尼美舒利对体外培养人胆管癌细胞QBC939增殖的抑制作用

近年来研究表明,环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）抑制剂具有抑制结肠癌、胃癌、肝癌等癌细胞增殖的作用.我们采用选择性COX-2抑制剂尼美舒利作用于胆管癌QBC939细胞,观察尼美舒利对胆管癌细胞的影响.……     

反义CD147分子对人胆管癌细胞株侵袭性影响的实验研究

目的探讨反义CD147分子对人胆管癌细胞株QBC939侵袭性的影响。方法构建含反义CD147分子片段的重组真核表达质粒,将人胆管癌细胞株QBC939分为三组:(1)反义CD147组,运用重组真核表达质粒as CD147-pc DNA3.1(-)转染QBC939细胞;(2)空质粒组,运用pc DNA3.1(-)空质粒转染QBC939细胞;(3)对照组,运用DMEM常规处理细胞。采用MTT法检测各组QBC939细胞的生长情况,RT-PCR和Western blotting法分别对三组QBC939细胞中的CD147、MMP-2、MMP-9、TIMP-2的m RNA表达水平及其对应蛋白的表达水平进行检测。结果成功构建了携带反义CD147分子片段的重组真核表达质粒。MTT法检测显示:三组QBC939细胞的生长曲线及对数生长期情况无统计学差异(P0.05)。RT-PCR法检测显示:反义CD147组QBC939细胞中CD147和MMP-2分子的m RNA表达均低于空质粒组和对照组(P0.05),且空质粒组与对照组相比无统计学差异(P0.05);反义CD147组QBC939细胞中MMP-9和TIMP-2分子的m RNA表达与空质粒组和对照组相比无统计学差异(P0.05)。Western blotting检测发现:与空质粒组和对照组相比,反义CD147组QBC939细胞中CD147和MMP-2分子的蛋白表达明显降低(P0.05),空质粒组与对照组相比无统计学差异(P0.05);与空质粒组和对照组相比,反义CD147组QBC939细胞株中MMP-9和TIMP-2分子的蛋白表达无统计学差异(P0.05)。结论 (1)反义CD147对胆管癌细胞株QBC939的生长无影响;(2)反义CD147对胆管癌细胞株QBC939中MMP-9和TIMP-2的m RNA表达及对应蛋白表达无影响;(3)反义CD147降低胆管癌细胞株QBC939中CD147和MMP-2的m RNA表达及对应蛋白表达,可能会降低胆管癌细胞株的侵袭性。     

苦参碱对人胆管癌细胞QBC939增殖和凋亡的影响

苦参碱作用广泛，具有抗病毒、抗感染、平喘、增强机体免疫力、升高白细胞、保肝等作用。近年来，其抑制肿瘤细胞生长的作用已经用于抗白血病的治疗,但在实体瘤的研究很少。本研究旨在探讨苦参碱对胆管癌细胞的作用及其机制。     

反义SKP2对胆管癌细胞系QBC中p27kip1表达的影响

目的 通过S期激酶相关蛋白（SKP2）反义寡核苷酸（ASODN）阻断泛素，蛋白酶体降解途径，观察对胆管癌细胞QBC中SKP2和p27^kip1表达的影响，探讨泛素-蛋白酶体途径在胆管癌发生发展中的作用。方法 SKP2反义寡核苷酸和胆管癌细胞QBC共培养，脂质体转染，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR），Western blot法检测SKP2和p27^kip1 mRNA和蛋白在QBC中的表达。结果 SKP2 ASODN作用于QBC后，SKP2在mRNA和蛋白的表达较对照组和NSODN组均显著降低（P〈0．05），p27^kip1 mRNA表达差异无统计学意义（P〉0．05），蛋白表达则较对照组和NSODN组明显增高（P〈0．05）。结论 SKV2介导的泛素-蛋白酶体途径在调节胆管癌细胞QBC中p27^kip1的降解中发挥重要作用，SKP2反义寡核苷酸在显著抑制QBC中SKP2 mRNA和蛋白的表达的同时，促进p27^kip1蛋白表达，但对p27^kip1 mRNA无明显影响，提示SKP2对p27^kip1的调节主要在转录后水平。SKV2作为胆管癌基因治疗中有效的潜在靶基因，在胆管癌的基因治疗方面具有重要意义。     

