RNA干扰技术分子机制的研究新进展

RNA干扰是一种基因沉默技术。目前,它在基因功能研究、肿瘤的基因治疗及新药的研究与开发等方面已显示出广阔前景。与此同时,RNA干扰分子机制的研究也取得了飞速发展,包括对转录水平、转录后水平、翻译水平、基因甲基化等层次的研究。清晰阐述RNA干扰的作用机制将为大规模基因系统筛查、新基因的发现、人类肿瘤及难治性疾病的基因治疗提供重要理论依据和有力工具。     

RNA干扰抗人免疫缺陷病毒感染的作用靶点

 目的综述了近年来RNA干扰技术在抗人免疫缺陷病毒(HIV)感染中的作用靶点。方法以近几年具有代表性的文献为依据,进行分析、归纳和整理。结果与结论目前RNA干扰技术已广泛应用于HIV复制周期中的多个环节。RNAi不但可以靶向HIV基因组,而且可以通过降低多个与HIV复制密切相关且宿主非必需性的细胞因子的表达达到抑制HIV的目的。RNAi在抗HIV领域的广泛应用,必将成为解决病毒耐药性的问题、进而攻克艾滋病的有力武器。     

RNA干扰研究波形蛋白在肝癌细胞增殖中的 作用及不同中医治法的调节

目的:观察不同中医治法对大鼠肝癌波形蛋白(vimentin,VIM)表达的调控差异,以及VIM在人肝癌细胞增殖中的作用。方法:将84只雄性Wistar大鼠随机分为正常组、模型组以及实验组,除正常组外均采用二乙基亚硝胺(DEN)诱发大鼠肝癌,实验组分别经中药健脾益气、清热解毒、活血化瘀等治疗,检测各组大鼠肝癌组织(正常组取肝组织)VIM表达的差异;根据人VIM基因编码区设计2个siRNA靶点,并将构建好的重组质粒转染SMMC-7721人肝癌细胞株,Realtime-PCR检测转染前后该基因的表达差异,MTT法检测转染前后细胞生长增殖情况。结果:芯片结果显示,VIM基因在大鼠肝癌形成后表达显著增加(模型组芯片读数为正常组10倍以上),健脾和活血治法明显下调其表达;采用MTT法筛选到一个VIM基因RNA干扰有效靶序列,脂质体转染144 h后细胞的生长增殖得到了明显的抑制;实时荧光定量PCR检测表明,转染72 h后该基因的表达量明显降低(转染效率为50%)。结论:肝癌细胞恶性增殖有赖于VIM基因的高表达,健脾和活血方药能显著下调该基因表达。     

小分子干扰RNA用于基因治疗的研究进展

 目的介绍小分子干扰RNA(siRNA)在基因治疗领域的研究进展。方法查阅国内外相关文献,进行分析、归纳和综述。结果siRNA用于基因治疗具有独特的优势,虽然还处于起步阶段,仍存在一些实际应用方面的问题,但随着研究的深入,这些问题正在或将被认识和解决。结论siRNA为基因治疗开辟了新的道路,具有广阔的应用前景。     

RNA干扰在抗HIV感染中的研究进展

 目的　综述近年来RNA干扰在抗HIV感染的研究进展。方法　检索国外最新发表的代表性研究论文,并对试验结果进行分析、归纳。结果与结论　利用RNA干扰这一自然存在的、进化保守的抗病毒感染机制,以防疗HIV等病毒感染已成为新的研究热点,并取得了有希望的基础研究成果。在未来,有望成为抗HIV等病毒感染的有效方法。     

RNA干扰及其在药用植物代谢工程中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是把双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)导入某些生物和细胞而引起同源mRNA降解的现象,是一种转录后基因沉默机制。dsRNA在体内被Dicer二聚体切割成21～25bp的小干涉RNA(smallinterfering RNA,siRNA),然后在siRNA引导下,由RNA诱导沉默复合体(RN Ainduced silencing complex,RISC)降解靶mRNA。RNA干扰作为一种新型反义技术可以有效的抑制特异基因的表达,因此可用于对药用植物次生代谢产物的生物合成途径进行调控,达到调控天然产物生物合成的目的。现将RNAi机制研究的最新进展及RNAi在药用植物代谢工程方面的应用进行综述。     

RNAi技术的应用

RNA干扰（RNA interference, 缩写为RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA 诱发的基因沉默现象,其机制是通过分子生物学上由双链RNA 诱发的基因沉默现象,其机制是通过阴碍行定基因的翻译或转录来抑制基因表达.     

