层差异表达的cDNA文库,筛选得到42个在大鼠视觉可塑性关键期终止后视皮层上调表达的基因片段、51个在大鼠视觉可塑性关键期视皮层上调表达的基因片段。经测序及同源性分析,共得到16个有效序列,其中15个为已知基因,另一个可能为新基因片段。结论通过对幼年和成年大鼠视皮层差异表达的cDNA文库的建立,筛选出一批与视觉可塑性关键期形成或终止相关的候选基因,为进一步阐明视觉可塑性的分子机制提供了重要基础。     

大鼠视觉可塑性关键期终止相关基因的筛选

目的筛选视觉可塑性关键期终止相关基因,探讨视觉可塑性关键期终止的分子机制。方法采用暗饲养及暗饲养后加光照刺激动物模型,应用抑制性消减杂交技术构建大鼠视皮层与视觉可塑性关键期终止相关的cDNA文库。并通过PCR筛选、反向Northem杂交验证、测序及同源性检索对差异表达基因进行分析。结果成功构建了高消减效率的大鼠视皮层与视觉可塑性关键期终止相关的cDNA文库,经筛选、测序及同源性分析,得到14个视觉可塑性关键期终止时视皮层上调表达基因的片段。其中13个为已知基因,除B—Tubulin、Mbp、Cyclophilin基因有文献报道跟可塑性有关外,其余基因与视觉可塑性的关系以往少有报道。结论通过大鼠视皮层与视觉可塑性关键期终止相关的cDNA文库的建立,筛选出一批与视觉可塑性关键期终止相关的候选基因,为进一步阐明视觉可塑性关键期终止的分子机制提供了重要的基础。     

弱视视觉可塑性相关基因研究

可能与弱视发病密切相关的部分基因有抗凋亡基因（Bcl-2、Bax）、即刻早期基因（c-jun、c-fos）、视觉可塑性神经递质相关基因（N-甲基-D-天冬氨酸受体1亚单位基因）、视觉可塑性神经营养因子相关基因（Neuritin mRNA、GDNF mRNA、BDNF mRNA、GAP-43 mRNA）、PTPσ mRNA、β-catenin mRNA等。Bcl-2、Bax可能通过调节视觉系统相关神经细胞的存活来参与弱视的发病;c-jun、c-fos进入细胞核后能够改变靶基因的转录活性从而调节视皮质神经元的功能状态;N-甲基-D-天冬氨酸受体1亚单位基因位于突触后膜,可以通过调节不同亚单位的表达水平来调节视皮层突触的可塑性;视觉可塑性神经营养因子相关基因中的Neuritin mRNA编码一种活性分子,这种活性分子可以促进树突的生长,从而调节视觉系统发育过程中神经元的活动;GDNF mRNA存在于视皮层和外侧膝状体,对各种损伤后的神经元具有保护和修复作用,能通过影响视觉系统正常发育过程中的转录来参与对视觉发育的调控,BDNF mRNA具有调节神经系统突触发育可塑性的效应,参与视觉发育关键期突触的可塑性变化;PTPσ mRNA、β-catenin mRNA参与了成年大鼠视皮层可塑性关键期的终止及可塑性再激活的过程。（国际眼科纵览, 2018,  42:   163-168）     