体外分层渗透共培养研究胆管癌细胞株QBC939对正常内皮细胞的作用

目的 在体外分层渗透共培养体系中研究胆管癌细胞对正常内皮细胞的作用.方法 建立胆管癌细胞株QBC939与正常内皮细胞的体外分层渗透共培养体系,以同期单独培养的正常内皮细胞为对照,用免疫荧光法检测内皮细胞与胆管癌细胞共培养后,内皮细胞F-actin,pp125FAK,蛋白水解酶MMP-2、MMP-9、uPA蛋白表达变化,用Realtime PCR,Western印迹检测内皮细胞共培养前后,ppl25FAK,MMP-2、MMP-9、uPA的mRNA及蛋白表达变化.结果 与同期单独培养的正常内皮细胞对照相比,内皮细胞F-actin表达增强,pp125FAK、MMP-2、MMP-9、uPA的mRNA及蛋白表达增加(P<0.01).结论 胆管癌细胞能通过旁分泌作用导致内皮细胞骨架系统改变,并能诱导内皮细胞蛋白水解酶的基因表达及蛋白合成,表明肿瘤细胞对邻近内皮细胞还可以通过肿瘤细胞的内分泌、旁分泌等作用分泌各种细胞因子,作用于内皮细胞上的特异性受体,发挥其对内皮细胞mRNA表达的调控作用,而导致内皮细胞发生形态、行为的改变.     

反义调控DNA甲基转移酶3b基因对人胆管癌细胞QBC939生长的影响

目的观察转染反义DNMT3b基因真核表达质粒对人胆管癌细胞QBC939生长的影响，初步探讨DNMT3b基因在胆管癌发生中的作用。方法构建反义DNMT3b基因真核表达质粒，用脂质体介导法将其转人人胆管癌细胞株QBC939；Western blot检测转染前后DNMT3b蛋白表达的变化；MTT法和软琼脂克隆形成试验观察细胞的生长增殖能力；流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。结果转染反义基因能使DNMT3b蛋白表达水平降低；转染反义DNMT3b基因不能抑制QBC939的生长曲线，对其软琼脂克隆形成率亦无影响（P=0．717）；转染反义DNMT3b基因不能改变QBC939的细胞周期和促进细胞凋亡（P=0．089）。结论转染反义DNMT3b基因真核表达质粒可下调DNMT3b在QBC939细胞中的表达水平，但对QBC939的生长和增殖无影响，也不能改变QBC939的细胞周期和促进细胞凋亡的发生。     

反义寡核苷酸对丙型肝炎病毒转染胆管癌细胞的抑制作用

目的　探讨反义寡核苷酸 (ODNs)对丙型肝炎病毒 (HCV)转染胆管癌细胞中HCV的抑制作用。方法　通过半定量逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测HCVmRNA表达的变化 ,观察不同浓度 (0～ 6 .0 μmol/L)的HCV核心区ODNs对体外丙肝病毒感染胆管癌细胞 (QBC939)的抑制作用 ;同时以裸鼠为研究对象进一步观察ODNs对HCV的体内抑制作用。结果　ODNs可有效地进入靶细胞在体外与HCV核心基因杂交结合 ,使HCVmRNA的表达明显降低 ,终浓度为 6μmol/L的ODNs作用下无HCVmRNA表达。动物实验观察ODNs组在裸鼠中的瘤体平均直径小于对照组、PBK HCVC转染组 (P <0 .0 1 ) ,成瘤率 2 5 % (5/ 2 0 )低于PBK HCVC转染组 65 % (1 3/2 0 ) (P <0 .0 5) ,成瘤时间 1 5 .3d较对照组 1 2 .0d、PBK HCVC转染组 1 0 .1d延迟 (P <0 .0 1 )。结论　反义寡核苷酸不失为治疗丙肝病毒感染胆管癌新的途径     

