αvβ 3整合素在小细胞肺癌骨转移细胞株SBC-5中的表达及意义

目的:分析αvβ3整合素在特异性小细胞肺癌骨转移细胞株中的表达,探讨肺癌骨转移的机制.方法:RT-PCR、Western-blot和免疫荧光染色检测小细胞肺癌特异性骨转移细胞株SBC-5和非骨转移细胞株SBC-3中αvβ3整合素的表达差异.结果:αvβ3整合素在SBC-5细胞株中的表达显著高于SBC-3细胞株.结论:αvβ3整合素可能与小细胞肺癌骨转移的发生相关,可能促进了小细胞肺癌骨转移的发生.     

αvβ_3整合素在小细胞肺癌骨转移细胞株SBC-5中的表达及意义

目的：分析αvβ3整合素在特异性小细胞肺癌骨转移细胞株中的表达,探讨肺癌骨转移的机制。方法：RT-PCR、Western-blot和免疫荧光染色检测小细胞肺癌特异性骨转移细胞株SBC-5和非骨转移细胞株SBC-3中αvβ3整合素的表达差异。结果：αvβ3整合素在SBC-5细胞株中的表达显著高于SBC-3细胞株。结论：αvβ3整合素可能与小细胞肺癌骨转移的发生相关,可能促进了小细胞肺癌骨转移的发生。     

慢病毒载体介导的RNA干扰下调膜联蛋白A1对小细胞肺癌细胞生物学行为的影响

目的:探究AnnexinA1对小细胞肺癌细胞生物学行为的影响。方法:构建干扰AnnexinA1的慢病毒载体,转染至SBC-5细胞株;体外增殖、迁移、侵袭实验观察下调AnnexinA1表达对小细胞肺癌细胞株生物学行为的影响。结果:干扰AnnexinA1的细胞株ANXA1 RNAi-SBC-5构建成功。与转染空载体的对照细胞相比,抑制AnnexinA1的表达能够显著抑制SBC-5细胞的增殖、迁移、侵袭能力。结论:AnnexinA1表达可能与肺癌骨转移密切相关。     

钙调神经磷酸酶CaN Aα和CaN Aβ在肺癌中的表达及意义

目的:检测钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)Aα和Aβ亚基蛋白在肺癌细胞中的表达,研究CaN蛋白亚基的表达与肺癌骨转移发生是否相关.方法:应用PCR和Western blot方法检测SBC-5、SBC-3和NCI-H345小细胞肺癌细胞中CaN Aα和Aβ在基因和蛋白水平上的表达;通过免疫组织化学方法检测肺癌骨转移和肺癌无骨转移患者肺癌组织中CaN Aα和Aβ的表达.结果:CaN Aα和Aβ的表达强度在能产生骨转移的肺癌细胞SBC-5中明显高于非骨转移肺癌细胞SBC-3和NCI-H345.在肺癌伴有骨转移患者的肺癌组织中CaN Aα和CaN Aβ的表达强度也都明显较无骨转移肺癌患者组高(CaN Aα P＝0.000;CaN Aβ P＝0.000). 结论:钙调神经磷酸酶不同亚基(CaN Aα和Aβ)的表达可能在肺癌骨转移的发生和发展中具有重要意义.     

上调GDF15表达对小细胞肺癌SBC-5细胞增殖和侵袭能力的影响

目的:探讨GDF15表达对小细胞肺癌SBC-5细胞增殖和侵袭能力的影响，寻找小细胞肺癌易发生 远处转移相关的可能分子标记物。方法:通过 RT-PCR和Western blot方法检测小细胞肺癌细胞株SBC-3和SBC-5中GDF15 mRNA及GDF15蛋白的表达；慢病毒感染构建GDF15过表达的SBC-5-GDF15细胞株（实验组:SBC-5-GDF15，对照组:SBC-5-NC），通过RT-PCR 和 Western blot鉴定感染效果；采用克隆形成实验和MTT实验检测上调GDF15表达对SBC-5细胞增殖能力的影响；侵袭实验检测上调GDF15表达对SBC-5细胞侵袭能力的影响。结果:在mRNA和蛋白水平上，GDF15在SBC-5细胞中的表达均显著低于SBC-3细胞，差异具有统计学意义（P<0.05）;慢病毒感染细胞后绿色荧光的比例大于80%，GDF15在 mRNA和蛋白表达水平均被明显上调；上调GDF15的表达抑制SBC-5细胞的增殖、克隆形成和侵袭能力。结论:DGF15抑制SBC-5细胞的增殖和侵袭能力，可能成为抑制小细胞肺癌转移的潜在靶点。     

