密码子的鸡体偏嗜性优化增强H5亚型禽流感HA基因的表达水平和免疫原性

目的用鸡偏嗜性密码子替换H5亚型禽流感病毒A／Goose／GuangDong／1／96（H5N1）[GD／1／96（H5N1）]的保护性免疫原HA基因的密码子,优化和构建了基因optiHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR法及限制酶切法构建了密码子优化的HA基因（optiA5）,并将其插入表达载体pCI构建了DNA疫苗质粒pCIoptiHA5;将pCIoptiHA5和表达GD／1／96（H5N1）HA基因的质粒pCIHA5通过问接免疫荧光法和Western—blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白;随之将pCIoptiHA5及pCIHA5分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100LD50的HPAIV GD／1／96（H5N1）鼻腔途径进行攻击。结果间接免疫荧光法和Western-blot分析表明基因optiHA5表达水平显著高于野生型HA基因;免疫SPF鸡后,100μg pCIoptiHA5可形成75％的免疫保护,100μg pCIHA5可形成50％的免疫保护;10μg pCIoptiHA5可形成对免疫鸡75％的部分免疫保护,而10μg pCIHA5则基本不能形成免疫保护;pCIoptiHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。结论试验结果表明,HA基因密码子的优化可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,提高免疫原性,增强免疫保护效果。     

新型甲型H1N1流感病毒HA基因DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体

目的 探讨新型甲型流感病毒(2009H1N1)血凝素(HA)DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体特性.方法 构建2009H1N1或1918甲型流感病毒(1918H1N1)HA蛋白表达质粒2009HA和1918HA,采用25μg或200μg剂量2009HA质粒免疫小鼠,以2009HA或1918HA蛋白为包被抗原,测定小鼠血清中2009HA抗体总量或交叉反应抗体含量,分别用2009H1N1和1918H1N1两种假病毒(pp)测定抗体中和活性.结果 25 μg或200μg的2009HA质粒加强免疫小鼠后,4～16周内两组小鼠血清中2009HA总抗体水平以及对2009H1N1pp的中和抗体滴度相似(P>0.05),都含有与1918HA蛋白交叉反应抗体,对1918H1N1pp的交叉中和抗体滴度相似(P>0.05).结论 小剂量2009HA质粒DNA疫苗能够诱导小鼠产生持久的高水平中和抗体,对于预防新现流感病毒具有潜在应用价值.     

DNA疫苗及其在流感病毒疫苗研究中的应用

DNA疫苗能够诱导广谱免疫反应，已被广泛应用于预防性疫苗和针对各种感染性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病和过敏性疾病的免疫治疗的临床试验。自DNA疫苗技术出现，A型流感病毒就与其紧密地联系在一起，已被广泛应用于小鼠和其他动物模型以研究DNA疫苗的免疫作用和机理。     

H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究

目的研发一种具有良好免疫原性的H3N8型马流感血凝素(hemagglutinin,HA)核酸疫苗。方法根据马A型流感病毒A/Equine/Xinjiang/3/08(H3N8)的HA蛋白序列,经密码子优化后化学合成能够表达相应蛋白的基因片段,并将该片段克隆到核酸疫苗载体pJW4303中,构建带有天然信号肽的H3HA核酸疫苗,命名为H3HA/XJ3-08-wt;进一步对HA基因进行修饰,以人组织纤维蛋白酶原激活剂(human tissue plasminogen activator,tPA)取代H3HA天然信号肽,命名为H3HA/XJ3-08-tPA,或切除部分HA的基因片段使之只表达HA蛋白的胞外域,命名为H3HA/XJ3-08-dTM。用这3种重组质粒分别转染293T细胞,蛋白表达经蛋白质印迹检测得到确认。采用电转录法免疫新西兰白兔。ELISA方法检测免疫后兔血清中抗H3HA抗体滴度,血凝抑制实验(hemagglutination inhibition,HI)检测保护性抗体水平。结果 3种H3HA核酸疫苗均可在293T细胞中高效表达,并能够在新西兰白兔体内诱导产生特异性抗H3HA抗体,HI检测到不同水平的保护性抗体。其中以H3HA/XJ3-08-tPA的免疫原性最强。结论新构建的H3N8型马流感血凝素核酸疫苗具有良好的免疫原性,为此类疫苗的进一步研发奠定了基础。     