双眼形觉剥夺对成年大鼠视皮层兴奋性递质受体表达和分布的影响

目的 探索大鼠视皮层中兴奋性神经递质受体表达和分布的发育特征以及双眼形觉剥夺(binocular form deprivation,BFD)对成年大鼠视皮层内兴奋性递质受体亚型表达和分布的影响.方法 采用免疫组织化学染色和免疫印迹技术,分别对生后1～9周正常大鼠和自生后7周开始BFD 14 d后模型大鼠的视皮层中兴奋性递质受体亚型进行标记和检测.结果 N-甲基-D-天冬氨酸(N-mehyl-D-aspartate,NMDA)受体亚单位NR2A(NMDA-NR2A)在大鼠未睁眼时少量表达,可塑性关键期高峰时最明显;之后表达减少,至成年期维持一定水平,BFD 14 d可以造成成年大鼠视皮层NM-DA-NR2A阳性表达减弱.NMDA-NR2B在未睁眼时表达较明显,可塑性关键期高峰时表达最多;之后表达下降稳定在成年期低水平,BFD 14 d可造成其在成年大鼠视皮层中表达增强.α-氨基-3-羟基-5-甲基4-异唑丙酸受体GluR-1亚基平均分布在视皮层各层,在出生后少量表达,之后随年龄增长逐渐增强,其表达在可塑性关键期终止时达到高峰并在成年期维持较高水平,BFD14 d对其在成年大鼠视皮层表达没有影响.结论 由BFD诱导的NMDA-NR2A或NMDA-NR2B表达变化可能参与了成年大鼠视皮层可塑性再激活机制.     

大鼠视觉发育可塑性关键期终止前后视皮层神经元AMPA受体GluR2亚基表达的变化

目的 为了探索视觉发育可塑性关键期终止机制,在可塑性关键期终止前后,对正常大鼠视皮层内AMPA受体GluR2亚基表达的发育变化进行了研究.方法 用免疫荧光标记技术,标记生后3-8周的正常大鼠视皮层内AMPA受体GluR2亚基表达.结果 (1)GluR2免疫反应阳性神经元大部分出现在视皮层Ⅱ-Ⅲ层和Ⅴ-Ⅵ层内,并且GluR2主要在锥体神经元的胞体和树突表面表达,Ⅳ层内少量非锥体神经元表面有微弱的GluR2标记;(2)视皮层Ⅱ-Ⅲ层和Ⅴ-Ⅵ层内,GluR2阳性神经元数量随发育逐渐增加,生后5周时达顶峰,随后保持稳定的水平;(3)视皮质Ⅱ-Ⅲ层和Ⅴ-Ⅵ层内,GluR2免疫反应的平均光密度值随发育逐渐增加,生后6周时达顶峰,随后保持稳定的水平.结论 可塑性关键期高峰到终止阶段,大鼠视皮层II-III层和V-VI层内GluR2表达逐渐增加,关键期终止时达顶峰;包含GluR2亚基的AMPA受体可能通过稳定突触结构参与视觉可塑性关键期的终止.     

视觉发育可塑性关键期终止前后大鼠视皮层NR2A/NR2B比率的表达

目的在视觉发育可塑性关键期终止前后,观察大鼠视皮层内NR2A/NR2B比率的发育性变化。方法健康SPF级LongEvans大鼠15只,雌雄不限,采用Western blot法观察出生后3、4、5、6、7周正常大鼠视皮层中NR2A和NR2B的蛋白表达量,分析NR2A/NR2B随着大鼠视皮层发育表达的变化。结果 Western blot检测显示,生后3～7周正常大鼠视皮层中NR2A蛋白的表达量逐渐增加,差异有统计学意义（F=156.263,P=0.008）,生后4、5、6、7周组大鼠视皮层中NR2A的积分光密度（IOD）值明显高于生后3周组大鼠,差异均有统计学意义（P〈0.05）。可塑性关键期终止前后,正常大鼠视皮层中NR2B蛋白的表达量逐渐降低（F=73.340,P=0.007）,生后6～7周趋于稳定。可塑性关键期终止前后,大鼠视皮层中NR2A/NR2B比率随着大鼠视皮层的发育逐渐增加,差异有统计学意义（F=113.031,P=0.003）。结论在可塑性关键期终止前后,NR2A/NR2B比率的变化参与了视皮层可塑性终止的过程。     

