盐析法快速提取口腔拭子DNA

目的建立盐析法快速从口腔拭子中提取基因组DNA的方法。方法首先以细胞裂解液和蛋白酶K消化口腔上皮细胞,然后用5 mol/L NaCl沉淀蛋白质,用异丙醇沉淀DNA,最后用70%乙醇洗涤得到的DNA并将其溶于TE(10mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,pH 8.0)中。用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对TP53基因的rs1042522和CHRNA3基因的rs12910984位点进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果单支口腔拭子提取得到的DNA量在0.68～2.56μg之间,D260/D280比值在1.77～1.94之间。经PCR扩增和酶切消化,10个样本的两个单核苷酸多态性都得到了清楚分型。酶切结果与测序结果吻合。结论本实验所建立的盐析法可以快速、简便、经济地从口腔拭子得到高质量的基因组DNA。     

一种从口腔拭子中提取DNA的简易方法

目的应用简便方法提取口腔拭子中DNA,并用特异引物扩增,评估该方法的应用价值。方法用1×PCR缓冲液、MgCl2及蛋白酶K混合裂解液在PCR仪上对口腔拭子进行消化,并以该产物为模板,应用角蛋白5基因1号外显子及1号染色体上2个微卫星标记特异性引物扩增,目的片段分别用于测序和毛细管电泳。结果通过上述方法可获得用于PCR反应及后续基因测序及微卫星标记毛细管电泳分型的足量DNA。结论利用PCR缓冲液、MgCl2及蛋白酶K混合裂解液从口腔拭子中提取DNA是一种简单、高效、快速、低成本的方法,更是一种无创的采样方法。     

HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法的建立

目的建立一种简便、准确、实用的乙型肝炎病毒(HBV)耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法.方法根据已公布的HBV DNA序列,在HBV多聚酶基因区设计并合成了两对寡核苷酸引物,其中一只为错配引物;应用巢式错配聚合酶链反应特异性扩增含有HBV多聚酶基因YMDD基序的片段,扩增产物用限制性内切酶(Nde Ⅰ)酶切,琼脂糖凝胶电泳,观察酶切后的目的片段限制性片段长度多态性(RFLP)图谱.部分标本进行DNA测序.结果 (1)所建立的巢式错配PCR-RFLP方法操作简便,快速,从DNA提取到酶切后电泳分析仅需要11小时;灵敏度高,可以检测到103copies/ml的HBV DNA;特异性强,结果准确,经DNA测序证实.(2)应用该方法对20例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者的系列血清进行了检测,发现YMDD变异者(45%)9例,YMDD野毒株者(55%)11例,表明该方法可有效地鉴别HBV YMDD野毒株与变异株.结论本实验所建立的巢式错配PCR-RFLP方法简单、敏感、特异,适合于一般实验室应用及大规模的人群调查.     

改良的碱裂解法提取动物细胞附加体DNA

目的 利用一种快速、简便的方法 提取动物细胞附加体DNA.方法 通过电转移的方法介导pEGFP-N1转染小鼠成纤维细胞NIH3T3和中国仓鼠卵巢癌细胞CHO等细胞系.转染后48 h,收集转染细胞.用STET缓冲液重悬细胞,加入碱裂解液裂解细胞,再用7.5 mol/L醋酸胺中和.离心收集上清,用1∶1酚/氯仿抽提2次,氯仿抽提1次,乙醇沉淀附加体DNA.TE溶解DNA.提取的DNA通过PCR和southern blot方法进行分析.结果 PCR和Southem blot结果证实利用改良的碱裂解法可以从动物细胞提取附加体DNA.结论 利用简便快速的碱裂解法可以提取哺乳动物细胞附加体DNA.     