DNA疫苗免疫原性的研究策略

DNA疫苗既能诱导体液免疫又能诱导细胞免疫，是近年来疫苗研究的热点领域，被称为疫苗史上的第三次革命。但DNA疫苗诱导特异性免疫应答的水平不高，限制了它的广泛应用。本对提高DNA疫苗免疫原性的几种策略进行综述。     

含密码子优化的SIV gag基因的DNA疫苗与rAd5疫苗构建及免疫原性评价

目的 构建含有SIVgag基因的DNA疫苗和重组腺病毒疫苗,为后期在SIV感染的猴模型中进行多载体疫苗联合免疫策略的治疗效果评价奠定基础.方法 将SIV gag基因按照哺乳动物偏嗜密码子进行优化并构建至pVR载体,作为DNA疫苗.以Western Blot方法比较优化前后gag基因表达水平.将优化后的gag基因插入重组腺病毒载体,构建rAd5-SIVgag疫苗.在BALB/c小鼠中分别比较DNA疫苗及rAd5-SIV.gag疫苗单独及联合免疫的效果.结果 密码子优化的SIVgag基因的表达水平远高于野生型SIVgag基因.重组腺病毒疫苗免疫一次或两次诱导的细胞免疫反水平分别高于DNA疫苗免疫一次或两次.两种疫苗联合免疫的反应水平与腺病毒疫苗免疫两次的水平相当,高于DNA疫苗单独免疫及腺病毒疫苗单独免疫一次的结果.结论 成功优化了SIV gag基因,使其不依赖Rev高水平表达;成功构建了表达优化后SIV gag基因的DNA疫苗和rAd5疫苗,可以在小鼠体内诱导较强的gag基因特异性CTL应答.     

DNA疫苗免疫原性的研究策略

DNA疫苗既能诱导体液免疫又能诱导细胞免疫,是近年来疫苗研究的热点领域,被称为疫苗史上的第三次革命.但DNA疫苗诱导特异性免疫应答的水平不高,限制了它的广泛应用.本文对提高DNA疫苗免疫原性的几种策略进行综述.     

禽流感基因疫苗的研制

前言流感病毒属于正粘病毒科,是一种带衣壳的负链单股RNA病毒。甲乙两型流感病毒为该病毒分科之下的两个属,是人类流感的相关致病原。当前应用的流感疫苗所含成分就是处于流行期间的甲乙型流感病毒的灭活株或减毒株。禽流感是甲型流感的一种类型。鸭、鹅等候鸟禽类与这种病毒的     

增强DNA疫苗免疫原性的研究进展

DNA疫苗是疫苗领域的研究热点,与传统疫苗相比,具有能够同时诱导体液免疫和细胞免疫、安全、廉价等多种优势,但也存在免疫后抗体滴度不高、免疫效果差的问题。本文就目前DNA疫苗的免疫机制研究现状及其优化研究的进展进行了综述。     

HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因改造及其重组DNA疫苗的构建

目的 构建表达含有密码子优化的HIV-1 CRF01_AE亚型env基因的DNA疫苗,为多载体艾滋病治疗性疫苗的应用提供候选疫苗.方法 对HIV-1感染者血液样本进行型别分析,分型得到的AE亚型标本采用亚型特异性引物克隆env基因,通过序列比对获得其共有序列,对该序列按照哺乳动物密码子使用的偏嗜性进行优化,将人工合成的优化基因克隆至pVR载体,构建DNA疫苗.通过Western Blot方法比较优化前后env基因的表达.结果 成功获得32条具有完整的开放性阅读框的env克隆,型别分析确认均为CRF01_AE亚型.成功对其共有序列进行了优化、合成并构建了DNA疫苗pVR-mod.AE env,该疫苗与野生型的env基因（wt.AE env）相比可以高水平表达env基因,且不依赖Rev的存在.结论 对HIV-1中国流行株CRF01_AE env基因的优化改造及重组DNA疫苗的构建是成功的.     