钙调神经磷酸酶CaNAαa和CaNAβ在肺癌中的表达及意义

目的：检测钙调神经磷酸酶（calcineurin,CaN）Aα和Aβ亚基蛋白在肺癌细胞中的表达,研究CaN蛋白亚基的表达与肺癌骨转移发生是否相关。方法：应用PCR和Westernblot方法检测SBC-5、SBC-3和NCI—H345小细胞肺癌细胞中CaNAα和Aβ在基因和蛋白水平上的表达;通过免疫组织化学方法检测肺癌骨转移和肺癌无骨转移患者肺癌组织中CaNAα和Aβ的表达。结果：CaNAα和Aβ的表达强度在能产生骨转移的肺癌细胞SBC-5中明显高于非骨转移肺癌细胞SBC-3和NCI—H345。在肺癌伴有骨转移患者的肺癌组织中CaNAα和CaNAβ的表达强度也都明显较无骨转移肺癌患者组高（CaNAαP=n000;CaNAβP=n030）。结论：钙调神经磷酸酶不同亚基（CaNAα和Aβ）的表达可能在肺癌骨转移的发生和发展中具有重要意义。     

肺癌骨转移相关分子的比较蛋白质组学研究

目的:分析比较人肺癌不同骨转移潜能细胞株的差异表达蛋白质图谱,筛选在肺癌骨转移中起重要作用的关键蛋白质分子。方法:利用双向凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析离子化-飞行时间-质谱技术,分析人肺癌骨转移细胞株SBC-5和非骨转移细胞株SBC-3/DOX蛋白质图谱的差异表达,查询数据库筛选肺癌骨转移相关蛋白质。结果:PDQuest 8.0软件分析3次相同条件下的2-DE图谱,结果显示重复性、匹配性较好。SBC-5检测到(1116±64)个蛋白点,平均匹配率为84%;SBC-3/DOX检测到(1132±72)个蛋白点,平均匹配率为82%;蛋白质点分布以PI 4-7、相对分子质量20 000-80 000范围内最多。两种细胞株16个差异蛋白质点胰酶胶内酶解,质谱分析获得14张肽质量指纹谱,鉴定出Annexin A1,CaN,IGFBP-1,ADAM32等8种胶内差异蛋白质。结论:人肺癌不同骨转移潜能细胞株SBC-5和SBC-3/DOX的2-DE蛋白质图谱具有明显的差异表达,多种差异表达蛋白可能与肺癌骨转移相关。     

CXCR4在不同骨转移潜能小细胞肺癌细胞系中的差异表达及意义

目的：应用intrakine技术构建CXCR4（chemokine receptor 4趋化因子受体4）敲减表型的肺癌细胞,体外观察其增殖、凋亡、侵袭、转移能力的变化。方法：经克隆PCR、测序鉴定质粒后,给高表达CXCR4、高骨转移细胞系SBC-5中转染pCMV-S-K,经流式及细胞免疫化学检测成功构建了CXCR4稳定敲减表型的肺癌细胞SBC-5/S-K,检测CXCR4敲减后细胞增殖、凋亡、侵袭及转移能力的变化。结果：与对照SBC-5/neo相比,SBC-5/S-K在增殖、克隆形成、凋亡及细胞进程方面没有变化,而侵袭、转移能力明显减弱。结论：体外实验证实CXCR4是肺癌转移基因,为后续体内功能研究打下基础。     