人胎脑NT-4基因的体外构建

目的 体外构建人神经生长因子-4(neumtrophin-4,NT-4)与质粒载体pEGFP-N1(卡那霉素抗性)的重组体,为后续的转基因移植治疗脊髓损伤创造条件.方法 用Trizol法提取人胎脑组织总RNA,经RT-PCR扩增,EorR I和BamH I核酸内切酶酶切电泳纯化获得人神经营养因子-4(NT-4)DNA.用含质粒载体pEGFP-N1DNA的大肠杆菌接种经划板,挑选菌落、振荡培养,并用碱裂解法提取质粒载体pEGFP-N1DNA,经酶切、电泳纯化后,通过连接、转化感受态细胞,DNA小量提取法获得NT-4目的基因与质粒载体pEGFP-N1 DNA的重组体,经DNA测序证实.结果 用上述方法成功获得NT-4-pEGFP-N1重组体.结论 此方法是一种体外构建人胎脑NT-4基因的成熟、稳定而有效的方法,可为后续的神经干细胞转染NT-4基因移植治疗神经系统损伤创造条件.     

延边朝鲜族低密度脂蛋白受体基因PvuⅡ多态位点的研究

[目的 ]研究延边朝鲜族人群低密度脂蛋白受体基因内含子 15PvuⅡ多态性位点的存在和等位基因频率 ,以探讨该群体的遗传结构及遗传背景 .[方法 ]按酚 /氯仿抽提法提取基因组DNA ;用聚合酶链反应 限制性片段长度多态性技术从人类外周血基因组DNA中分离到一个长约 810bp的片段 ,采用Dynabeads固相单链分离直接测序法测定 ,证明分离的片段是否是低密度脂蛋白受体基因内含子 15 ;用限制性内切酶PvuⅡ酶进行酶切 ,进行琼脂糖凝胶电泳 ,在凝胶自动成像系统紫外线检测仪上观察酶切结果 .[结果 ]延边朝鲜族人群低密度脂蛋白受体基因存在PvuⅡ多态性 .12 0名朝鲜族中无酶切位点的纯合个体 92例 ,基因型 (P-P-)频率为 76 6 % ;有酶切位点的杂合个体 2 0例 ,基因型 (P+ P-)频率为16 7% ;有酶切位点的纯合个体 8例 ,基因型 (P+ P+ )频率为 6 7% .2 4 0个低密度脂蛋白受体等位基因中PvuⅡ酶切位点基因 (P+ )的出现频率为 15 % .[结论 ]延边朝鲜族人群低密度脂蛋白受体基因也存在PvuⅡ多态性位点 ,说明PvuⅡ多态性特点可以作为延边朝鲜族的遗传标记 .     

阿尔茨海默病患者的神经型尼古丁受体α7亚单位基因多态性

目的：探讨散发性阿尔茨海默病（Spordic alzheimer disease,SAD）患者神经型尼古丁受体α7亚单位（CHRNA7）基因多态性情况。方法：用聚合酶链式反应-温度梯度凝胶电泳（PCR-TGGE）和DNA测序技术,分析12例SAD病人CHRNA7基因全部10个外显子及其两侧的部分内含子基因序列。结果：在CHRNA7基因上发现1个新的突变位点,即在外显子7附近的内含子7上的117643＋GTG三碱基插入突变,未发现任何已报道的多态性位点。结论：SAD患者的CHRNA7基因多态性与其它人群可能有差异。     

pUHD10-3-p53质粒的扩增及分离纯化

目的:建立一种确实有效的pUHD10-3-p53质粒提取方法,为科学研究制备高纯度pUHD10-3-p53质粒奠定基础.方法:将克隆有Wt-p53基因的eDNA质粒(pUHD10-3-p53)转染感受态细菌E.coli DH5a菌株.经扩增,用小量碱裂解法提取质粒DNA,再纯化后,用紫外分光光度计测定其含量,并进行酶切电泳鉴定.结果:pUHD10-3-p53质粒用限制性内切酶BamH Ⅰ酶切后在1.5%琼脂糖凝胶中电泳,可观察到3.15、1.8 kb两条区带.结论:用小量碱裂解法提取pUHD10-3-p53质粒,效率高,质量稳定,得到的质粒DNA的质量与纯度均符合实验要求.     

