Rho信号通路在周期性张应力诱导人牙周膜细胞骨架重排中的作用

目的探讨周期性张应力对人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）骨架重排的影响及Rho信号通路在其中的作用。方法应用FX-5000T细胞应变加载系统,对体外培养的hPDLCs施加周期性张应力,幅度为10%,频率为0.1 Hz,加载时间为6 h和24 h。以未加载的细胞作为对照组。应用倒置显微镜观察细胞形态变化,细胞免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察细胞骨架蛋白F-actin的变化,并应用Western blot检测Rho通路相关蛋白的表达变化。用Rock的特异性抑制剂Y-27632预处理细胞后,在0.1 Hz,10%幅度条件下,加载6 h和24 h,检测细胞骨架蛋白F-actin的变化和Rho信号通路相关蛋白的表达变化。结果与静态组相比,周期性张应力诱导hPDLCs细胞骨架重排差异有统计学意义,Rho信号通路Rock和p-cofilin蛋白表达增加（P〈0.05）。Rock的特异性抑制剂Y-27632可以降低Rock（P〈0.05）和p-cofilin蛋白表达和细胞骨架重排。结论周期性张应力可促进体外培养的hPDLCs细胞骨架重排,Rho信号通路参与了此过程。     

周期性牵张力对人牙周膜细胞MMP-1 mRNA表达的影响

目的:观察周期性牵张应力对人牙周膜细胞(HPDLF)的MMP-1 mRNA表达的影响.方法:对培养在弹性膜培养板上的HPDLF施加0.2 Hz、12%形变率的周期性牵张力,利用原位杂交和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术观察HPDLF的MMP-1 mRNA的表达.结果:体外培养的HPDLF正常情况下表达MMP-1 mRNA,加载周期性牵张力12 h、24 h、48 h后,随着作用时间的延长,HPDLF的MMP-1 mRNA有持续增强的趋势.结论:周期性牵张力作用下,HPDLF的MMP-1 mRNA的表达增强,加速ECM的代谢活动.     

静态牵张应变对人牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响

目的:探讨牵张应变对体外培养的人牙周膜成纤维细胞COX-2表达的影响。方法:牵张应变量设为0%、8%、13%、18%、23%共5组,每组分别加载1 h8、h、16 h、24 h后收集细胞,免疫组化检测细胞中COX-2的表达,灰度分析并进行统计学处理。结果:8%~18%牵张应变范围,细胞内COX-2表达随着加载时间和应变量的增高而增强,23%应变量作用下COX-2表达降低,且与加载时间无关联。结论:在细胞的生理应变范围(8%、13%、18%)内,静态牵张应变促进人牙周膜成纤维细胞COX-2的表达,当牵张应变量超过生理应变范围(23%),则COX-2的表达量降低。     

牙髓卟啉单胞菌脂多糖对小鼠成骨细胞表达IL-34mRNA的影响

目的:探讨牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis,P.e)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)对成骨细胞产生白介素34(interleukin-34,IL-34)mRNA表达的影响及此过程是否有p38MAPK、ERK1/2、NF-κB和SIRT1蛋白的参与.方法:以不同浓度P.e-LPS(0～50 mg/L)刺激MC3T3-El细胞和以20 mg/L P.e-LPS作用细胞不同时间(0～24 h)后,采用实时反转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)检测IL-34 mRNA的表达.以同样方法检测NF-κB抑制剂BAY 11-7082、p38MAPK抑制剂SB203580、ERK1/2抑制剂PD98059、沉默调节蛋白1(sirtuin1,SIRT1)激动剂白藜芦醇(resveratrol,RES)和SIRT1抑制剂EX-527对Re-LPS刺激MC3T3-El细胞后IL-34 mRNA表达的影响.采用SPSS 13.0软件包对结果进行单因素方差分析和Dunnett t检验.结果:不同浓度P.e-LPS (0～50 mg/L)刺激MC3T3-El细胞后,IL-34 mRNA的表达具有剂量依赖性.20 mg/L P.e-LPS作用MC3T3-El细胞24 h时,IL-34 mRNA的表达量最大;48 h时,IL-34 mRNA的表达量有所下降.10 mol/LBAY-117082、SB203580、PD98059预处理细胞1h,可以降低P.e-LPS诱导的IL-34 mRNA的表达水平.50 mol/L RES下调P.e-LPS诱导小鼠成骨细胞表达IL-34 mRNA,而10 mol/L EX-527则上调IL-34 mRNA的表达.结论:Re-LPS可诱导成骨细胞表达IL-34 mRNA,其机制可能是激活p38MAPK、ERK1/2、NF-κB和SIRT1信号通路.     