前列腺癌和非小细胞肺癌发生脑转移差异的机制初步研究

目的:初步探讨非小细胞肺癌和前列腺癌细胞均易于骨转移但非小细胞肺癌易于脑转移而前列腺癌细胞不易脑转移的机制。方法:选取非小细胞肺癌和前列腺癌的代表细胞株LNCap细胞株和A549细胞株培育至一定数量,分别采用Western-blot和qPCR检测法检测两种细胞株中趋化因子CXCR4、基质金属蛋白酶MMP-2前体（pro-MMP-2）、Ｎ－钙黏蛋白（N-cadherin）、VEGF-C、上皮特异性黏附分子(EpCAM)、 PRKCA的含量差异,推测其不同靶器官转移机制的差异。结果:Western-blot得出与A549细胞相比, LNCAP细胞中CXCR4,EpCAM,MMP2,VEGF-C,N-cadherin蛋白表达显著降低;PRKCA蛋白表达显著增高。qPCR得出,与A549细胞相比,LNCap细胞Ｎ－cadherin mRNA表达降低;CXCR4 mRNA 表达无明显差异;EpCAM,PRKCA mRNA表达增高;MMP2,VEGF-C mRNA未检出。结论:非小细胞肺癌和前列腺癌均易于骨转移,但非小细胞肺癌易于脑转移而前列腺癌不易脑转移,可能与非小细胞肺癌细胞富含N－cadherin而前列腺癌细胞富含蛋白激酶Cα(PRKCA)有关。     

Shugoshin1在非小细胞肺癌多西紫杉醇耐药中的作用

目的:探讨Shugoshin1在非小细胞肺癌A549细胞对多西紫杉醇耐药中的作用。方法:用Western-blot及RT-PCR检测Sgo1在非小细胞肺癌紫杉醇耐药细胞株A549/Taxotere及亲本A549中的表达差异。通过构建Sgo1的si-RNA质粒和过表达质粒经慢病毒包装分别转染A549/Taxotere及亲本A549细胞,利用Western-blot及RT-qPCR鉴定其干预效果。MTT比色法比较下调及上调Sgo1的表达后细胞对化疗药物多西紫杉醇敏感性的影响。结果:在非小细胞肺癌多西紫杉醇耐药细胞株中,Sgo1的表达明显高于其亲本细胞株A549。通过外源性筛选和鉴定,经慢病毒包装载体,成功构建了Sgo1表达上调和下调的细胞株;MTT试验发现:抑制Sgo1的表达能显著增加A549/Taxotere对多西紫杉醇的敏感性,而外源性上调Sgo1的表达能明显降低A549对多西紫杉醇的敏感性。结论:Sgo1的表达与非小细胞肺癌细胞株A549紫杉醇耐药性密切相关。     

MACC1基因siRNA对肺癌SBC-5细胞增殖和迁移的影响

目的:探讨MACC1(metastasis-associated in colon cancer l)基因特异性siRNA(small interfering RNA)对肺癌细胞系SBC-5体外增殖和迁移的影响。方法:化学合成MACC1基因特异性siRNA,阳离子脂质体LipofectamineTM 2000转染肺癌细胞系SBC-5细胞,RT-PCR和Western blot方法检测转染后SBC-5细胞中MACC1基因和蛋白的表达情况;MTT法检测细胞的生长增殖状况;划痕试验观察细胞迁移能力的改变。结果:MACC1基因特异性siRNA转染细胞后,SBC-5细胞MACC1的mRNA和蛋白表达水平明显降低,MTT试验和划痕试验观察到转染MACC1-siRNA的SBC-5细胞增殖、迁移能力明显减弱。结论:MACC1基因特异性siRNA可以明显抑制肺癌SBC-5细胞增殖和迁移,MACC1可能成为肺癌治疗的新靶点。     

