新城疫病毒HN基因构建的核酸疫苗抗肿瘤作用研究

目的 :探讨HN基因在NDV抗肿瘤上发挥的作用。方法 :以pVAX1为表达载体构建了含NDVHN基因的pVHN核酸疫苗 ,以脂质体介导方法在体外转染OS732细胞 72h后 ,用 3,5 二羟基甲苯法测定OS732细胞膜唾液酸含量的变化。 6周龄BALB/c鼠左后肢皮下接种 2× 10 6个S180肿瘤细胞 ,分别于肿瘤接种后的第 7天 (肿瘤直径为 2～ 3mm)和第 17天瘤内注射 10 0 μg核酸重组体 ,同时设pVAX1对照组和单纯荷瘤对照组。荷瘤鼠经治疗后框窦采血 ,分离血清 ,测定血清唾液酸含量。取脾 ,采用FACS方法测定淋巴细胞亚群数量的变化。结果 :pVHN体外转染OS732细胞后 ,能显著降低细胞表面唾液酸含量 (P <0 .0 5 )。pVHN应用于荷瘤鼠显著降低血清中唾液酸含量 (P <0 .0 5 ) ,引起CD8+ T淋巴细胞亚群数量的增加 (P <0 0 5 )。结论 :单独HN基因在体外转染能够降低肿瘤细胞表面唾液酸含量 ,体内表达后引起T淋巴细胞亚群数量改变。     

新城疫病毒HN基因对肝癌细胞SMMC7721的细胞毒性研究

目的:探讨新城疫病毒HN基因对肝癌细胞SMNC7721的杀伤作用及其机制.方法:以脂质体介导方法在体外转染含新城疫病毒HN基因的质粒pVHN于细胞SMMC7721 24 h后,采用MTT法检测细胞活性;3,5-二羟基甲苯测定其唾液酸含量的变化;丫啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色,荧光显微镜观察细胞形态学改变;以及FCM检测病毒HN基因和HLA-A,B,C的表达.结果:体外转染pVHN能显著地降低细胞表面唾液酸含量(P＜0.05),有效地杀伤肿瘤细胞SMMC7721;荧光显微镜观察可见典型的细胞死亡形态学改变;实验组细胞与对照组比较HN表达差异显著,HLA-A,B,C表达上调.结论:HN基因在体外能够显著降低肿瘤细胞表面唾液酸含量,同时,使其高表达HN抗原,上调HLA-A,B,C表达,从而,可能增强了肿瘤细胞的抗原性和免疫识别,诱导了细胞SMMC7721死亡.     

新城疫病毒抗肿瘤的研究进展

新城疫病毒（newcastle disease virus，NDV）是一个典型副粘病毒科病毒，该病毒是一种有囊膜的病毒，核农壳被一个来源于细胞质膜的脂质膜包被。膜内侧是M蛋白、膜外侧是HN和F两个病毒糖蛋白，核衣壳内有L、NP、P三种结构蛋白包裹着的基因组RNA，核衣壳内的病毒基因组是负单链RNA，长约15kbt，95％以上是编码区，共编码6种结构蛋白和36kD、33kD非结构碱性蛋白，     

新城疫病毒用于联合抗肿瘤的研究进展

0 引言 近年来,应用溶瘤病毒抗肿瘤逐渐成为研究热点,如新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)、腮腺炎病毒、麻疹病毒等.NDV隶属副粘病毒科副粘病毒亚科的副粘病毒属,为不分节段的单股负链RNA病毒.NDV基因组编码6个结构蛋白:核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)、磷蛋白(phospho protein,P)、基质蛋白(matrix protein,M)、融合蛋白(fusion protein,F)、血凝素神经氨酸酶(haemagglutinin neuraminidase,HN)和大聚合酶蛋白(large polymerase protein,L);编码这些蛋白的基因按3'-NP-P-M-F-HN-L-5'的顺序依次排列,其中主要由F基因决定NDV的毒力.许多学者研究证明,NDV能够特异地杀伤肿瘤细胞,而对人类正常细胞没有杀伤作用,也有学者探讨了NDV与其他抗瘤方法的协同作用,现主要就此方面的研究综述如下.     