Survivin反义寡核苷酸对肝门部胆管癌细胞株FRH-0201作用的研究

目的 探讨survivin反义寡核苷酸抑制survivin基因表达对肝门部胆管癌细胞FRH-0201的作用.方法 脂质体介导survivin ASODN转染肝门部胆管癌细胞FRH-0201;倒置相差显微镜观察细胞形态学变化;RT-PCR、Western印迹法检测survivin mRNA及蛋白表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡率.结果 survivin反义寡核昔酸作用后肝门部胆管癌细胞FRH-0201 survivinmRNA及蛋白表达水平较未转染组显著下降(mRNA:0.51±0.03 vs 0.82±0.02,P<0.05;蛋白:1.82±0.16 vs 3.08±0.27,P<0.05),细胞出现凋亡形态学变化.细胞凋亡率增高(11.50±1.49%vs 0.39±0.08%,P<0.05).结论 survivin反义寡核苷酸能有效下调survivin基因表达,诱导肝门部胆管癌细胞凋亡.     

联合应用9-顺式维甲酸和化疗药物对人胆管癌细胞系QBC939的作用

目的 观察联合应用分化诱导剂9—cis RA和化疗药物对人胆管癌细胞QBC939细胞的作用，为临床诱导分化治疗胆管癌提供实验基础。方法 以10^-6mol／L的9—cis RA作用于培养的人胆管癌细胞系QBC939细胞1、2、3、5d后检测几种常用化疗药物对细胞的杀伤作用。并观察同时加入10^-6mol／L的9—cis RA和化疗药物对QBC939细胞的杀伤作用。结果 同时应用9—cis RA和化疗药物时，对QBC939细胞的杀伤作用与单用化疗药物时无明显差异。9—cis RA作用2d和3d时，化疗药物对QBC939细胞的杀伤作用强于9—cis RA作用前；9—cis RA作用5d时，化疗药物对QBC939细胞的作用较9—cis RA作用前强，但比3d时下降。结论 先用9—cis RA作用后可增强QBC939细胞对化疗药物的敏感性，此作用与9—cis RA作用时间有关。不同联合用药方法的效果不同。     

三种分化诱导剂对人胆管癌细胞株QBC939的作用

目的观察二甲基亚砜(DMSO)、全反式维甲酸(ATRA)和9顺式维甲酸(9cisRA)对人胆管癌细胞株QBC939的作用,筛选对它有效的分化诱导剂。方法以DMSO、ATRA和9cisRA作用于培养的胆管癌细胞株,描绘生长曲线,观察细胞形态,双层软琼脂培养法观察细胞恶性度,流式细胞术(FCM)检测细胞周期动力学变化。结果10-6mol/L9cisRA作用2d后开始抑制QBC939细胞生长,抑制率为39.4%～80.7%(P<0.05)。细胞软琼脂集落形成能力较对照组下降80.9%(P<0.01)。细胞形态向正常细胞转化。9cisRA作用1、3、5、7dG0/G1期细胞比例分别为55.56%、63.92%、73.38%、76.92%。ATRA对QBC939细胞无明显作用,DMSO主要引起细胞死亡。结论9cisRA可诱导QBC939细胞向良性表型分化,对该细胞株具有有诱导分化作用。     