Stathmin蛋白的研究进展

目的: 探讨趋化因子受体CXCR4表达水平对人肺癌细胞转移潜能的影响.方法: 采用RT-PCR,FACS检测趋化因子受体CXCR4在肺癌细胞株95C,95D细胞的表达.构建CXCR4正义和反义真核表达质粒,用脂质体法转染至95C和95D细胞内,通过G418筛选出稳定转染株.通过趋化和趋化侵袭实验测定转染前后细胞对基质衍生因子(SDF-1α)的迁移能力,通过明胶酶谱法检测MMP-2活性,通过FACS检测细胞对血管内皮细胞的黏附能力.结果: CXCR4正义和反义真核表达质粒pcDNA3-X4和pcDNA3-ASX4能明显上调或下调肺癌细胞表面CXCR4的表达,上调95C细胞表面CXCR4的表达可以增强其对SDF-1α的趋化反应性、MMP-2活性及其对血管内皮细胞的黏附能力.相反,下调95D细胞表面CXCR4的表达抑制了其对SDF-1α的趋化反应性、MMP-2活性及其对血管内皮细胞的黏附能力.结论: 上调或下调肺癌细胞表面CXCR4表达可以显著增强或抑制其转移潜能,提示CXCR4表达水平与肺癌细胞转移潜能有关.     

骨高转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BM3及其动物模型的建立

目的:建立骨转移人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BM3及其免疫缺陷小鼠骨转移动物模型.方法:将人乳腺癌细胞株MDA-MB-231改良后,接种于免疫缺陷小鼠左心室形成肿瘤骨转移,在放射性核素示踪下找到裸鼠骨转移病灶,然后切取病变骨组织进行体外培养,获得人乳腺癌骨转移细胞,用上述细胞重复以上体外-体内-体外循环3次,获得骨高转移人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231BM3)及乳腺癌骨转移裸鼠模型.并将MDA-MB-231BM3与国外建株的人乳腺癌骨高转移细胞株MDA-MB-231BO在乳腺癌骨转移动物模型建立效率上进行比较.结果:获得以骨转移为主,兼以肺、肾上腺等组织转移的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231BM3及其裸鼠骨转移动物模型.结论:MDA-MB-231BM3是以骨转移为主的高转移性人乳腺癌细胞株,该细胞株及其骨转移动物模型为乳腺癌转移的生物学研究提供了一个良好的技术平台.     

BMP 7对小细胞肺癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨重组人BMP 7(bone morphogenetic protein-7,rhBMP 7)在体外对人小细胞肺癌(SCLC)细胞株SBC-3和SBC-5生物学行为的影响,为开发新的抗癌药物提供理论依据.方法:设置不同的rhBNP 7浓度梯度(0、50、100、150、200ng/ml)和时间梯度(24、48、72h)作用于SBC-3细胞和SBC-5细胞.MTT法检测细胞增殖情况,探索rhBMP 7的有效作用浓度和作用时间.选择有效作用浓度作用于SBC-3/5细胞,观察撤离rhBMP 7后细胞增殖的变化,并用流式细胞仪分析rhBMP 7对细胞凋亡和周期的影响.结果:rhBMP 7在体外对SBC-3细胞和SBC-5细胞的增殖有抑制作用,且有一定的浓度依赖性,有效作用时间为48h.rh-BMP 7撤离后肿瘤细胞的增殖可以得以恢复.进一步研究还发现rhBMP 7可以抑制SBC-3和SBC-5细胞的迁移和侵袭能力.流式细胞仪分析rhBMP 7不影响SBC-5细胞的凋亡率,但会诱导SBC-3细胞的凋亡(P＜0.05).同时,rhBMP 7处理组中G1期的细胞比率有所升高,S期的细胞有所减少;并且这一影响在SBC-3细胞中更为明显.结论:rhBMP 7可以抑制SBC-3和SBC-5细胞的增殖,且抑制作用具有浓度和时间依赖性.rhBMP 7并不影响SBC-5细胞的凋亡,但会诱导SBC-3细胞的凋亡.因rhBMP 7可以增加G1期细胞的比率,推测可能是通过诱导细胞周期阻滞抑制肿瘤细胞增殖,从而为SCLC的治疗提供新的思路.     