新城疫病毒抗癌作用及其应用的研究进展

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）为反义负链RNA病毒，能选择性的杀伤人类肿瘤细胞。应用NDV免疫肿瘤细胞进行各种体内外实验研究，均有不同程度的抗肿瘤效应。用NDV对癌症病人进行临床治疗则可延长肿瘤病人的存活期，肿瘤复发率较低。作用机制包括其直接对肿瘤细胞产生细胞毒作用；增强机体的各种细胞及体液免疫；诱导多种细胞因子的产生。其中T细胞的杀肿瘤作用增强及活化巨噬细胞数量增加是主要的抗瘤因素。     

新城疫病毒对癌细胞的杀伤作用

 目的　探讨新城疫病毒NDV对癌细胞的直接杀伤作用。方法　将NDV与各组细胞的混悬液一起加入细胞培养板中三孔法,同时设不加NDV的对照孔,经8、16、24、36和48小时五个时相观测细胞生长情况和病毒复制情况。结果　成纤维细胞和对照组细胞生长良好,而实验孔的各组癌细胞逐渐减少,出现融合、裂解。48小时癌细胞组的上清液病毒效价较高而成纤维细胞的上清液病毒效价为0。结论　NDV对癌细胞有较强的亲和力,可在癌细胞内大量复制,具有直接杀伤癌细胞的作用,而对正常细胞无明显的杀伤作用。     

新城疫病毒处理瘤细胞的免疫实验研究

目的：观察新城疫病毒（简称ＮＤＶ）对体外培养的肿瘤细胞免疫原性的影响。方法：将经新城疫病毒处理的小鼠肝癌细胞Ｈ２２为活瘤进行免疫接种。结果：ＮＤＶ处理瘤细胞制备的瘤苗可完全排斥再次接种未经病毒处理瘤细胞的生长,瘤苗能增强小鼠体内细胞免疫。结论：ＮＤＶ处理后的瘤细胞能使肿瘤生长减慢、荷瘤生存期明显延长。     

新城疫病毒对人胃癌细胞的抑制杀伤作用

目的 :研究新城疫病毒 (NDV)对人胃癌细胞株的作用。方法 :利用MTT方法检测NDV对人胃癌细胞株的杀伤性。结果 :NDV作用后的人胃癌细胞株的细胞活性比对照的细胞活性有显著下降 (P <0 0 1) ,且NDV血凝效价值显著升高 ,表明NDV能杀死肿瘤细胞。结论 :NDV能够直接杀死肿瘤细胞 ,可作为治疗肿瘤的一种新生物制剂     

新城疫病毒HN基因诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡的作用机制

目的 探索含新城疫病毒(NDV)HN基因的质粒pVHN诱导人肝癌细胞SMMC7721凋亡的作用及其机制。方法 以脂质体介导方法在体外转染pVHN于SMMC7721细胞24h后,通过MTT方法检测细胞活性状态;采用流式细胞仪(FCM)检测法,通过碘化丙啶(PI)染色测定细胞死亡率;以罗丹明123染色测定线粒体跨膜电位(△ψ)的改变;提取细胞基因组DNA进行电泳,检测DNA有无断裂;用底物颜色反应检测Caspase-3活性。结果 细胞SMMC7721在体外转染pVHN后,死亡率达50．0％(转染空载体质粒对照组为5．2％);细胞基因组DNA呈梯状谱带;线粒体△ψ下降,Caspase-3活性明显升高。结论 新城疫病毒HN基因在体外转染细胞SMMC7721,能明显诱导细胞SMMC7721凋亡,其发生机制可能是由于HN基因的导入引起线粒体△ψ下降,进而激活Caspase-3使细胞凋亡。     

表达新城疫病毒HN基因重组鸡痘病毒的构建及其抑瘤作用

目的〖HT5”SS〗： 构建表达新城疫病毒（newcastle disease virus, NDV）HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN,探讨vFVHN对体外培养人肝癌细胞 SMMC7721的抑制作用和对小鼠荷肝癌模型的体内抑瘤效果。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗： 以野生型鸡痘病毒（fowl poxvirus, FPV）282 E4株为载体,构建表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN。采用5溴2脱氧尿苷（5bromo2deoxyribouridine,BrdU）加压法筛选重组体,并通过RTPCR和Western blot等方法对其进行鉴定。采用噻唑蓝（methylthiazoletetrazolium,MTT）染色法检测vFVHN对人肝癌细胞SMMC7721的杀伤率,并通过检测抑瘤率观察其在C57BL/6小鼠荷肝癌模型的抑瘤效果。〖HT5W〗结果〖HT5"SS〗： 成功构建重组鸡痘病毒vFVHN,其对SMMC7721细胞的杀伤率为43.37%,对C57BL/6小鼠肝癌模型的抑瘤率为20.65%。〖HT5W〗结论〖HT5"SS〗： 重组鸡痘病毒vFVHN可有效杀伤体外培养的人肝癌细胞SMMC7721,并对C57BL/6小鼠荷肝癌模型体内的实体肿瘤有一定抑制作用。     