原代皮质神经元的转染及RNA干扰

目的：探讨成功转染原代神经元的方法,为有效利用RNA干扰技术（RNAi）技术研究、治疗中枢神经系统疾病奠定基础。方法：取新生sD鼠皮质神经元,采用Amaxa Nucleofector？技术将外源GFP表达质粒PEGFP—C1vector转染进原代皮质神经元,在荧光显微镜下观察转染效率;同时还将干扰GFP的siRNA转染进原代皮质神经元,通过观察GFP荧光的变化,来探讨原代神经元内的RNAi现象。结果：在Amaxa Nucleofector？转染技术和转染体系下,PEGFP—C1 vector可有效进入原代皮质神经元并进行表达,当共转染特异性siRNA时可呈现出明显的基因干扰现象。在此过程中神经元没有明显的神经毒性反应。结论：Amaxa Nucleofector技术是一种有效转染原代皮质神经元的方法。该方法解决了以往传统转染方法不能有效转染原代神经元的难题,从而为进一步利用原代神经元研究中枢神经系统疾病提供了良好的技术支持。     

RNA干扰抑制生存素基因对肝癌细胞凋亡的影响

目的将生存素(survivin)基因特异性小干扰性RNA(smallinterferingRNA,siRNA)直接转染肝癌hepG2细胞系,观察其对肝癌细胞survivinmRNA水平及细胞凋亡的影响。方法合成survivin特异性的siRNA序列1、序列2和对照序列,通过Lipofectamin2000进行直接转染。试验细胞随机分为4组,第1组为空白对照组,第2组以对照序列进行转染,第3组以序列1进行转染;第4组以序列2进行转染。转染后48h,通过半定量RT-PCR的方法检测survivinmRNA的水平。转染后72h,通过流式细胞仪检测各组的细胞凋亡指数。结果转染后48h,1组、2组、3组、4组survivinmRNA相对表达率(%)分别为:48.5±10.5、43.4±6.4、34.5±8.6、23.7±6.2(P1:3、P1:4、P2:4、P3:4均<0.05)。转染后72h,1组、2组、3组、4组细胞凋亡指数(%)分别为:10.7±3.1、11.8±3.5、15.9±3.5、18.6±3.2(P1:3、P1:4、P2:3、P2:4均<0.05)。结论survivin特异性siRNA直接转染肝癌细胞可抑制survivinmRNA的表达,促进肝癌细胞凋亡的发生。     

RNAi检测IFRD1在肝癌增殖中的作用及不同中医治法的调节

目的：观察不同中医治法对大鼠肝癌干扰素相关发育调节因子1（IFRD1）表达的调控差异,以及IFRD1 在人肝癌细胞增殖中的作用。方法：（1）采用二乙基亚硝胺（DEN）诱发大鼠肝癌,分别经中药健脾益气、清热解毒、活血化瘀等治疗后,Affymetrix rat 230A GeneChip arrays 检测肝癌组织IFRD1 表达的差异;（2）设计3 个人IFRD1 基因siRNA 靶点,将重组质粒电转入SMMC-7721 人肝癌细胞株,MTT 法检测细胞生长增殖情况、Realtime-PCR 检测该基因的表达差异。结果：（1）芯片结果显示,IFRD1 基因在大鼠肝癌形成后表达显著增加,不同中医治法对其具有不同程度的下调作用,其中活血化瘀治法下调作用较明显,对照西药化疗反而具有上调作用;（2）采用MTT 法筛选到1 个IFRD1基因RNA 干扰有效靶序列,转染144h 后细胞的生长增殖得到了明显的抑制（与阴性对照组相比,P<0.01）;（3）实时荧光定量PCR 检测表明,转染72h 后该基因的表达明显降低。结论：SMMC-7721 肝癌细胞恶性增殖有赖于IFRD1 基因的高表达,而中药活血化瘀治法对其具有下调作用。     

RNA干扰bcl-2基因质粒载体的构建

目的:构建bcl-2基因的RNA干扰(RNAi)表达载体。方法:根据人bcl-2的基因序列设计短双链3条,人工合成后,连接到带增强型绿色荧光蛋白基因的pGenesil-1载体中,构成3个靶向bcl-2的重组质粒,经酶切、DNA序列测定鉴定,转人HepG-2细胞,观察绿色荧光蛋白表达情况,以确定靶向bcl-2重组质粒进行下一步研究。结果:成功构建了3个靶向bcl-2的shRNA表达载体,为下一步研究奠定基础。结论:靶向shRNA表达载体较其它形式的干扰RNA具更强烈的抑制同源基因表达的作用。     