人高、低转移大细胞肺癌细胞株中黏附分子存在状态的鉴定

目的:鉴定人高、低转移大细胞肺癌细胞株L9981和NL9980中黏附分子的存在状态。方法:利用半定量RT-PCR技术检测人高、低转移大细胞肺癌细胞株L9981和NL9980中E-cadherin、integrinβ1、integrinβ3基因的mRNA表达;利用流式细胞仪技术检测人高、低转移大细胞肺癌细胞株L9981和NL9980中E-cadherin、integrinβ1、integrinβ3基因的蛋白表达。结果:人高转移大细胞肺癌细胞株L9981中E-cadherin mRNA与蛋白表达水平显著低于低转移大细胞肺癌细胞株NL9980,而integrinβ1和integrinβ3的mRNA与蛋白表达水平高转移L9981细胞株显著高于低转移NL9980细胞株。结论:E-cadherin高表达与肺癌低转移有关,而integrinβ1、integrinβ3高表达与肺癌高转移有关。     

miR-409-3 p调控靶基因Beclin-1抑制小细胞肺癌细胞的自噬进而抑制其生长和转移

目的:探究miR-409-3p及其靶基因对小细胞肺癌细胞自噬、生长和转移的影响.方法:qRT-PCR检测miR-409-3p在HPAEpiC、SBC-5、NCI-H446、HOP-92细胞中的表达,SBC-5细胞中转染miR-409-3p mimic和miR-NC,CCK8法检测转染后细胞增殖,Transwell小室法...     

MACC1基因siRNA对肺癌SBC-5细胞增殖和迁移的影响

目的：探讨MACC1（metastasis-associated in colon cancer l）基因特异性siRNA（small interfering RNA）对肺癌细胞系SBC-5体外增殖和迁移的影响。方法：化学合成MACC1基因特异性siRNA,阳离子脂质体LipofectamineTM 2000转染肺癌细胞系SBC-5细胞,RT-PCR和Western blot方法检测转染后SBC-5细胞中MACC1基因和蛋白的表达情况;MTT法检测细胞的生长增殖状况;划痕试验观察细胞迁移能力的改变。结果：MACC1基因特异性siRNA转染细胞后,SBC-5细胞MACC1的mRNA和蛋白表达水平明显降低,MTT试验和划痕试验观察到转染MACC1-siRNA的SBC-5细胞增殖、迁移能力明显减弱。结论：MACC1基因特异性siRNA可以明显抑制肺癌SBC-5细胞增殖和迁移,MACC1可能成为肺癌治疗的新靶点。     

miRNA-409-3p/Beclin-1信号轴在小细胞肺癌化疗耐药的作用及分子机制研究

目的：探讨miRNA-409-3p/Beclin-1信号轴在小细胞肺癌耐药中的作用机制。方法：qRT-PCR检测用于分析基因表达情况;western blot检测蛋白表达情况;mimic NC、miRNA-409-3p mimic、pcDNA3.1质粒和pcDNA3.1-Beclin-1质粒分别转染依托泊苷(VP16)和顺铂(DDP)耐药的小细胞肺癌细胞系SBC-5/EP;荧光素酶活性分析实验用于检测基因靶向关系;GFP-LC3绿色荧光融合蛋白实验用于检测细胞自噬;克隆形成实验和流式细胞术实验用于检测细胞的增殖和凋亡;MTT法用于检测VP16-DDP药物敏感性。结果：在VP16-DDP耐药的小细胞肺癌组织和小细胞肺癌细胞（SBC-5/EP）中,miRNA-409-3p表达量低,Beclin-1表达量高;荧光素酶活性分析实验显示miRNA-409-3p靶向Beclin-1;miRNA-409-3p mimic可抑制SBC-5/EP细胞自噬和增殖,促进细胞凋亡,提高SBC-5/EP细胞的VP16-DDP药物敏感性,抑制PI3KC3和Vpsl5蛋白表达。pcDNA3.1-Beclin-1可逆转miRNA-409-3p mimic对SBC-5/EP细胞自噬和增殖的抑制作用、对细胞凋亡的促进作用、对VP16-DDP药物敏感性的提高作用,以及对PI3KC3和Vpsl5蛋白表达的抑制作用。结论：miRNA-409-3p通过靶向作用于Beclin-1而抑制VP16-DDP耐药的小细胞肺癌细胞的自噬和增殖,促进细胞凋亡,提高耐药的小细胞肺癌细胞对VP16-DDP的药物敏感性,可能与PI3KC3/Vpsl5信号通路相关。     

