DC-CIK对急性髓细胞白血病干细胞的杀伤作用

目的:研究树突状细胞(dendritic cell,DC)联合同源细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cell,CIK)对急性髓细胞白血病细胞株KG-1a中白血病干细胞(leukemic stem cell,LSC)的体外杀伤和诱导凋亡作用。方法:分离健康人外周血单个核细胞,贴壁细胞用GM-CSF和IL-4诱导培养DC,悬浮细胞用IL-2、IL-1、IFN-γ和CD3 mAb诱导培养CIK。将KG-1a细胞冻融物作为抗原负载DC(即Ag-DC),与CIK共培养作为实验组(Ag-DC-CIK),无抗原负载的DC与CIK共培养作为对照组(DC-CIK),单独CIK作为空白对照组,与KG-1a共育后流式细胞术检测各组细胞中CD34+CD38-CD123+白血病干细胞的比例。DC-CIK与KG-1a细胞共培养,流式细胞术检测各组细胞中KG-1a细胞与CD34+CD38-CD123+细胞的凋亡率。结果:外周血单个核细胞成功诱导DC。CIK组、DC-CIK组及Ag-DC-CIK组中CD3+CD56+细胞比例为(17.36±4.44)%、(28.22±3.66)%和(36.16±5.88)%,依次升高(P<0.05)。与对照组相比,Ag-DC-CIK组与DC-CIK组细胞中CD34+CD38-CD123+细胞比例显著降低[(8.78±0.62)%vs(3.95±0.53)%、(3.03±0.62)%,P<0.01〗。DC-CIK可诱导KG-1a细胞凋亡,凋亡率由(2.34±0.74)%上升至(12.27±1.01)%,但对其中CD34+CD38-CD123+细胞无明显的诱导凋亡作用。结论:DC联合CIK能杀伤急性髓细胞白血病干细胞,但无明显的诱导凋亡作用。     

小鼠骨髓树突状细胞体外扩增与培养

目的:建立一种简便的体外扩增小鼠树突状细胞(DCs)的方法.方法:合应用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-4(IL-4)诱导培养小鼠骨髓单个核细胞分化为DCs.并从形态学、表型及功能方面对其加以检测.结果:体外诱导培养8 d后获得大量成熟的DCs.DCs表面具有典型的树枝状突起,并表达髓系DCs特异性表面分子CD11c(83.19%)、CD86(89.24%)及MHC-Ⅱ(95.25%),同时具有很强的刺激同种异基因混合淋巴细胞增殖的能力.结论:小鼠骨髓细胞体外诱导培养可生成大量功能成熟的DCs,为进一步抗肿瘤疫苗的研究奠定了基础.     

共培养的树突细胞和CIK细胞对肺癌的体内外抑癌作用

背景与目的:细胞因子诱导的杀伤(cytokine-inducedkiller,CIK)细胞是高效的肿瘤杀伤细胞。树突细胞(dendriticcells,DCs)是体内最强的抗原递呈细胞,并且能够提高效应细胞的抗瘤活性。本实验将DCs和CIK细胞共培养观察DCs对CIK细胞的细胞表型、增殖活性及体内外的抗肺癌作用的影响。方法:从健康人外周血单个核细胞中常规诱导出DCs、CIK细胞后,将DCs和CIK细胞按1∶10比例共培养5天获得DC-CIK细胞。流式细胞仪测DC-CIK细胞表型变化,3H-TdR掺入法测定其体外的细胞毒活性,并用肺腺癌细胞株A549建立裸鼠模型观察DC-CIK体内的抗肿瘤效果。结果:在培养第14天,DC-CIK细胞与单独CIK细胞培养组相比,增殖速率提高[(17.0±1.8)倍vs.(10.9±2.0)倍,P<0.05],CD3 CD56 表达水平明显上调[(36.0±4.2)%vs.(25.7±2.9)%,P<0.05],同时对A549细胞的细胞毒活性明显增强(P<0.05)。裸鼠体内实验表明,接种肺癌细胞51天后DC-CIK组、CIK组的抑瘤率分别为62.9%、41.5%,与对照组相比DC-CIK组及CIK组均抑制裸鼠皮下移植瘤的生长(P<0.01),且DC-CIK组与CIK组抑瘤效应差异有统计学意义(P<0.05)。结论:DCs与CIK细胞共培养可使CIK细胞获得更高的增殖活性和更强的抑癌作用。     