中枢型尼古丁胆碱能受体α4外显子5多态性与阿尔茨海默病的关联

目的:探讨散发性阿尔茨海默病(SporadicAlzheimerdisease简称SAD)和中枢型尼古丁胆碱能受体α4亚单位(CHRNA4)外显子五基因多态性的关联关系。方法:用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)和DNA测序技术分析23例SAD病人及30例正常人的CHRNA4基因的外显子五序列。结果:在CHR-NA4的外显子五上发现3个多态性位点:G1478A(χ2=0.24,P>0.05);A1374G(χ2=0.24,P>0.05);T1344C(χ2=0.24,P>0.05)。由统计学结果得出该3个多态位点在病例组与对照组之间没有差异。结论:在CHR-NA4外显子五上发现的3个多态性位点与阿尔茨海默病(AD)的发病可能不存在相关关系。     

神经型烟碱乙酰胆碱受体α7亚单位基因多态性与精神分裂症的关联研究

目的:探讨神经型烟碱乙酰胆碱受体α7亚单位基因(CHRNA7)多态性与精神分裂症的关系。方法:采用聚合酶链反应及聚丙烯酰胺凝胶芯片技术检测精神分裂症患者(223例)与正常对照者(98例)CHRNA7基因3个(rs2337980、rs1909884、rs883473)单核苷酸多态性位点,并对分型结果进行测序鉴定。结果:两组rs1909884基因型及等位基因频率分布差异有统计学意义(P<0.05),对照组有较多的变异等位基因T。结论:CHRNA7基因rs1909884多态性可能与精神分裂症有关联,其等位基因T可能是精神分裂症的保护性因子。     

Chelex-100法从颊粘膜拭子提取DNA 进行基因型分析的研究

目的：探讨采用Chelex-100法从颊粘膜拭子提取DNA这一方法的有效性和可靠性。方法：用棉签刮取130例个体口腔颊粘膜脱落细胞，采用Chelex-100法从颊粘膜拭子中提取DNA，采用SSP—PCR及PCR—PFL，P法对其进行检测，观察结果的有效性和可靠性。结果：所有样本中都获得成功。电泳结果显示，PCR扩增及酶切的靶带清晰，无非特异性杂带，扩增结果重复性好。结论：采用Chelex-100法从颊粘膜拭子提取DNA，方法稳定可靠，可以用于基因型检测。     

西帕依固龈液对牙龈炎患者遗传敏感性的研究

目的 :探讨西帕依固龈液对不同基因型携带者牙龈炎患者的敏感性。方法 :提取 74例牙龈炎患者颊粘膜拭子 ,用 Chelex- 10 0法提取 DNA,采用序列特异引物聚合酶链反应 (SSP- PCR)和聚合酶链反应 -限制性片段长度多态性 (PCR- RFL P)方法对牙龈炎患者 IL- 1A- 889位点进行基因型检测。结果:西帕依固龈液对 IL- 1A- 889等位基因 1携带者牙龈炎治疗效果优于等位基因 2携带者 ,但差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。相同的基因型携带者治疗前后龈沟出血指数 (SBI)差异有统计学意义 (P <0 .0 5 )。 结论:西帕依固龈液用于治疗牙龈炎安全、有效 ,值得临床推广使用。     

降落式PCR和SSCP检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体γ基因重排

目的 以降落式PCR和单链构型多态性(SSCP)方法检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体(TCR)γ基因重排,探讨其在淋巴细胞白血病诊断中的价值。方法 盐析法提取淋巴细胞白血病患者外周血白细胞DNA,TCR-γ基因重排通用引物和降落式PCR扩增基因重排。分别采用琼脂糖凝胶电泳、SSCP和DNA直接测序方法检测PCR扩增产物。阳性细胞系DNA模板与反应增生性淋巴组织DNA按不同比例混合后扩增,检测降落式PCR的灵敏度。结果 琼脂糖电泳中,18例T淋巴细胞白血病中有15例、4例B淋巴细胞白血病中有2例为阳性,阳性标本经SSCP进一步分析,呈不连续条带。DNA直接测序证实扩增产物为TCR-γ基因重排。阳性对照模板占1%以上时可得到阳性扩增结果。结论 TCR-γ基因重排通用引物结合降落式PCR可有效扩增T淋巴细胞白血病基因重排,可用于T淋巴细胞白血病的辅助诊断。     