TGF-β上调Notch3诱导上皮间质转化在促进肺癌骨转移中的作用

目的:研究TGF-β上调Notch3表达诱导EMT在肺癌骨转移中的作用.方法:免疫荧光、蛋白印记和RT-PCR方法检测Notch3在TGF-β诱导下上皮、间质标记物以及上皮间质转化相关转录因子Twist、Snail和ZEB-1的表达变化;利用慢病毒包装Notch3正义表达载体和ZEB-1 siRNA载体分别上调Notch3和抑制ZEB-1的表达后,采用免疫荧光、蛋白印记方法检测抑制EMT转录因子ZEB-1的表达后,对上皮间质标记物的影响;进而通过体外迁移和侵袭试验观察抑制ZEB-1的表达后对Notch3高表达细胞系的迁移和侵袭能力的影响;最后体外ELISA法检测骨转移相关分子pTHrP和IL-6的表达,探讨Notch3通过诱导EMT在促进肺癌骨转移中的作用.结果:Notch3 siRNA抑制其表达后能够逆转TGF-β诱导的上皮标记物和间质标记物的表达变化,这一现象是通过影响EMT转录因子ZEB-1实现的.进而利用慢病毒包装系统,构建了Notch3过表达细胞株和ZEB-1 siRNA细胞株,免疫荧光和蛋白印记试验发现,Notch3过表达载体能够抑制上皮标记物的表达,上调间质标记物的表达,促进EMT的发生,而抑制ZEB-1的表达后能够逆转这一现象.最后,体外侵袭试验和ELISA试验发现,Notch3高表达能够增加肺癌细胞的侵袭能力以及pTHrP和IL-6的分泌,而抑制ZEB-1的表达后可明显降低其转移能力以及pTHrP和IL-6的分泌.结论:Notch3参与了TGF-β诱导肺癌细胞上皮间质转化过程,并在NSCLC骨转移中发挥作用.     

E-钙黏蛋白在人非小细胞肺癌细胞多西他赛耐药中的作用

目的:探讨非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)A549、H1299、H358、H441多西他赛（docetaxel，DTX）耐药细胞株与上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的关系，并初步研究逆转E-cadherin的表达对NSCLC细胞多西他赛耐药性的影响。方法:应用Real-time PCR 和Western blot 方法检测上皮间质转化相关标志物E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Snail在亲本细胞和多西他赛耐药细胞之间的表达差异；应用慢病毒载体介导构建稳定表达E-cadherin的NSCLC多西他赛耐药细胞；MTS法检测NSCLC细胞多西他赛耐药特性。结果:与A549、H1299、H358、H441四株亲本细胞相比，多西他赛耐药细胞（A549DTX，H1299DTX，H358DTX，H441DTX）形态呈长梭形，呈上皮间质转化（EMT）样改变。多西他赛耐药细胞中E-cadherin表达下调，Vimentin、N-cadherin、Snail表达上调。成功构建了过表达E-cadherin的NSCLC多西他赛耐药细胞。过表达E-cadherin细胞株细胞形态与空载对照细胞株以及亲本耐药细胞株相比呈间质上皮转化(MET)样改变。MTS结果显示四种不同E-cadherin过表达的NSCLC多西他赛耐药细胞对多西他赛的敏感性均强于其亲本耐药细胞和空载对照细胞。结论:NSCLC多西他赛耐药细胞发生EMT样改变，上调E-cadherin能增加NSCLC多西他赛耐药细胞对多西他赛的敏感性。