盐酸吉西他滨对非小细胞肺癌患者骨髓CD34+造血细胞的毒性研究

目的 探讨非小细胞肺癌患者骨髓CD34+前体造血细胞在细胞毒药物盐酸吉西他滨诱导下,发生细胞凋亡情况及DNA损伤修复信号通路上相关基因表达的变化.方法 采用免疫磁珠法分选出80例非小细胞肺癌患者骨髓单个核细胞中的CD34+细胞,并应用流式细胞术检测其纯度.用盐酸吉西他滨(终末浓度为10μg/ml)诱导CD34+细胞凋亡,检测诱导不同时间点的细胞凋亡率的差异.提取细胞RNA,利用基因芯片技术,将药物诱导前后的CD34+细胞在DNA损伤修复信号通路的相关基因表达情况进行检测,并分析比较.结果 80份骨髓样本CD34阳性率为(6.06±1.61)%;TNM分期不同的患者样本间CD34的表达无统计学差异,P>0.05.免疫磁珠法分选后,流式细胞术检测CD34+细胞的纯度为(88.63±7.29)%;CD34+细胞在经过盐酸吉西他滨诱导0 h、4 h、8 h、12 h后,凋亡率分别为(5±1.37)%、(18±4.76)%、(39±8.15)%、(56±9.64)%,各时间点细胞的凋亡率之间有统计学差异,P<0.05.基因芯片结果显示,骨髓CD34+细胞在盐酸吉西他滨诱导凋亡0 h与诱导12 h后相比,表达差异2倍以上的基因有13种,其中9种基因表达是升高的,4种基因表达降低.结论 盐酸吉西他滨可以诱导非小细胞肺癌患者骨髓前体CD34+细胞发生凋亡,随着药物作用时间延长,细胞凋亡率上升;DNA损伤修复系统中,部分基因表达水平出现变化.     

GPC3基因转染的树突状细胞对人肝癌HepG2细胞杀伤作用的观察

目的:以GPC3基因转染人外周血单个核细胞来源的树突状细胞(DCs),诱导CTL产生特异性抗肝癌免疫.方法:从HLA-A2正常健康成人外周血分离单个核细胞,经GM-CSF和IL-4诱导产生DCs;通过脂质体转染法将携带人GPC3基因的质粒pEF-hGPC3转染DCs,蛋白质印迹法检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3表达,流式细胞仪检测DCs表型的变化;MTT法检测DC诱导CTL对人肝癌细胞HepG2的特异性杀伤.结果:经细胞因子诱导产生了具有典型形态学的DCs,经肿瘤坏死因子-α(TNF-α)刺激成熟后可高表达CD80、CD86及CD83,而转染GPC3基因对协同刺激因子在DCs中的表达的影响并不显著.转染GPC3基因后,DCs可促进CTL特异性杀伤HepG2细胞,在不同效靶比的杀伤率:100∶1为(38.90±0.95)%,50∶1为(30.83±1.24)%,10∶1为(20.84±0.65)%,明显高于空载体组和对照组,P＜0.05.结论:GPC3基因转染人外周血单个核细胞来源的DCs可诱导和促进CTL特异性杀伤肝癌细胞HepG2作用,为治疗肝癌提供了新的免疫靶点.     