大鼠视觉发育可塑性关键期终止前后视皮层AMPA受体电流的发育变化

目的为了探索视觉发育可塑性关键期终止机制,对可塑性关键期终止前后,正常大鼠视皮层α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionicacid,AMPA)受体介导的兴奋性突触后电流进行了研究。方法采用脑片膜片钳全细胞记录技术,记录生后3~8周正常大鼠视皮层AMPA受体介导的兴奋性突触后电流。结果在大鼠视皮层II-IV层,95例神经元形成全细胞记录,其中记录到AMPA受体电流43例;生后3~8周,视皮层神经元的输入阻抗、静息膜电位差异无统计学意义;生后3~8周,AMPA受体电流的潜伏期、上升时间、下降时间及半波宽差异无统计学意义;生后3~6周AMPA受体电流的幅值随发育逐渐增加,6~8周幅值变化不显著。结论视觉发育可塑性关键期高峰到成年阶段,大鼠视皮层神经元被动膜学特性无明显变化;AM-PA受体电流幅值随发育逐渐增加,关键期终止时达顶峰;突触后AMPA受体的功能变化可能参与了视觉发育可塑性关键期的终止过程。     

CPG15在发育期正常和单眼形觉剥夺大鼠视皮层表达的研究

目的 研究CPG15 mRNA和蛋白在发育期正常和单眼形觉剥夺(MD)大鼠视皮层中的表达,探讨其与视觉发育的相关性.方法 实验研究.80只健康Wistar大鼠分为正常组和MD组,根据发育的不同时限,正常组观察时间点分别为生后7、14、21、28、45 d,MD组分别为生后21、28和45 d,每个时间点10只大鼠.MD组大鼠于出生后14 d行右侧眼睑缝合制作单眼形觉剥夺模型.所有大鼠在同等环境下饲养.采用SYBRgreen Ⅰ荧光定量RT-PCR和免疫组织化学方法检测CPG15mRNA和CPG15阳性细胞数及蛋白表达的IOD值在发育期正常和MD大鼠视皮层中的表达变化.正常组和MD组间数据行单因素方差分析,同一时间点的两组数据采用成组设计的t检验进行统计学分析.结果 生后7、14、21、28、45 d时,正常组大鼠视皮层中CPG15 mRNA相对表达量分别为0.152±0.011、0.234±0.052、0.527±0.047、0.846±0.067、0.445±0.220,MD组大鼠则在生后21、28、45 d时相对表达量分别为0.412±0.015、0.501±0.019、0.381±0.030,组间比较差异均有统计学意义(F=177.52,36.93;P＜0.01).两组大鼠视皮层中CPG15 阳性细胞数及蛋白表达的IOD值组间比较也均有统计学意义(F=26.001,12.207,76.914,58.397;P＜0.01).CPG15 mRNA和蛋白表达的IOD值均在视觉发育关键期的中期P28和MD28达高峰.MD组与正常组大鼠视皮层中CPG15mRNA和CPG15 阳性细胞数及蛋白表达的IOD值在生后21、28、45 d比较差异均有统计学意义,MD组其表达量均明显减少.结论 发育期正常和MD大鼠视皮层中CPG15 mRNA和CPG15阳性细胞数及蛋白表达的IOD值随视觉发育呈阶段性变化,其表达与视觉经验和年龄因素相关,在视觉发育关键期呈高水平表达,单眼形觉剥夺明显影响视皮层中CPG15 mRNA和蛋白的表达,推测CPG15参与视皮层神经元的发育和成熟,它可能是参与视觉发育可塑性变化的分子基础之一.     

成年与幼年Long Evans大鼠视皮层蛋白的二维电泳分析

目的 利用双向电泳技术比较正常成、幼年Long Evans大鼠初级视皮层蛋白质组表达差异，探索蛋白质组学技术在视觉发育研究中应用的可能性。方法 22d龄和100d龄Long Evans大鼠各3只，过量戊巴比妥钠处死，切取其初级视皮层的灰质，裂解抽提总蛋白，双向电泳分离总蛋白，比较2组大鼠初级视皮层蛋白质表达差异。结果 胶图差异分析发现幼年鼠初级视皮层中有12个蛋白质点表达较丰富，成年鼠初级视皮层中有16个蛋白质点表达较丰富。结论 正常成、幼年Long Evans大鼠初级视皮层蛋白质组存在明显差异，蛋白质组学技术可以应用于视觉发育方面的研究。     