新城疫病毒在消化道肿瘤中的研究进展

目前消化道肿瘤在我国有着越来越高的发病率,对于肿瘤的防治已成为现今医学研究的重要方向。传统消化道肿瘤治疗中存在化疗敏感性差、靶向治疗费用较高等问题,而新城疫病毒 (NDV) 因其特异地抗肿瘤作用,成为目前肿瘤治疗研究的热点之一。NDV具有选择性溶瘤作用可直接杀死肿瘤细胞;可作为肿瘤疫苗的佐剂,刺激机体产生细胞因子并激活机体发生迟发型超敏反应;NDV也可作为免疫疫苗的载体或提供治疗基因的病毒载体。本文就近年来NDV在消化道肿瘤中的研究进展做一综述。     

Evaluation of Newcastle disease virus mediated dendritic cell activation and cross-priming tumor-specific immune responses ex vivo

We have developed an oncolytic Newcastle disease virus (NDV) that has potent in vitro and in vivo anti-tumor activities and attenuated pathogenicity in chickens. In this ex vivo study using the same recombinant NDV backbone with GFP transgene (NDV-GFP, designated as rNDV), we found that rNDV induces maturation of monocyte-derived immature dendritic cells (iDCs) by both direct and indirect mechanisms, which promote development of antigen-specific T cell responses. Addition of rNDV directly to iDCs culture induced DC maturation, as demonstrated by the increased expression of costimulatory and antigen-presenting molecules as well as the production of type I interferons (IFNs). rNDV infection of the HER-2 positive human breast cancer cell line (SKBR3) resulted in apoptotic cell death, release of proinflammatory cytokines, and danger-associated molecular pattern molecules (DAMPs) including high-mobility group protein B1 (HMGB1) and heat shock protein 70 (HSP70). Addition of rNDV-infected SKBR3 cells to iDC culture resulted in greatly enhanced upregulation of the maturation markers and release of type I IFNs by DCs than rNDV-infected DCs only. When co-cultured with autologous T cells, DCs pre-treated with rNDV-infected SKBR3 cells cross-primed T cells in an antigen-specific manner. Altogether, our data strongly support the potential of oncolytic NDV as efficient therapeutic agent for cancer treatment.     

新城疫病毒体外抗白血病作用的实验研究

 目的　通过体外实验研究探讨新城疫病毒（NDV）对人类急性单核细胞白血病的作用。方法　应用倒置显微镜观察NDV感染后白血病细胞形态和密度的变化,AO／PI染色后观察病毒对白血病细胞的生长抑制情况;甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定不同浓度NDV作用于白血病细胞不同时间后对细胞增殖的影响。结果　倒置显微镜下,对照组细胞形态规则、分布密集;NDV感染组细胞形态不规则,聚集、融合现象明显,分布稀疏;AO／PI染色后对照组呈均匀明亮的绿色荧光,NDV原液组呈红、绿两色荧光,以红色为主,MTT检测结果显示不同浓度NDV对SHI-1细胞的增殖均有明显抑制作用（P＜0.01）,不同时间的抑制作用也有明显差异（P＜0.01）;增殖抑制作用呈现时间-浓度依赖关系。结论　NDV是一种有效的抗人类急性单核细胞白血病的病毒。     

Plasmid vaccine encoding HN gene from newcastle disease virus has marked antitumoral effect in vitro

Objective: To explore the antitumor effects of hemaagglutinin-neuraminase gene (HN gene) from Newcastle disease virus. Methods: Plasmid vaccine of pIRHN was constructed and transfected into HeLa cells.The expression of HN was analyzed by Western blot analysis, and the mode of cell death was detected by fluorescence microscope, gel electrophoresis and TUNEL assay and the expression of p53 and bcl-2 was also analyzed in transfected Hela cells. The effect of pIRHN on sialic acid contents in the Hela cell was examined. Results: plRHN nucleic acid vaccines could be expressed in eukaryotic cell. pIRHN could induce apoptosis after HeLa cells were transfected. The effect of antitumor responses of pIRHN was correlated with the contents of sialic acid in tumor cells, and there was no prominent evidence for the relatedness of the antitumor effect with the expression of p53 and bcl-2. Conclusion: pIRHN may become a new antitumor biological agent.     