牵张应力对人牙周膜细胞MMP-2表达的影响及相关信号通路的研究

目的：探讨NF-κB通路对牵张应力介导的人牙周膜细胞（HPDLCs）中MMP-2表达的影响.方法：按胶原酶消化法培养HPDLCs,分为5组：非加力对照组（A组）;12％形变率,3h组（B组）;12％形变率,6h组（C组）;12％形变率,12h组（D组）;12％形变率＋PDTC干预,12h组（E组）,通过细胞牵张应力加载系统施加机械牵张应力,结束后收集细胞提取蛋白,用蛋白印迹法检测MMP-2蛋白表达的变化.结果：B、C、D组MMP-2表达大于A组,差异有统计学意义（P＜0.05）,且随着作用时间的延长蛋白表达增加;NF-κB通路抑制剂PDTC可抑制机械牵张应力作用下牙周膜细胞MMP-2表达的增加.结论：持续机械牵张应力可诱导人牙周膜细胞MMP-2表达的增加,从而影响牙周组织细胞外基质代谢,机械牵张应力可通过NF-κB通路影响MMP-2蛋白的表达.     

牵张应变诱导人牙周膜细胞晚期凋亡的实验研究

目的研究机械牵张应变对人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,HPDLCs）晚期凋亡的影响。方法体外培养HPDLCs,利用动态机械应变细胞加载装置对HPDLCs加载1%、10%和20%的动态牵张应变6、12、24和48 h,通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜对经过TUNEL染色的细胞进行晚期凋亡检测。采用SPSS 11.0软件包对数据进行统计学分析。结果HPDLCs加载后,呈现栅栏状相互平行排列趋势,排列方向垂直于牵张力方向。各应变组细胞的晚期凋亡率在加载24 h时达到该应变组的峰值,且具有一定时间和应变依赖性。结论通过动态机械应变细胞加载装置对人牙周膜细胞的牵张加载,发现牵张应变可以诱导细胞发生晚期凋亡,具有时间和应变值依赖性,24 h时晚期凋亡率达到峰值。     

牵张应变诱导人牙周膜细胞凋亡信号通路初探

目的通过研究Caspase酶在牵张应变作用下的变化,来初步探讨其引起人牙周膜细胞(HPDLCs)凋亡的可能机制。方法体外培养HPDLCs,利用动态机械应变细胞加载装置对HPDLCs加载1%、10%和20%的动态牵张应变6、12、24、48 h,利用酶标仪检测Caspase-3活性以及添加Caspase-8和Caspase-9阻断剂后Caspase-3活性。结果 Caspase-3活性具有一定的时间和应变值依赖性,各应变组细胞的Caspase-3活性在加载24 h时达到峰值,Caspase-9阻断剂可以显著降低Caspase-3的活性,而Caspase-8却并没有明显作用同时发现。结论 Caspase-9激活Caspase-3介导的凋亡通路参与了牵张应变诱导HPDLCs的凋亡。     

周期性张应力对牙周膜细胞内基质金属蛋白酶-8和13表达的影响

目的：观察周期性张应力作用下牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,HPDLC）中基质金属蛋白酶（MMPs）的表达变化。方法：通过建立体外应力加载系统,对培养在弹性膜六孔板的HPDLC施加0.1Hz,硅胶膜形变率分别为6%、12%、18%的周期性张应力,分别在加载2、6、12h后利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western Blot技术检测HPDLC的MMP-8,MMP-13的表达变化。结果：HPDLC在加载周期性牵张力后,细胞生长方向顺应力方向而发生改变,MMP-8和MMP-13的表达明显增加。结论：周期性循环张力可诱导HPDLC中MMP-8、MMP-13表达增强,为MMP-8、MMP-13可能参与正畸力下牙周组织的改建提供了依据。     