Neuritin蛋白在单眼形觉剥夺成年大鼠视皮层表达的研究

目的 研究正常、单眼形觉剥夺和反转缝合成年大鼠视皮层Neuritin蛋白的表达,探讨成年大鼠视皮层是否具有可塑性。方法 实验研究。35只健康Wistar大鼠随机分为正常对照(N90)组,单眼形觉剥夺(MD)组和反转缝合(RS)6、12、24、48 h组和RS1周组,每组5只。两种照度昼夜明暗交替时间约为12 h/12 h。MD组和RS组于出生后14 d制作右眼形觉剥夺模型,RS组大鼠单眼形觉剥夺至90日龄时进行反转缝合后并持续暴露于光中6h、12 h、24h、48 h和1周,其余两组大鼠至90日龄时直接取左侧大脑视皮层。采用免疫组织化学方法检测Neuritin蛋白在正常、单眼形觉剥夺和反转缝合成年大鼠视皮层中的表达变化。Neuritin蛋白的A值和Neuritin阳性细胞数在7组大鼠视皮层中表达的总体差异比较采用单因素方差分析,组间的多重比较采用LSD-t检验。结果 N90、MD、RS6h、RS12h、RS24h、RS48 h、RS1周组Neuritin蛋白平均吸光度分别为0.1097±0.0136、0.0259±0.0057、0.04751±0.0069、0.05189±0.0057、0.0649±0.0055、0.0835±0.0097、0.0845 +0.0098(F=105.57,P＜0.05),染色阳性细胞数分别为163.90±5.82、142.00±3.65、150.00±5.46、152.10±5.04、156.40±5.25、156.40±6.04、155.80±6.54(F=15.39,P＜0.05)。MD组大鼠视皮层中Neuritin蛋白的表达量均低于N90组。RS6、12、24、48 h组和RS1周组大鼠视皮层中Neuritin蛋白的表达量均明显高于MD组。结论 Neuritin蛋白在单眼形觉剥夺成年大鼠和反转缝合不同时间大鼠视皮层表达呈动态变化,提示年龄超过视觉发育敏感期的单眼形觉剥夺成年大鼠的视皮层仍具有一定程度的可塑性。     

反转缝合与丰富环境联合干预对成年弱视大鼠视皮层可塑性的再激活作用

目的探讨反转缝合与丰富环境联合干预对单眼形觉剥夺成年弱视大鼠视皮层可塑性的再激活作用。方法将14日龄大鼠随机分为8组：1-3组为正常对照组,4-8组为单眼剥夺组。剥夺组在生后14天行右侧眼睑缝合制备单眼剥夺模型,放于实验室标准环境下饲养,1-3组、4-6组分别于生后45天、60天、90天处死;7-8组于60日龄时打开录0夺眼,缝合左侧眼睑行遮盖治疗,第7组放于标准环境中饲养30d,即反转缝合组,第8组放于丰富环境中饲养30天,即反转缝合联合丰富环境干预组,此两组至90日龄处死取材;免疫组化染色检测并分析各组大鼠视皮层PSD-95蛋白表达水平的变化。结果同年龄段弱视组视皮层PSD-95呈阳性神经元密度降低（P〈0．001）;同年龄段反转缝合干预组视皮层较弱视组PSD-95呈阳性神经元密度增加（P〈0．05）,但仍低于正常组（P〈0．05）;同年龄段反转缝合、结合丰富环境干预组视皮层与弱视组、反转缝合组相比,PSD-95呈阳性神经元密度增加（P〈0．05）,与正常组相比,其差异无统计学意义（P〉O．05）。结论单眼剥夺影响了关键期后成年大鼠视皮层PSD-95的表达,提示PSD-95可能参与调节成年视皮层可塑性;反转缝合单纯干预、反转缝合联合丰富环境干预能部分重新激活剥夺性成年弱视大鼠视皮层可塑性,反转缝合与丰富环境联合干预的再激活作用更为明显。     