γ-氨基丁酸对人胆管癌细胞株QBC939增殖和侵袭的影响

目的 观察抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)对人胆管癌细胞株QBC939生物学行为的影响.方法 采用MTF比色法观察GABA对人系胆管癌细胞QBC939增殖的作用,PCR-ELISA法观察其对QBC939细胞端粒酶活性的影响,Transwell小室分析GABA对胆管癌细胞侵袭能力的影响,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、明胶酶谱法分析GABA对QBC939细胞分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)mRNA和酶活性的影响,数据采用单因素方差分析和Dunnett法处理.结果 GABA对人胆管癌细胞QBC939的增殖有抑制作用(抑制率由2.6%增至26.8%,P＜0.05);抑制癌细胞中端粒酶的活性(0.82±0.05)vs.(0.56±0.05)(P＜0.05);抑制胆管癌细胞穿透Matrigel胶的能力(在100 μmol/L浓度的GABA作用下,穿透细胞数由(60±10)个降至(43±4)个(P＜0.05),同时胆管癌细胞分泌的基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的mRNA和活性下降,这三种效应均成浓度依赖性.结论 GABA抑制胆管癌细胞QBC939的生长并减弱侵袭转移能力,其机制可能与其抑制端粒酶活性和基质蛋白酶MMP-2和MMP-9的分泌和活性有关.     

胃泌素调节胆管癌细胞凋亡的初步研究

目的探讨胃泌素 (gastrin)对胆管癌细胞凋亡的调节及机理。方法用TUNEL技术和定量RT PCR分别检测胃泌素 17(G 17)对QBC939人胆管癌细胞系白僵菌素诱发性凋亡指数 (AI)和bcl 2 /baxmRNA表达的影响 ,用反义寡核苷酸技术研究bcl 2基因在胃泌素调节细胞凋亡中的作用。结果与对照组比较 ,G 17组AI降低、bcl 2mRNA表达增强 (P <0 0 1) ,baxmRNA无变化 ;胃泌素受体拮抗剂L36 5 ,2 6 0 (L6 0 )可拮抗G 17对AI和bcl 2mRNA表达的影响 (P <0 0 1) ;反义bcl 2寡核苷酸转染可逆转G 17对AI的抑制 (P <0 0 1) ,正义和随机片段无作用。结论胃泌素能提高凋亡阈值、抑制胆管癌细胞凋亡 ,其机理与上调bcl 2表达有关     

尼美舒利对胆管癌QBC939细胞增殖与凋亡的调节

目的研究选择性环氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）抑制剂尼美舒利对人胆管癌细胞系QBC939增殖和凋亡的影响.方法应用MTT比色法观察尼美舒利对人胆管癌细胞系QBC939增殖的影响,细胞凋亡采用透射电镜及流式细胞仪检测,应用免疫组化、RT-PCR检测尼美舒利对凋亡相关基因表达的影响.结果尼美舒利呈时间、剂量依赖性抑制胆管癌细胞增殖,高浓度（200 μmol/L）尼美舒利不仅抑制胆管癌细胞增殖,而且诱导其凋亡,流式细胞仪研究显示,随药物浓度增加,细胞凋亡率显著增加,透射电镜下可见典型的细胞凋亡形态学改变：细胞核染色质致密浓缩,凋亡小体形成等,免疫组化和RT-PCR测定显示尼美舒利显著下调bcl-2、survivin表达,而bax表达上调.结论尼美舒利显著抑制QBC939细胞增殖,诱导其凋亡,且呈时间、剂量依赖性,bcl-2、bax、survivin等凋亡相关基因可能参与了尼美舒利诱导的QBC939细胞凋亡过程.     

反义抑制PTTG对胆管癌细胞株QBC939中VEGF表达的影响

目的：探讨抑制垂体瘤转化基因（PTTG）表达后对血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响。方法：将已构建好的反义PTTG真核表达载体pcDNA3.1-PTTGas按浓度梯度转染至胆管癌细胞株QBC939中，培养48h后利用RT-PCR和Western Blot方法检测PTTG和VEGF表达量的变化，并将两者的变化行直线相关分析。结果：成功转染反义PTTG至QBC939中;转染后PTTG和VEGF在mRNA水平最大抑制率分别为40.62%和34.14%;在蛋白质水平分别为55.55%和38.46%。在mRNA和蛋白质两个层面上均下降，呈线性正关系(r=0.970,0.985,P<0.05)。结论：反义阻断胆管癌细胞株中的PTTG表达能使VEGF的表达下降，下降程度呈正相关。     