牵张应变作用下人牙周膜细胞内磷脂酶C-γ1水平变化的实验研究

目的 观察人牙周膜细胞（HPDLCs）内磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）水平在机械牵张应变作用下的变化.方法 通过原代和传代培养,获得性状稳定的人牙周膜细胞,使用动态机械应变细胞加载仪对细胞进行1％、10％和20％动态牵张应变加载.并于加载后10 min、20 min、30 min、40 min、50 min和60 min,通过流式细胞仪和激光扫描共聚焦显微镜检测细胞内PLC-γ1水平的变化.应用SPSS13.0软件包对数据进行统计分析.结果 流式细胞仪检测发现：加载初期,细胞内的PLC-γ1水平维持在较低水平,随着牵张应变加载时间的延长,牙周膜细胞内PLC-Y 1水平逐渐升高.50 min时PLC-Y 1水平达到了各个应变组的最高值（P＜0.01）,60 min时各应变组的PLC-γ1水平都有所下降（P.＜0.01）.激光扫描共聚焦显微镜检测发现：各组都有PLC-γ1的表达,其中50 min加载组表达相对较强.结论 机械牵张应变可以引起人牙周膜细胞内PLC-γ1表达量发生改变.     

周期性张应变对人牙髓细胞形态、存活率和增殖活性的影响

目的：研究周期性张应变对人牙髓细胞形态、存活率和增殖活性的影响。方法：取新鲜拔除的健康恒牙牙髓,采用组织块贴壁法培养原代人牙髓细胞,通过Flexcell细胞应力培养系统,分别加载2%和8%的周期性张应变,加载频率为1Hz,加载时间分别为0.5h、12h及24h,以未加载的静态细胞作为对照组。应用倒置相差显微镜、台盼蓝法及MTT法分别检测细胞形态、存活率和增殖活性的变化。数据采用SPSS16.0软件包进行单因素方差分析。结果：张应变加载后,贴壁的牙髓细胞形态为长梭形,有明显的极性突起,并且排列趋向一致,加载24h变化更明显。2%、8%加载组细胞的存活率显著大于对照组,12h加载组细胞存活率最高,24h加载组略有下降。2%、8%加载组细胞的增殖能力与对照组相比增加,2%组加载24h增加最明显（P〈0.01）。结论：周期性张应变对离体培养的人牙髓细胞形态、存活率和增殖活性有明显影响,并呈应变大小和时间依赖性。     

转化生长因子β1/细胞外信号调节激酶/基质金属蛋白酶通路对腺样囊性癌侵袭和迁移的影响

目的 探讨转化生长因子β1/细胞外信号调节激酶/基质金属蛋白酶2(TGF-β1/ERKl/2/MMP-2)通路在腺样囊性癌(ACC)侵袭和迁移过程中的作用及机制.方法 以腺样囊性癌ACC-2细胞株为研究对象.用转化生长因子β1(TGF-β1)以及ERK通路抑制剂UO126处理ACC-2细胞.MTT检测ACC-2细胞的增殖情况,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力,Westem blot蛋白印迹检测ACC-2细胞中ERKI/2的活化及MMP-2的表达情况,实时荧光定量聚合酶链反应检测ACC-2细胞中MMP-2的mRNA的表达情况.结果 TGF-β1及UO126干预后,ACC-2细胞增殖能力无明显变化;TGF-β1刺激可增强ACC-2细胞迁移、侵袭能力,增加ACC-2细胞p-ERKI/2和MMP-2蛋白以及MMP-2 mRNA的表达.而UO126阻断ERK磷酸化后,抑制了TGF-β1刺激的增强作用,ACC-2细胞的迁移、侵袭能力降低,MMP-2蛋白和mRNA的表达均下降.结论 TGF-β1/ERKl/2/MMP-2通路参与了人唾液腺ACC侵袭和迁移能力的调节.TGF-β1可通过上调ERK1/2,继而上调MMP-2,促进人唾液腺ACC细胞的侵袭和迁移能力,ERKl/2可能成为人唾液腺ACC侵袭防治的新靶点.     