Neuritin基因在单眼剥夺成年大鼠视皮层中的表达

目的研究单眼剥夺（MD）视皮层neuritin mRNA的表达。方法35只Wistar大鼠分为正常对照组、MD组和反缝合（RS）组,缝合14日龄大鼠右眼睑建立MD模型,RS组大鼠缝合单眼至90日龄时进行反缝合,并持续暴露于灯光中6、12、24、48 h和1周,其余2组大鼠至90日龄时直接取左侧大脑视皮层,采用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测所有大鼠视皮层neuritin mRNA的表达情况。结果不同组大鼠视皮层中neuritin mRNA表达量的总体差异有统计学意义（F=19.235,P〈0.05）。MD组大鼠视皮层中neuritin mRNA的表达量低于正常对照组,差异有统计学意义（t=-0.097,P〈0.05）;RS 6 h组大鼠视皮层中neuritin mRNA的表达量明显高于MD组,差异有统计学意义（t=-0.028,P〈0.05）。RS12、24、48 h组大鼠视皮层中neuritin mRNA的表达量明显高于MD组,差异均有统计学意义（t=-0.046,t=-0.064,t=-0.065;P〈0.05）。Neuritin mRNA的表达在实验24 h达到高峰,然后逐渐下降,但RS1周组与MD组neuritin mRNA的表达比较,差异有统计学意义（t=-0.037,P〈0.05）。结论Neuritin mRNA在MD成年大鼠和RS不同时间大鼠视皮质表达呈动态变化,提示年龄超过视觉发育敏感期的MD成年大鼠的视皮层仍具有一定程度的可塑性。     

采用视觉电生理法研究氟西汀对成年大鼠视皮层眼优势可塑性的逆转作用及其机制

背景 氟西汀(Flx)为一种选择性血清素重吸收抑制剂,腹腔内注射可诱发成年大鼠海马区神经的再生和突触的发生,推测其对视皮层视觉可塑性产生促进作用,但口服Flx与成年大鼠视皮层可塑性的关系、其与双眼形觉剥夺(BFD)逆转成年大鼠视皮层可塑性作用的关系等研究鲜见报道. 目的 采用图形视觉诱发电位(PVEP)的方法研究Flx给药时间与成年大鼠视皮层可塑性逆转的关系,比较Flx与BFD逆转成年大鼠视皮层可塑性的效果.方法 采用完全随机分组区组设计多水平实验设计方法将70日龄(P70)的成年Wistar大鼠56只随机分为对照组、Flx2组、Flx4组、Flx6组、Flx8组、BFD组和Flx+BFD组,Flx各组大鼠均给予0.2 mg/ml Flx溶液喂养大鼠分别至PVEP检查前2、4、6、8周,然后改为正常水饮用,于PVEP检查前1周行左跟上下睑缘缝合制备单眼形觉剥夺(MFD)模型;BFD组大鼠在PVEP检查前3周行双眼缝合2周,同时给予正常饮水3周;Flx+ BFD组先用0.2 mg/ml Flx溶液喂养4周,在Flx溶液喂养1周后双眼缝合2周,再于PVEP记录前1周剪开右眼睑行MFD.各组大鼠均行双跟PVEP记录,测量N75-P100振幅,计算FD跟(左眼)/非FD眼(右眼)(C/I)值,并通过比较FD前后大鼠PVEP振幅值的变化评估眼优势的转移. 结果 FD 1周后,Flx4组、Flx6组、Flx8组、BFD组、Flx+BFD组大鼠PVEP C/I值较FD前均明显下降,差异均有统计学意义(t=2.733,P＜0.05;t=2.981,P＜0.05;t=3.619,P＜0.01;t=2.681,P＜0.05;t=4.550,P＜0.01) oFlx4组、Flx6组和Flx8组大鼠FD后左眼PVEP振幅值较FD前明显降低[(17.71±2.24)μV比(31.09±4.13) lμV;(18.93±2.85) μV比(29.59±4.07) μV;(17.94± 1.92) μV比(28.48±3.09) μV],差异均有统计学意义(t=3.348、3.278、4.447,均P＜0.01),而FD前后右眼PVEP振幅的改变差异均无统计学意义(均P＞0.05).FD后BFD组和Flx4+BFD组大鼠左眼PVEP振幅值明显低于FD前,差异均有统计学意义(t=2.497,P＜0.05;t=3.051,P＜0.01),BFD组和Flx+ BFD组大鼠FD后右眼PVEP振幅值明显高于FD前,差异均有统计学意义(t=-4.009,P＜0.01;t=-4.352,P＜0.01). 结论 采用0.2 mg/ml Flx水溶液喂养成年大鼠4周以上及BFD2周的方法均可有效激活成年大鼠视皮层可塑性,延长Flx喂养时间并不能显著提高视觉可塑性重塑的程度.Flx对视觉可塑性重塑的主要作用机制是抑制FD眼反应,而BFD的作用机制是抑制FD眼反应的同时促进非FD眼反应来实现的.Flx喂养与BFD法在逆转成年大鼠视皮层可塑性方面具有协同作用.     