端粒酶逆转录酶小干扰RNA对胰腺癌Capan-2细胞抑制作用的实验研究

目的探讨RNA干扰（RNAi）对胰腺癌Capan-2细胞人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的抑制效应。方法化学合成靶向于hTERT基因的4个小分子干扰RNA（siRNA）序列,用阳离子脂质体为载体转染Capan-2细胞,分为siRNAl～SinRNA4、siRNA阴性对照和空白对照6组。通过RT—PCR和蛋白质印迹法分别检测胰腺癌细胞转染后细胞hTERTmRNA和蛋白水平,并用MTS法检测细胞生长增殖。结果siRNA1—siRNA4组hTERTmRNA相对表达量分别为0．51±0．22,0．56±0．19,0．44±0．13和0．89±0．21,端粒酶相对活性分别为0．60±0．15,0．63±0．16,0．17±0．12和0．72±0．16,hTERT蛋白相对表达量分别为0．47±0．21,0．52±0．19,0．10±0．11和0．84±0．15,其中siRNA1～siRNA33组的hTERTmRNA表达量、端粒酶活性和蛋白表达量与空白对照组比较有显著性差异（P均〈0．05）。siRNA1～siRNA44组Capan-2细胞在转染后48h时的细胞增长平均抑制率分别为50％,54％,63％和18％。不同siRNA序列对capan-2的转染效率不同,其中siRNA3组能显著下调hTERTmRNA和蛋白的表达水平,并能抑制端粒酶活性和促进Capan-2细胞凋亡,与空白对照组比较均有显著性差异（P均〈0．01）。结论靶向hTERT的RNAi能明显抑制capan-2细胞的增殖,hTERT可作为胰腺癌基因治疗的靶点。     

MTs在肝癌发生和发展中的作用及中医药防治机制

本文简要综述了近十多年来,本项目组探索金属硫蛋白家族（Metallothioneins,MTs）在肝癌发生与发展中的作用及其中医药防治机制。研究发现,MTs对于肝癌细胞恶性增殖是必要的,在不同应激状态下肝癌细胞MTs表达会显著增加,MTs可能通过上调肝癌细胞核糖体蛋白等基因的表达发挥促进其恶性增殖的作用。MTs在肝癌细胞中的过表达,可能直接改变了细胞核内离子的平衡,并通过与多基因的相互作用,发挥促进肝癌细胞恶性增殖基因表达的作用。中医药防治肝癌常用治法方药可以不同程度地减轻和缓解由二乙基亚硝胺（Diethylnitrosamine,DEN）所造成的肝毒性和损伤作用,降低MTs表达,提示在肝脏保护、抑制其异常增生和肝癌发展方面十分重要。     

RNAi研究CK18在肝癌增殖中的作用及不同中医治法的调节

目的:观察不同中医治法对大鼠肝癌CK18表达的调控差异,以及CK18在人肝癌细胞增殖中的作用。方法:(1)采用DEN诱发大鼠肝癌,分别经中药健脾益气、清热解毒、活血化瘀等治疗后,检测肝癌组织CK18表达的差异;(2)设计2个人CK18基因siRNA靶点,将重组质粒电转入SMMC-7721人肝癌细胞株,MTT法检测细胞生长增殖情况、Realtime-PCR检测该基因的表达差异。结果:(1)芯片结果显示,CK18基因在大鼠肝癌形成后表达显著增加,不同中医治法对其具有不同程度的轻度调控作用,其中健脾益气治法下调作用较明显;(2)采用MTT法筛选到一个CK18基因RNA干扰有效靶序列,转染144h后细胞的生长增殖得到了明显的抑制;(3)实时荧光定量PCR检测表明,转染72h后该基因的表达已明显降低。结论:肝癌细胞恶性增殖有赖于CK18基因的高表达,目前常用治法对该基因的调控作用有限,因而该基因可望作为肝癌疗效筛选评价指标。     

RNAi研究肝癌侵袭转移相关基因进展

RNA干扰(RNAi)是存在于真核生物体内的一种阻断外源基因表达的自我防御体系,是由双链RNA介导的使与其互补的具有同源序列的单链RNA进行特异性的降解过程。近年来,国内学者将RNAi技术广泛应用于肝癌相关基因的功能研究,综述了RNAi技术研究与肝癌转移复发相关基因功能的进展。     

IFRD1基因表达下调对人肝癌细胞细胞株SMMC-7721基因表达谱的影响

目的 探讨IFRD1表达下调后人肝癌细胞SMMC-7721基因表达谱的改变.方法 采用脂质体lipo2000将构建的含目的基因shRNA的质粒转染入SMMC-7721细胞,并应用Affymetrix U133 plus 2.0 array基因芯片检测目的基因表达下调后,该细胞基因表达谱的变化.结果 RNA干扰抑制IFRD1基因表达后,基因芯片检测发现25476个基因中,表达量发生明显改变的有4221个(上下调大于等于1.5倍),上调的基因有1109个,下调的有3 112个;这些基因涉及到细胞周期、细胞凋亡、DNA复制等通路.结论 IFRD1基因表达下调后,人肝癌细胞SMMC-7721基因表达谱发生明显变化,与细胞生长增殖关系密切的细胞信号通路也发生了明显的改变.     