细胞外信号调节蛋白激酶1/2在介导周期性牵张力对牙周膜细胞成骨分化中的作用

目的 研究周期性牵张力刺激下细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）1/2对牙周膜细胞成骨分化的分子调控机制。方法 组织块法培养人牙周膜细胞。采用多通道应力加载系统对细胞施加频率0.5 Hz、振幅10%的周期性牵张力（加力时间1、3、6、12、24 h）,以不加力的细胞作为对照,并分别在加力前应用ERK1/2通路特异性抑制剂U0126以及对细胞转染ERK1/2显性负相变异体（DN-ERK1/2）。采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）及蛋白质印迹法研究人牙周膜细胞的基因蛋白水平变化。结果 加力后人牙周膜细胞的p-ERK1/2蛋白水平及骨钙蛋白（OCN） mRNA、骨涎蛋白（BSP）mRNA水平均显著升高,Runt相关基因（Runx）2 mRNA及蛋白水平在加力3、6 h均显著升高。加入抑制剂U0126或细胞转染DN-ERK1/2后,Runx2、OCN、BSP mRNA水平以及Runx2、p-ERK1/2蛋白水平均降低。结论 ERK1/2是周期性牵张力刺激下牙周膜细胞成骨分化的重要分子途径,力学刺激下激活的ERK1/2可能通过提高Runx2蛋白的表达水平而参与成骨基因OCN和BSP的转录表达。     

Platelet-released supernatant increases matrix metalloproteinase-2 production, migration, proliferation, and tube formation of human umbilical vascular endothelial cells

BACKGROUND: Local application of platelets represents a promising tool to enhance bone regeneration. New bone formation strictly requires blood vessel formation, a sequential process involving matrix degradation, migration, proliferation, and tube formation of endothelial cells. Here we investigated the impact of secreted granula products from activated platelets on endothelial cells, and determined the involvement of extracellular signal-regulated kinase (ERK) signaling. METHODS: The effects of platelet-released supernatant on endothelial cells were investigated using in vitro models. Matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) release, migration, proliferation, and tube formation of human umbilical vascular endothelial cells (HUVEC) were determined in response to platelet-released supernatant by gelatine zymography, Boyden chamber assay, 3[H]thymidine incorporation, and basement membrane assay, respectively. All experiments were performed in the presence of the ERK signaling inhibitor PD98059. ERK phosphorylation was detected by Western blot analysis. RESULTS: Incubation with platelet-released supernatant increased the production of MMP-2, migration, proliferation, and tube formation of HUVEC. Platelet-released supernatant also stimulated ERK phosphorylation in HUVEC. Inhibition of ERK signaling decreased platelet-released supernatant-stimulated endothelial cell proliferation, but not MMP-2 activity, migration, and the formation of capillary tubes. CONCLUSIONS: Our data suggest that secreted granula products from platelets can enhance different stages of blood vessel formation, and that ERK signaling is required to mediate the mitogenic effects of the supernatant. These findings support the hypothesis of a potential link between platelet activation and blood vessel formation during bone regeneration.     

Physiologic levels of epidermal growth factor in saliva stimulate cell migration of an oral epithelial cell line,HO-1-N-1

An oral epithelial cell line derived from buccal mucosa squamous cell carcinoma, HO-1-N-1, was used to elucidate the role of epidermal growth factor (EGF) in saliva on wound healing of the oral mucosa. The effects of EGF on DNA synthesis, and cell migration was studied and the related signal transduction pathways examined. DNA synthesis by HO-1-N-1 cells was stimulated dose-dependently by 1-10 ng ml(-1) EGF, but significantly inhibited by addition of a PI3-K inhibitor (wortmannin), a p38 MAPK inhibitor (SB203580) or an MEKs inhibitor (PD98059). Cell migration was also accelerated by addition of 1-10 ng ml(-1) EGF; however, the migration rate was decreased to 30% by adding PD98059, to 40% by adding a tyrosine kinase inhibitor (herbimycin A), and to 60% by adding wortmannin or dexamethasone. These results indicate that the physiologic concentration of EGF in saliva may stimulate proliferation and migration of oral epithelial cells for wound healing, when the oral mucosa has been injured. Furthermore, this study revealed that EGF-stimulated signal transduction pathways for epithelial cell proliferation and cell migration are different.     