热激胃癌细胞外泌体致敏DC诱导显著的抗肿瘤免疫反应

目的:探讨热激胃癌细胞来源外泌体致敏树突状细胞(dendritic cells,DCs)诱导的肿瘤特异性细胞毒T细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)反应.方法:制备小鼠前胃癌细胞(murine foregastric cancer cells,MFC)来源外泌体(Exo)、热激MFC细胞来源外泌体(Exo/HS)及MFC细胞冻融抗原(lysates,Lys),通过电镜观察外泌体的形态,Western blotting检测外泌体的成分.培养小鼠骨髓来源的DCs,将Exo/HS、Exo和Lys冲击致敏DCs,制备的DCs瘤苗分别命名为DC-Exo/HS、DC-Exo和DC-Lys.HSP70小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)转染MFC细胞,热激后分离上清,用制备外泌体致敏DCs,流式术检测DCs的表型.以DC-Exo/HS、DC-Exo、DC-Lys、DC和PBS免疫小鼠,3H-TdR法检测脾脏T细胞的增殖,LDH法检测脾细胞CTL活性.建立MFC细胞荷瘤小鼠模型,观察各组DCs瘤苗的免疫治疗效应.结果:电镜确认外泌体为膜性小囊泡.Western blotting检测表明,Exo/HS含有高水平的HSP70,流式术发现热激MFC细胞来源外泌体能显著上调DCs表面MHC-Ⅱ、CD80、CD86和CD40分子的表达,HSP70 siRNA干扰能下调热激MFC细胞来源外泌体刺激的DCs表面MHC-Ⅱ、CD80、CD86和CD40分子的表达.3H-TdR检测结果显示DC-Exo/HS刺激T细胞增殖的能力显著强于DC-Exo、DC-Lys、DC和PBS组(均P＜0.01),LDH检测结果表明DC-Exo/HS诱导的CTL活性显著高于DC-Exo、DC-Lys、DC和PBS组(均P＜0.01),HSP70 siRNA组诱导的CTL活性显著低于对照siRNA组(P＜0.01).免疫治疗结果显示,DC-Exo/HS对荷瘤小鼠的肿瘤抑制效应显著优于其他各组(P＜0.01).结论:热激胃癌细胞来源外泌体致敏的DCs能诱导显著的抗肿瘤免疫反应.     

儿童B系急性淋巴细胞白血病体内两类树突状细胞的检测及其意义

目的:通过检测B系急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿外周血(PB)和骨髓(BM)中髓系树突状细胞(mDC)即CD11C+DC和浆细胞样DC(pDC)即CD123+DC的比例,探讨两类DC在儿童B-ALL发病时和缓解后的分布及临床意义.方法:选取B-ALL儿童20例、PB正常对照20例及BM正常对照16例,流式细胞仪检测患儿初诊、治疗第33天PB和BM中CD11C+DC和CD123+DC2亚群的比例.观察两类DC在B-ALL患儿治疗前后、BM和PB中的分布情况.结果:B-ALL患儿初诊PB和BM中CD123+、CD11C+比例与正常对照相比明显下降,P<0.001;动态观察同一ALL患儿在治疗后PB和BM中CD123+、CD11C+DC比例明显上升,P<0.01;治疗后PB和BM中CD123+DC比例与正常对照相比略低,仅PB差异有统计学意义,t=2.036,P=0.049;对不同部位样本(BM和PB)的DC比例检测进行比较,发现治疗后PB的CD123+比例较BM低,差异有统计学意义,t=-2.539,P=0.02.结论:B-ALL儿童初诊时体内mDC和pDC水平显著下降,经治疗后明显上调,尤其是mDC亚群;与正常儿童相比,治疗第33天时pDC的水平较低.同时检测BM和PB样本中的DC亚群比单纯PB或BM检测更能反映机体内DC的水平.     

凋亡肿瘤细胞致敏的树突状细胞疫苗治疗肺癌的实验研究

目的：用凋亡肿瘤细胞致敏的树突状细胞（dendritic cells，DCs）激发肿瘤抗原特异性的细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）活性，观察其体内外抗肺癌的特性。方法：常规方法从健康人外周血单个核细胞中诱导DCs，采用或不采用凋亡肿瘤细胞负载DCs，并利用激发型CD40单克隆抗体（CD40mAb）诱导DCs成熟；成熟DCs与自体T细胞共育，分别获得Ag-CTL及non-Ag-CTL，流式细胞仪检测Ag-CTL细胞表型的变化；^3H-TdR掺入法测定DNA片段形成率；建立人肺癌细胞株A549荷瘤裸鼠模型，过继回输Ag-CTL和non-Ag-CTL，评价其在体内的抗肿瘤活性。结果：CD40mAb激发可使DCs上调CD1a、CD80、CD86、CD83、HLR-DR的表达；凋亡肿瘤细胞负载联合CD40mAb激发可进一步促进DCs的成熟；成熟DCs和自体的T细胞共育活化后CD8^＋T细胞明显上调；Ag—CTL对A549具有高效特异的杀伤力，明显强干Ag-CTL对肝癌细胞株HepG2的作用（P〈0．01），且Ag-CTL对A549的杀伤力明显强于non—Ag-CTL（P〈0．01），而non-Ag-CTL对A549及HepG2细胞的杀伤力无显著性差异；体内实验表明，Ag-CTL可有效抑制裸鼠皮下移植瘤的生长，与生理盐水组（NS组）、non-Ag-CTL组相比在统计学意义上有显著差异（P〈0．05），non-Ag-CTL组与NS组相比在统计学意义上有差异（P〈0．05）。结论：凋亡肿瘤细胞致敏的树突状细胞疫苗激发的Ag—CTL在体内外均呈现抑制肺癌细胞的特性。     