降落式PCR和SSCP检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体γ基因重排

目的 以降落式PCR和单链构型多态性(SSCP)方法检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体(TCR)γ基因重排，探讨其在淋巴细胞白血病诊断中的价值。方法 盐析法提取淋巴细胞白血病患者外周血白细胞DNA，TCR-γ基因重排通用引物和降落式PCR扩增基因重排。分别采用琼脂糖凝胶电泳、SSCP和DNA直接测序方法检测PCR扩增产物。阳性细胞系DNA模板与反应增生性淋巴组织DNA按不同比例混合后扩增，检测降落式PCR的灵敏度。结果 琼脂糖电泳中，18例T淋巴细胞白血病中有15例、4例B淋巴细胞白血病中有2例为阳性。阳性标本经SSCP进一步分析，呈不连续条带。DNA直接测序证实扩增产物为TCR-γ基因重排。阳性对照模板占1％以上时可得到阳性扩增结果。结论 TCR-γ基因重排通用引物结合降落式PCR可有效扩增T淋巴细胞白血病基因重排，可用于T淋巴细胞白血病的辅助诊断。     

肿瘤坏死因子A-308基因型与重度慢性牙周炎的关系

目的 :探讨肿瘤坏死因子 (Tumor Necrosis Factor-α,TNF) A - 30 8位点基因多态性与重度慢性牙周炎易感性的关系。方法 :分别选取新疆伊犁地区哈萨克族 4 5例重度慢性牙周炎 (CP)患者、85例牙周健康 (或仅轻度牙龈炎 )对照者 ,收集其颊粘膜拭子 ,采用 Chelex- 10 0法提取 DNA,采用多聚酶链反应 -限制性片段长度多态性(PCR- RFL P)方法对其进行基因型检测 ,分析 CP患者与对照者之间基因型的分布情况。结果:TNFA- 30 8基因型在新疆伊犁地区哈萨克族重度慢性牙周炎组以及健康对照组之间的分布差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。 结论 :TNFA- 30 8基因多态性与重度慢性牙周炎无关。     

Leber遗传性视神经病相关的三种原发性线粒体突变的无创检测方法建立

目的：建立1种Leber遗传性视神经病（LHON）相关的3种原发性线粒体突变11778G＞A、14484T＞C和3460G＞A的无创检测方法。方法：研究对象为在温州医科大学附属眼视光医院就诊的3例（WZ1481、WZ1478、WZ1435）基因检测确定为m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变的LHON患者。采集3例LHON患者和2例野生型健康对照的静脉血样及口腔黏膜细胞样本,然后分别用手工法和试剂盒法提取全基因组DNA,分析比较2种样本、2种方法提取的DNA的纯度及浓度有无差别。最后以携带m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变的LHON患者和野生型的口腔黏膜细胞和外周血提取的全基因组DNA作为模板,通过PCR扩增分别包含以上3种突变的DNA片段,然后进行焦磷酸测序、斑点杂交和Southern blot分析PCR产物。结果：口腔黏膜细胞和血液提取的DNA浓度的差异无统计学意义（P＞0.05）。手工法提取的口腔黏膜细胞DNA纯度低于试剂盒法提取的口腔黏膜细胞和血液DNA的纯度,差异有统计学意义（P＜0.05）。口腔黏膜细胞提取的DNA产量与血液相似。DNA测序结果显示血液样本和口腔黏膜细胞样本具有很好的一致性,对照组均检测不到突变,而突变组可以检测到相应的突变。斑点杂交和Southern blot的结果也一致,对照组均为阳性而突变组均为阴性。结论：口腔黏膜细胞DNA可用于筛查和鉴定LHON的3个主要线粒体突变。本研究建立了一种方便、无创的方法来检测LHON相关的m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变。     