新城疫病毒D817对裸小鼠人结肠癌移植瘤的抑制作用

目的 观察新城疫病毒DK/HK/817/1980(NDV D817)对裸小鼠人结肠癌移植瘤的抑制作用.方法 采用LoVo细胞株建立裸小鼠人结肠癌移植瘤模型,分别给予裸小鼠尾静脉注射PBS、氟尿嘧啶(5-Fu)以及NDV D817高、中、低3个剂量,观察不同剂量NDV D817对移植瘤的抑制作用,病理学观察NDV D817对移植瘤和肝细胞的损伤程度,流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡和坏死情况,酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒检测荷瘤小鼠体内肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量,血凝实验检测荷瘤小鼠体内活病毒量.结果 中剂量NDV D817可明显抑制移植瘤的生长,肿瘤抑制率达48.1%.NDV D817对荷瘤小鼠体重和肝脏的损伤较小,且具有诱导肿瘤细胞凋亡和诱导机体产生TNF-α的能力.荷瘤小鼠处死后只在瘤内检测到活病毒,而在血清和其他脏器中并没有检出活病毒.结论 在对裸小鼠人结肠癌移植瘤的抑制过程中,NDV D817有明显的抑瘤效果,适当剂量的NDVD817更安全有效.     

腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶自杀基因联合IL-2基因疗法的肿瘤治疗作用及免疫机理分析

目的以腺病毒作为载体，将大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因与小鼠ＩＬ－２基因联合转移，研究其体内抗肿瘤作用及免疫机理。方法小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞后３天，肿瘤局部注射表达ＩＬ－２的重组腺病毒ＡｄＩＬ－２和表达ＣＤ的重组腺病毒ＡｄＣＤ，然后连续１０天给予５－氟胞嘧啶（５－Ｆｃ）３００ｍｇ／ｋｇ进行治疗。结果联合治疗组荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长明显受到抑制，小鼠存活期明显长于ＡｄＩＬ－２、ＡｄＣＤ／５－Ｆｃ、ＡｄｌａｃＺ／５－Ｆｃ或ＰＢＳ组。经联合治疗后，小鼠脾细胞的ＮＫ活性和ＣＴＬ杀伤活性明显增强；肿瘤瘤体内ＣＤ４、ＣＤ８细胞浸润增加；肿瘤细胞表达Ｈ－２Ｋｂ和Ｂ７－１分子明显增加。结论联合应用自杀基因和ＩＬ－２基因治疗，一方面可以明显抑制荷瘤小鼠肿瘤生长，另一方面可以提高机体对肿瘤细胞免疫应答，增加机体的抗肿瘤作用，是肿瘤基因治疗中一条行之有效的途径。     

新城鸡瘟病毒治疗肉瘤180小鼠的实验研究

肉瘤１８０（Ｓ_１８０）细胞注入到小鼠腹腔中制得荷瘤鼠模型，用新城鸡瘟病毒（ＮＤＶ）Ｂ１株治疗，观察１个月。青年鼠（７周龄）生存率达７６．７％，而老龄鼠（１年龄）和未经治疗的青年鼠均１００％死亡。病毒在Ｓ１８０腹水中基本不繁殖。进一步观察发现，经ＮＤＶ治疗的荷瘤鼠，７周龄鼠血清干扰素增高、ＮＫ细胞活性增强，而１年龄鼠中则未观察到此现象。７周龄鼠治疗后第４天可检测出抗病毒抗体，第８天时效价达１：１６００。用ＮＤＶ体外感染巨噬细胞也可诱生出较高浓度干扰素。结果提示，干扰素增高、ＮＫ细胞活性增强可能与抗肿瘤疗效有关，而抗病毒抗体与疗效间的关系，尚需进一步研究。