CD 40激发肿瘤抗原特异性DCs对CIK细胞生物学活性的影响

目的:研究CD40激发凋亡肿瘤细胞致敏的树突状细胞(dendritic cells,DCs)对细胞因子诱导杀伤(cytokine-inducedkiller,CIK)细胞的细胞表型、增殖活性及细胞毒活性的影响。方法:常规方法从健康人外周血单个核细胞中诱导DCs和CIK细胞,采用凋亡肿瘤细胞负载DCs,并用或不用激发型CD40单克隆抗体(CD40mAb)激活DCs成熟;成熟DCs与同源的CIK细胞共育5d,分别获得DC40Ag-CIK细胞及DCAg-CIK细胞;观察细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞表型;酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)法检测细胞培养上清液中IFN-γ的含量;[3H]-TdR掺入法测定细胞杀伤活性。结果:凋亡肿瘤细胞负载激发可使DCs上调表达CD1a、CD80、CD86、CD83、HLR-DR,联合CD40mAb激发可进一步促进DCs成熟;培养至第14天时,DC40Ag-CIK细胞、DCAg-CIK细胞、CIK细胞分别扩增(18.2±1.7)倍、(15.0±1.2)倍、(9.3±1.8)倍;DC40Ag-CIK细胞中的CD3 CD56 比例较DCAg-CIK细胞和CIK细胞明显上调(P<0.05);DC40Ag-CIK细胞、DCAg-CIK细胞对A549杀伤活性强于CIK细胞(P<0.05),并且DC40Ag-CIK细胞强于DCAg-CIK细胞(P<0.05);CIK细胞、DCAg-CIK细胞、DC40Ag-CIK细胞培养上清液中IFN-γ的含量递增,分别为(1494.7±246.3)pg/mL、(2706.3±197.0)pg/mL、(3676.3±335.0)pg/mL。结论:与单独凋亡肿瘤细胞负载的DCs相比,CD40激发的凋亡肿瘤细胞负载的DCs可进一步提高CIK细胞的增殖活性及细胞毒活性。     

全反式维甲酸诱导荷瘤裸鼠EC9706食管癌细胞凋亡的机制

目的 探讨全反式维甲酸(ATRA)诱导荷瘤裸鼠EC9706食管癌细胞凋亡的作用机制.方法 将食管癌EC9706细胞接种于裸鼠,成瘤后将裸鼠分为ATRA作用组、5-氟尿嘧啶(5-Fu)作用组、联合用药组和空白对照组,每组10只,腹腔内连续给药10 d后处死裸鼠.采用原位末端标记(TUNEL)法,检测各组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡情况.采用免疫组化SP法和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),检测caspase-3和survivin蛋白及mRNA的表达水平.结果 ATRA作用组、5-Fu作用组和联合用药组的细胞凋亡率分别为44.3%、39.7%和91.0%,均明显高于空白对照组(0.7%,均P＜0.01).空白对照组caspase-3蛋白表达水平为46.12±0.33,caspase-3 mRNA的相对表达量为0.14±0.03,均显著低于ATRA作用组、5-Fu作用组和联合用药组(P＜0.05).空白对照组survivin蛋白表达水平为96.07±0.13,survivin mRNA的相对表达量为0.84±0.04,均显著高于ATRA作用组、5-Fu作用组和联合用药组(均P＜0.05).ATRA作用组与5-Fu作用组的细胞凋亡率、caspase-3和survivin蛋白及mRNA的表达差异均无统计学意义(均P＞0.05),但单药组与联合用药组的差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 ATRA可诱导荷瘤裸鼠EC9706细胞产生凋亡,其作用机制与下调survivin蛋白和mRNA的表达以及上调caspase-3蛋白和mRNA的表达有关.