炎症状态下张应力对成骨细胞基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1表达的影响

目的 观察炎症状态下周期性张应力对小鼠成骨细胞(MC3T3-E1细胞)基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1表达的影响.方法 收集100 ng/ml的经牙龈卟啉单胞菌脂多糖(P.g-LPS)刺激小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7细胞)24 h后培养上清液,以20％稀释浓度作用于MC3T3-E1细胞24 h,采用四点弯曲细胞力学加载仪对正常培养与炎症状态下培养的MC3T3-E1细胞分别加载张应力0 h(对照组)、1h、3h、6h,采用荧光定量聚合酶链反应(real time PCR)和免疫组化法检测基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1的mRNA及蛋白水平表达的变化.结果 炎症状态下周期性张应力作用于小鼠成骨细胞后,加力组基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1的mRNA和蛋白表达量较非炎症状态下显著增加,并随着时间的延长而不断增加,且不同时间段的表达差异有统计学意义(P＜0.05).结论 炎症状态下张应力可显著影响成骨细胞基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1的表达,从而为炎症状态与张应力共同作用下基质金属蛋白酶-13和金属蛋白酶抑制因子-1参与牙周组织细胞外基质代谢提供了理论依据.     

TGF-β1对人唾液腺腺样囊性癌ACC-2细胞体外增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探讨TGF-β1在腺样囊性癌的增殖、迁移和侵袭、浸润过程中的作用和相关机制。方法:以腺样囊性癌ACC-2细胞株为研究对象,采用TGF-β1刺激ACC-2细胞,MTT法检测ACC-2细胞的增殖能力,Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力,Western蛋白印迹检测ACC-2细胞MAPK(P38、JNK、ERK)的活化及MMP-2表达的变化,实时定量PCR检测ACC-2细胞中MMP-2的mRNA表达变化。采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:TGF-β1刺激后,ACC-2细胞增殖能力无显著变化(P>0.05),但迁移、侵袭能力增强(均为P<0.01);同时,ACC-2细胞p-ERK1/2、p-P38和MMP-2蛋白表达升高(均为P<0.05),MMP-2 mRNA表达亦升高(P<0.01),但p-JNK1/2蛋白无显著变化(P>0.05)。结论:TGF-β1可增强人唾液腺腺样囊性癌ACC-2细胞的迁移和侵袭能力,活化p-ERK1/2和p-P38,上调MMP-2的表达。TGF-β1/MAPK/MMP-2通路可能参与人唾液腺腺样囊性癌ACC-2细胞侵袭能力的调节。     

正畸静压力通过p38MAPK调控牙周膜细胞MMP-2和MMP-9的表达

目的:研究持续性正畸静压力对牙周膜细胞(PDLCs)表达MMP-2和MMP-9的调控及其有关的调控通路.方法:体外培养PDLCs,取4～7代的PDLCs,随机分成5组,分别施加0、2 g/cm2(24 h)、2 g/cm2(48 h)、4 g/cm2(24 h)、4 g/cm2(48 h)的持续静压力,对细胞形态及骨架...     

Prostacyclin Analog Promotes Human Dental Pulp Cell Migration via a Matrix Metalloproteinase 9–related Pathway

IntroductionDuring dental pulp healing, progenitor cells migrate to the injured site. This study investigated the effect of iloprost (an exogenous prostacyclin [PGI₂]) on enhancing human dental pulp cell (HDPC) migration and its underlying mechanism.MethodsHDPC migration was analyzed using a wound scratch assay. HDPCs were obtained from extracted teeth and cultured in the presence of iloprost for 24 and 72 hours. Immunofluorescent staining for matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), quantitative polymerase chain reaction gene expression analysis, gelatin zymography, and enzyme-linked immunosorbent assay of MMP-9 expression were performed. A PGI₂ (IP) antagonist, protein kinase A (PKA) inhibitor, and MMP-9 inhibitor were used to inhibit the IP receptor, PKA signaling pathway, and MMP-9 activity, respectively.ResultsA mechanically applied scratch in HDPC cultures closed more rapidly in the presence of iloprost. This result coincided with increased MMP-9 messenger RNA and protein expression and higher gelatinase activity. These iloprost-enhanced effects were inhibited by an IP receptor antagonist or a PKA inhibitor. Forskolin, a PKA activator, increased MMP-9 expression concomitant with increased migration. The application of a selective MMP-9 inhibitor resulted in decreased iloprost-induced migration.ConclusionsMMPs play an important role in cell migration by degrading components of the extracellular matrix. In this study, iloprost accelerated HDPC migration in a wound scratch assay. MMP-9 expression was increased concomitantly by iloprost and appeared to be mediated by the IP-PKA pathway. These observations suggest that iloprost may enhance dental pulp tissue healing by up-regulating MMP-9. The PGI₂ analog might be a promising biomolecule in dental pulp regenerative treatment.