RANTES和Eotaxin-3基因单核苷酸多态性与儿童哮喘的关系

目的 研究趋化因子激活调节正常T细胞表达和分泌因子(RANTES)基因C-28G(RANTES C-28G)、RANTES A-403G及嗜酸性粒细胞趋化蛋白(Eotaxin-3)基因C+77T(Eotaxin-3 C+77T)的单核苷酸多态性(SNP)与汉族儿童哮喘的关系.方法 采集192例3-12岁汉族哮喘患儿(哮喘组)的口腔颊黏膜拭子,应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法对RANTES C-28G、RANTES A-403G和Eotaxin-3 C+77T的SNP位点进行检测,以与哮喘组患儿无血缘关系的192名健康志愿者(18～22岁)作为正常对照组.分析两组基因型及等位基因频率分布情况.结果 两组间RANTES C-28G和RANTES A-403G两个SNP位点的基因型分布比较,差异无统计学意义(P>0.05).两组间Eotaxin-3 C+77T基因型分布比较,差异有统计学意义;哮喘组Eotaxin-3 C+77T T/T纯合子基因型频率为32.3%,明显高于正常对照组的12.5%(OR=3.44,P=0.000).结论 Eotaxin-3 C+77T可能是汉族儿童哮喘易感SNP位点,其中Eotaxin-3 C+77T T/T纯合子基因型与哮喘发病密切相关.     

人咽拭子中肺炎嗜衣原体基因型的初步鉴定

目的了解中国咽部感染患者肺炎嗜衣原体(Cpn)的基因型。方法从中国不同城市收集疑为Cpn感染患者的咽拭子标本465份,巢式PCR扩增Cpn主要外膜蛋白基因(ompA)片段,其中包括4个变异区,对所得58份阳性标本进行ompA基因序列测序,对照Cpn参考株基因,根据同源性对这些临床株基因进行分型。结果从58份Cpn临床株标本中,检出CpnA、CpnB、CpnC、CpnD共4种基因型,14个基因变体,其中以C型最为常见(89.7%),其次依次为A型(5.2%)、B型(3.4%)、D型(1.7%)。结论在中国部分城市,Cpn存在CpnA、CpnB、CpnC、CpnD等4个基因型,其中以C型最为常见,呈现较大的多态性,可为其疫苗的研制提供重要的实验依据。     

2型糖尿病患者血清白介素10水平及其基因启动子592位点多态性与2型糖尿病的关系

目的 观察2型糖尿病患者血清IL-10水平及IL-10基因启动子592位点多态性与2型糖尿病易感性的关系.方法 选择224例2型糖尿病患者(DM组)和275例健康对照者(NC组).使用酶联免疫吸附法(ELISA)测定两组受检者血清IL-10水平;并从人体抗凝血白细胞中提取DNA,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)法分析IL-10-592基因多态性.结果 DM组血清IL-10水平为(21.1±5.2)pg/ml,对照组为(42.4±6.3)pg/ml,二者间差异有统计学意义(P＜0.01).DM组IL-10-592基因型频率分别为:纯合突变型(AA)36例(16.1%),杂合子(AC)122例(54.5%),野生型(CC)66例(29.4%);NC组:纯合突变型24例(8.7%),杂合子138例(50.2%),野生型113例(41.1%).DM组和NC组等位基因频率:A分别为43.3%和33.8%,C分别为56.7%和66.2%.两组IL-10-592基因型频率及等位基因频率间差异均有统计学意义(P＜0.01).结论 2型糖尿病患者血清IL-10水平显著低于健康者,IL-10可能对糖尿病发病及预后、保健、康复具有保护作用;IL-10基因启动子区592位点多态性可能与2型糖尿病的遗传易感性相关.     

DNMT3B基因启动子C46359T多态性与食管癌易感性的关联分析

目的:探讨DNMT3B基因启动子C46359T单核苷酸多态性与江苏汉族人群食管癌易感性的关系。方法:提取195例食管癌患者及189例健康体检人员外周血基因组DNA,采用PCR-RFLP结合DNA测序技术检测DNMT3B基因启动子C46359T单核苷酸多态性。结果:正常对照DNMT3B C46359T等位基因TT/CT基因型频率为98.9%/1.1%,病例组为97.9%/2.1%,在对照组与病例组中均未检测到DNMT3B 46359 CC基因型。携带DNMT3B 46359 CT等位基因的个体与对照组相比,其患食管癌的易感性未见明显升高(P=0.43,OR=1.96,95%CI:0.35~10.82)。对比江苏汉族人群和英国、美国白种人群,DNMT3B C46359T单核苷酸多态性频率分布有明显差异(P<0.01)。结论:DNMT3B基因C46359T多态性可能不适合作为中国汉族人群食管癌易感性的一个独立风险因素,此位点多态性的分布在不同人种间有显著差异。