GAP-43 in the cat visual cortex during postnatal development

GAP-43 levels have been determined by immunoassay in cat visual cortex during postnatal development to test the idea that GAP-43 expression could be related to the duration of the critical period for plasticity. For comparison, GAP-43 levels have also been assayed in primary motor cortex, primary somatosensory cortex, and cerebellum at each age. GAP-43 levels were high in all regions at 5 d (with concentrations ranging from 7-10 ng/microgram protein) and then declined 60-80% by 60 d of age. After 60 d of age, GAP-43 concentrations in each region continued a slow decline to adult values, which ranged from 0.5-2 ng/microgram protein. To test for the involvement of GAP-43 in ocular dominance plasticity during the critical period, the effect of visual deprivation on GAP-43 levels was investigated. Monocular deprivation for 2-7 d, ending at either 27 or 35 d of age, had no effect on total membrane levels of GAP-43. The concentrations of membrane-associated GAP-43 prior to 40 d of age correlate with events that occur during postnatal development of the cat visual cortex. However, the slow decline in membrane-associated GAP-43 levels after 40 d of age may be an index of relative plasticity remaining after the peak of the critical period.     

γ-氨基丁酸A受体α1亚单位在正常发育大鼠视皮层中的表达

目的观察大鼠视皮层γ-氨基丁酸A受体（GABAAR）功能亚单位GABAARα1的表达随发育发生的量的变化。方法将45只健康纯系新生Wistar大鼠按出生后年龄以随机数字表法分为9组,每组5只,分别于出生后第0、7、14、21、28、35、45、60、90天用质量分数4%多聚甲醛经左心室穿刺至升主动脉灌注固定后处死。应用免疫组织化学染色和图像分析技术分析GABAARα1在出生后不同天龄Wistar大鼠视皮层的表达情况。结果苏木精-伊红染色显示,Wistar大鼠视皮层神经元分6层,各层神经元排列整齐。免疫组织化学染色结果显示,GABAARα1阳性反应产物呈棕黄色颗粒状,染色部位主要在神经元细胞膜、树突或轴突,其中视皮层第Ⅱ/Ⅲ层细胞染色最密集。图像分析结果提示,GABAARα1在出生时的大鼠视皮层中即已存在,但表达量很少,大鼠睁眼前表达量上升缓慢,睁眼后迅速上升,在出生时GABAARα1的吸光度（A）值为4.79±1.51,至35d峰值达231.52±21.65,差异有统计学意义（P〈0.01）,此后维持高水平至出生后90d,为231.52±21.65,与出生时比较差异有统计学意义（P〈0.01）。结论大鼠视皮层中GABAARα1表达量的发育性变化与视觉发育可塑性关键期的起始和终止在时间上具有一定的同步性,提示GABAARα1表达的发育性变化可能是视觉可塑性调节的一个重要分子基础。