优化密码促进HPV 6b E7蛋白表达及DNA疫苗诱导的细胞免疫反应

目的：探讨优化密码对人乳头瘤病毒6b型（HPV 6b）基因表达及免疫原性的影响，为治疗性DNA疫苗的研究奠定基础。方法：设计合成含优化密码及pRB结合位点突变的HPV 6bE7(humE7）全长基因。测序验证无误后，定向克隆于pcDNA3的Kpn I和EcoR I位点，成功构建真核表达质粒pcDNA3-hu-mE7。体外转染COS－1细胞，免疫荧光检测其E7蛋白表达。C57BL／6小鼠胫前肌内接种裸DNA，观察其诱导的细胞免疫反应。结果：pcDNA3-hu-mE7在COS－1细胞获得明显表达，表达产物主要位于细胞核中。DNA免疫结果显示，与含有野生型E7基因的表达质粒pcDNA3-wtE7比较，pcDNA3-hu-mE7免疫小鼠脾细胞培养上清中IFN-γ产生明显升高，CD8^ 和CD4^ 淋巴细胞活性增强。结论：优化密码能促进HPV 6b E7蛋白表达及DNA疫苗诱导的细胞免疫反应。     

H5N1禽流感病毒HA假病毒的构建及特性研究

目的 构建包膜蛋白为H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,对其生物学特性进行研究,并将其初步应用于H5N1禽流感病毒的血清检测.方法 将我国分离的高致病性H5N1禽流感病毒的HA基因插入真核表达质粒,得到pLP-HA,与假病毒构建体系的三种质粒pLP1,pLF2和pEmGFP,瞬时共转染人胚肾细胞293T,48 h收集假病毒上清,对其感染性,血凝活性进行测定,并应用于微量中和实验.同时,构建了优化HA基因的假病毒以及一株含有越南禽流感病毒HA基因的假病毒,进行比较.结果 电镜下观察到假病毒颗粒的存在;Western-Blot表明HA蛋白存在于假病毒颗粒中;HA假病毒与野生型活病毒的微量中和实验相比,两者结果具有很好的相关性.结论 成功构建了不同高致病性H5N1禽流感病毒HA蛋白的假病毒,所构建的假病毒可以应用于微量中和实验.研究发现不同禽流感病毒株HA蛋白假病毒的包装效率不同,并且真核表达优化基因并不能显著提高假病毒颗粒包装效率.     

Immunogenicity and safety of trivalent inactivated influenza vaccine: a randomized, double-blind, multi-center, phase 3 clinical trial in a vaccine-limited country

Influenza vaccines are the primary method for controlling influenza and its complications. This study was conducted as a phase 3, randomized, double-blind, controlled, multi-center trial at seven university hospitals to evaluate the immunogenicity and safety of an inactivated, split, trivalent influenza vaccine (GC501, Green Cross Corporation, Yongin, Korea), which was newly manufactured in Korea in 2008. Between September 21 and 26, a total of 329 healthy subjects were recruited for the immunogenicity analysis, while 976 subjects were enrolled for the safety analysis. The GC501 vaccine met both FDA and EMEA criteria with ≥ 80% of subjects achieving post-vaccination titers ≥ 40 for all three subtypes, even in the elderly. The vaccine was well tolerated with only mild systemic and local adverse events. In summary, GC501 showed excellent immunogenicity and a good safety profile in both young adults and the elderly. The licensure of GC501 might be an important basis in preparation for the future influenza pandemic.     

DNA疫苗及其免疫途径的研究进展

<正>DNA疫苗(DNA vaccine)又称为核酸疫苗、基因疫苗,是指将含有编码某种抗原蛋白基因序列的质粒载体作为疫苗,采用某种方法直接导入动物细胞内,然后通过宿主细胞的转录翻译系统合成抗原蛋白,诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答,从而使被接种动物获得相应的免疫保护,以达     

Strategies for improving the efficacy of a H6 subtype avian influenza DNA vaccine in chickens

A low-pathogenicity avian influenza H6N2 virus was used to investigate approaches to improve DNA vaccine efficacy. The viral hemagglutinin (HA) gene or its chicken biased HA gene, incorporating a Kozak sequence, was cloned into a pCAGGS vector to produce the pCAG-HAk and pCAG-optiHAk constructs. Following two intramuscular injections, the seroconversion rate in vaccinated chickens with 10, 100 or 300 μg pCAG-HAk were 87.5%, 75% and 75%, respectively. The profile of H6 hemagglutination inhibition (HI) antibodies induced by different doses of pCAG-HAk during the 8-week study period was similar. The HI titer rose significantly in the three different dose groups following the booster and reached a plateau 2-3 weeks post-booster. In a single dose vaccination group with 100 μg pCAG-HAk, a maximum seroconversion rate reached 53.3% at 5 weeks post-vaccination. The earliest time of seroconversion appeared two weeks after DNA immunization. Following two electroporation (EP) vaccinations with 100 μg pCAG-HAk, all birds seroconverted and the HI antibody titers were significantly higher than those using intramuscular immunization, suggesting that EP was more efficient than intramuscular delivery of the DNA vaccines. In comparison, chickens immunized with 10 or 100 μg pCAG-optiHAk showed 37.5% and 87.5% seroconversion rates, respectively, at 3 weeks following the booster. The pCAG-HAk was not significantly different from the pCAG-optiHAk in either the seroconversion rate or H6 HI titer, suggesting that the codon-optimized HA DNA vaccine did not achieve significantly better immunogenicity than the pCAG-HAk vaccine.     