RNAi研究TrxR1在肝癌细胞增殖中的作用及不同中医治法的调节

目的观察不同中医治法对大鼠肝癌TrxR1表达的调控差异,以及TrxR1在人肝癌细胞增殖中的作用。方法将84只雄性Wistar大鼠随机分为正常组和模型组以及实验组,除正常组外均采用DEN诱发大鼠肝癌,实验组分别经中药健脾益气、清热解毒、活血化瘀等治疗,检测各组大鼠肝癌组织(正常组取肝组织)TrxR1表达的差异;设计2个人TrxR1基因siRNA靶点,将重组质粒通过脂质体转染入SMMC-7721人肝癌细胞株,MTT法检测转染前后细胞生长增殖情况、Real-time-PCR检测该基因的表达差异。结果芯片结果显示,TrxR1基因在大鼠肝癌形成后表达显著增加,益气健脾治法明显下调其表达;采用MTT法筛选到一个TrxR1基因RNA干扰有效靶序列,脂质体转染144 h后细胞的生长增殖得到了明显的抑制;实时荧光定量PCR检测表明,转染72h后该基因的表达量明显降低。结论肝癌细胞恶性增殖有赖于TrxR1基因的高表达,益气健脾方药能显著下调该基因表达。     

靶向VEGF—hTERT基因siRNA表达载体抑骨肉瘤生长的实验研究

目的：观察靶向VEGF-hTERT基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞增殖的影响和对裸鼠骨肉瘤生长的影响。方法：构RNA干扰腺病毒载体rA-hTERT和rAd-VEGF,单独和联合转染人骨肉瘤细胞系MG-63细胞后实时荧光定量PCR检测hTERT和VEGF基因表达情况,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;人骨肉瘤细胞系MG-63细胞于裸鼠成瘤后使用siRNA表达载体治疗,观察肿瘤的生长状况及组织病理学改变。结果：①转染后48h,rAd-hTERT对hTERT基因mRNA的抑制率约84%,对VEGF基因表达无明显抑制（P〉0.05）;rAd-VEGF对VEGF基因mRNA的抑制率约82%,对hTERT基因表达无明显抑制（P〉0.05）;rAd-hTERT-VEGF干扰组对hTERT基因表达抑制率约87%,VEGF基因表达抑制率约83%,联合干扰与单基因干扰相比,对hTERT-VEGF基因的表达抑制差异无显著性（P〉0.05）。②干扰组转染后l～6d均能促进细胞凋亡,联合干扰细胞凋亡率与单基因干扰细胞凋亡率相比,差异均有显著性（P〈0.05）。裸鼠实验中,基因组肿瘤的生长均受到明显抑制,且联合干扰组与单基因组比较有显著性差异（P〈0.05）。对骨肉瘤的肺转移联合干扰组有显著的抑制作用。结论：靶向VEGF-hTERT基因siRNA表达载体对骨肉瘤细胞系MG-63细胞和裸鼠骨肉瘤的生长及转移均有明显的抑制作用。     

沉默人p38MAPK基因表达的RNA干扰的逆转录病毒载体的构建

目的构建沉默人p38MAPK基因表达的RNA干扰的逆转录病毒表达载体。方法查找人p38MAPK cDNA序列,利用软件设计并合成能够形成互补双链并能转录出靶向人p38MAPK基因的短发夹状RNA的两条寡核苷酸序列,退火后连接至线性化载体pSIREN上,获得重组质粒pSIREN-p38MAPK,酶切和测序进行鉴定。结果双酶切重组质粒获得特定的酶切图谱,证实所合成核酸片段的正确重组;测序结果显示重组核酸片段序列与设计的序列完全相同。结论成功构建了沉默人p38MAPK基因的重组质粒pSIREN-p38MAPK。     

CD147基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建及序列分析

目的：利用RNA干扰（RNAi）技术,以CD147为靶基因,设计构建重组表达载体,并进行测序鉴定。方法：设计具有短发夹结构的一对DNA序列,经退火成互补双链,再克隆至载体pSilencer4．1-CMV neo构建重组表达载体,转化DHSa菌株,提取质粒行酶切鉴定后,并进行序列测定。结果：将合成的DNA序列退火后克隆到载体上,经酶切和测序鉴定确实为所需序列。结论：CD147靶向RNA干扰重组表达载体的构建成功,为肿瘤的基因治疗提供了可能。