洛伐他汀对胆管癌细胞株QBC939生长侵袭的抑制作用

目的 研究洛伐他汀(lovastatin)对人胆管癌细胞株QBC939生长、迁移、凋亡等生物学行为的影响,初步探讨其可能机制.方法 应用四甲基偶氮唑盐法检测洛伐他汀作用后细胞增殖情况.流式细胞技术检测细胞凋亡率.细胞划痕实验观察细胞迁移能力改变.RT-PCR和Western印迹法检测洛伐他汀作用前后人胆管癌细胞株QBC939中白细胞介素-6(IL-6)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶—9(MMP-9) mRAN 和Akt蛋白的表达.结果 与对照组相比,洛伐他汀组胆管癌细胞相对活力明显降低(24 h、48 h、72 h:F=173.05、159.66、577.87,均为P＜0.01)并具有浓度时间依赖性.洛伐他汀组较对照组细胞早期凋亡[(14.29±0.75)％比(5.61±0.85)％]、总凋亡[(35.48±1.13)％比(24.94±0.40)％]比例明显增加(均为P＜0.01).细胞24 h、48 h平均迁移速率明显减慢(分别为10.94±3.07比24.17±3.31和10.96±2.45比18.65±0.94,均为P＜0.01).洛伐他汀组中IL-6、Akt、VEGF、MMP-9 mRNA和Akt蛋白的表达明显低于对照组(均为P＜0.05).结论 洛伐他汀可抑制胆管癌细胞的增殖、迁移并诱导其凋亡,可能与下调IL-6、Akt、VEGF、MMP-9的表达有关.     

胆囊收缩素对胆管癌细胞凋亡的调节作用及机制

目的 探讨胆囊收缩素（CCK）对胆管癌细胞凋亡的调节作用及机制。方法 采用TUNEL染色、定量RT-PCR和反义寡核苷酸技术分别研究CCK-8S对QBC939人胆管癌细胞系诱发性凋亡指数（AI）和bcl-2/bax mRNA表达的影响、以及bcl-2在CCK抑制凋亡中的作用。结果CCK-8S组 AI显著降低、bcl-2mRNA表达显著增强,同时加入CCK受体拮抗剂L364.718或L365.206可拮抗;反义bcl-2寡核苷酸转染能逆转CCK-8S对凋亡的抑制作用。结论CCK能提高凋亡阈值、抑制胆管癌细胞凋亡,其机制与上调bcl-2基因表达有关。     

RhoC反义基因转染对人胆管癌QBC 939细胞增殖和侵袭性的影响

目的研究RhoC反义基因对胆管癌QBC939细胞株增殖和侵袭的影响。方法以脂质体将反义RhoC cDNA真核表达载体转染人胆管癌QBC939细胞。应用克隆形成试验检测细胞增殖活性的变化,流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化,Transwell小室检测侵袭能力的变化。结果转染反义RhoC cDNA真核表达载体后,形成克隆数目较空载体转染细胞和未转染的QBC939细胞明显减少[(54±8)vs(91±11)vs(90±9),P<0.05];并出现G_1期阻滞(52.5% vs 43.4% vs 43.7%);穿过小室滤膜细胞数目明显减少[(36±6)vs(96±12)vs(95±7),P<0.05]。结论RhoC反义基因能够抑制胆管癌QBC939细胞株的体外增殖和侵袭力。     

三氧化二砷诱导人类胆管癌QBC939细胞凋亡的初步研究

目的研究三氧化二砷(As2O3)诱导人类胆管癌QBC939细胞凋亡。方法应用MTT法检测As2O3对胆管癌细胞的抑制作用；采用光镜、荧光显微镜观察细胞形态变化；流式细胞术检测Rhodamine 123染色并分析DNA含量及细胞周期。结果1～16μmol／L As2O3均能抑制人胆管癌细胞QBC939的生长，且抑制率具有浓度一时间依赖性。4μmol／L As2O3作用细胞后出现典型的凋亡形态特征，可检测到亚二倍体凋亡峰，Rhodamine 123荧光强度降低。结论As2O3能诱导QBC939细胞发生凋亡，其机制可能与线粒体膜电位去极化有关。