Evaluation of different chemical adjuvants on an avian influenza H6 DNA vaccine in chickens

This study assessed the ability of three adjuvants (aluminium hydroxide, Essai (microparticle) and Phema (nanoparticle)) to enhance the immune response of chickens to an H6N2 avian influenza DNA vaccine. No haemagglutination inhibition antibody was detected following two intramuscular immunizations with the adjuvanted and non-adjuvanted pCAG-HAk vaccine, which has previously been shown to induce moderate H6 haemagglutinin antibody response in SPF chickens. Following virus challenge, neither the vaccinated group without adjuvant nor the Essai-adjuvanted group showed a statistically significant reduction in virus shedding in oropharyngeal and cloacal swabs compared with the naive control group. However, the aluminium hydroxide and Phema-adjuvanted groups significantly reduced the frequency of virus shedding in oropharyngeal swabs, indicating that these adjuvants appeared to further enhance the vaccine potency. Aluminium hydroxide holds promise as an adjuvant for enhancing DNA-induced immune response in chickens owing to its low price and safety record.     

PSMA基因疫苗抑瘤效应及免疫机制的实验研究

目的： 观察表达前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因疫苗在荷瘤小鼠模型中抑瘤效应并探讨其免疫机制,为前列腺癌的预防和免疫治疗提供实验基础。方法: 将PSMA基因疫苗肌注入BALB/c小鼠体内,检测其血清中PSMA抗体水平并观察脾T细胞的增殖效应和杀细胞毒效应,以sp2/0-PSMA细胞攻击免疫后小鼠,观察小鼠的成瘤率、肿瘤大小、平均瘤重及生存率,评价PSMA基因疫苗的抑瘤效应。结果: PSMA基因疫苗可诱导实验组小鼠产生PSMA抗体,脾T细胞的增殖效应和杀细胞毒效应,在一定时间内随着免疫次数的增加和时间的延长,抗体水平、脾细胞的增殖和杀细胞毒效应均呈上升趋势。与对照组相比较,实验组小鼠成瘤率低,无瘤生存期延长,肿瘤生长缓慢。结论: PSMA基因疫苗能诱导实验组小鼠产生特异性体液及细胞免疫应答,且有明显的抑瘤效应。     

表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D的重组痘苗病毒活疫苗株的建立

我们以前曾报道，表达单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白Ｄ（ＨＳＶ－２ｇＤ）的重组痘苗病毒（实验疫苗株）能保护被免疫小鼠抵抗致死量ＨＳＶ－２病毒的攻击。在此工作基础上，严格按人用疫苗研究要求的实验条件，成功地建立了表达ＨＳＶ－２ｇＤ的重组痘苗病毒活疫苗株。首先将经聚合酶链反应（ＰＣＲ）修饰的ＨＳＶ－２ｇＤ基因插入痘苗表达质粒ｐＪＳＢ１１７５，置于痘苗病毒Ｐ７５Ｋ早／晚期启动子控制下。将此重组质粒用Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ方法转染已受野型ＴＫ＋痘苗病毒天坛７６１株感染的人胚肺二倍体细胞。经同位素探针（３２Ｐ－ＨＳＶ－２ｇＤ）原位杂交法和３轮蚀斑纯化，筛选出基因组内整合有ＨＳＶ－２ｇＤ基因的重组痘苗病毒。斑点和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实，ＨＳＶ－２ｇＤ基因已插入痘苗病毒基因组内预期的ＴＫ区段，间接免疫荧光检测显示，重组病毒感染细胞后能有效地表达ＨＳＶ－２ｇＤ蛋白。