同种异体组织工程化软骨组织的生化分析

目的以胚胎来源的关节软骨细胞,体内构建同种异体组织工程化软骨组织,分析其与正常关节软骨组织糖胺多糖(GAG)和Ⅱ型胶原含量的差异.方法以酶消化法分离胚胎(100 d)山羊关节软骨细胞,与生物材料聚环氧乙烯复合,并植入异体成年山羊腹部皮下.按不同时间段取材, Western-blot、MTT比色法分析测定其GAG和Ⅱ型胶原含量,并与正常关节软骨组织比较.结果新生软骨中GAG的含量比正常关节软骨显著下降(P<0.01),而II型胶原含量与正常关节软骨无显著性差异.结论胚胎来源的同种异体组织工程化软骨与正常关节软骨有着相同的生化成分,且新生软骨中II型胶原的含量与正常关节软骨接近.     

关节软骨损伤组织工程修复的实验研究

目的：（1）研究不同体外培养时间软骨的生物学特性，探讨运用于软骨组织工程中软骨种子细胞的最适宜培养时间和条件。（2）应用组织工程技术探讨运用自体关节软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（3）应用组织工程技术探讨应用同种异体软骨细胞修复关节软骨缺损的可行性。（4）研究修复关节软骨缺损的软骨细胞来源。方法：（1）取新西兰兔关节软骨细胞体外培养，观察软骨细胞的形态学变化，生长曲线，酸性粘多糖及胶原分泌情况。（2）建立关节软骨缺损模型，应用自体关节软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（3）应用同种异体软骨细胞复合生物支架Pluronic修复关节软骨缺损，观察修复效果。（4）应用3H－TdR放射自显影方法，确定修复关节软骨缺损的细胞来源。结果：（1）体外培养第四代软骨细胞的增殖能力达到高峰，而第二代软骨细胞分泌基质能力最强。（2）自体或同种异体软骨细胞复合Pluronic修复关节软骨缺损，12周后缺损表面较平滑，与正常软骨界面愈合较好，MASSON三色染色显示胶原分布已较均匀， 骨细胞呈柱状排列，II型胶原在细胞周围阳性表达，而空白对照和材料对照组未见明显修复。（3）3H－TdR放射自显影方法证实修复软骨组织的细胞来源于体外移植细胞，软骨细胞植入体内早期仍进行有丝分裂，而在中后期软骨细胞以分泌基质为主，植入的细胞与周围软骨细胞间存在物质交换。结论：（1）软骨细胞在体外培养2－3周左右是作为软骨组织工程种子细胞的最佳时机。（2）自体或同种异体组织工程化软骨是修复关节软骨缺损的较好方法。（3）组织工程化软骨修复关节软骨缺损的细胞来源于体外移植的软骨细胞。     

自体组织工程化软骨组织在体内最佳形成时间的研究

目的研究探讨自体组织工程化软骨在动物自体内最佳形成时间,为临床应用提供理论研究和参数。方法取猪耳廓软骨细胞,与可注射性生物材料Pluronic F127混合形成浓度为50×106/ml细胞－生物材料复合物,接种于猪自体腹外侧壁真皮下,分别在接种后第1、3、6、9、15周取材,从组织学、生化组成对再生软骨组织进行评价。结果第六周形成的软骨组织完全成熟,与正常软骨组织有相似的组织学特性。而第1、3周大部分为未成熟的软骨细胞。各不同时间再生软骨组织中氨基糖氨多糖(GAG)占组织干重的平均百分含量在7.0～9.0之间。第6周形成软骨组织中Ⅱ型胶原含量比第1、3周形成软骨组织中Ⅱ型胶原含量高,和正常耳软骨含量接近。结论利用组织工程技术可在具有免疫功能自体动物内形成软骨组织,确定软骨组织形成的最佳时间为接种后第6周。     

应用几丁质胶原网架构建组织工程软骨

目的：探索利用几丁质胶原网架构建组织工程人工软骨的方法。 方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化、传代培养后,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,将几丁质纤维网架浸入上述混合物中制成人工软骨培养物并在体外培养。将培养1周的组织工程培养物,植入同种异体动物皮下组织培养4周,观察组织工程软骨的形成情况。 结果：细胞在几丁质网架培养物中分布均匀,细胞多呈三角形或梭形,培养物体积收缩不明显,经体内培养存活的软骨细胞分泌Ⅱ型胶原,有血管和炎性细胞的侵入。结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白混合凝胶与几丁质纤维网架载体为支架植入软骨细胞以后,在体外和体内都可以培养构建出较大的组织工程软骨。     

离心管技术构建的组织工程软骨细胞生物学特性的研究

目的 观察离心管技术构建的组织工程化软骨的细胞生物学特点，探讨该技术构建组织工程化软骨的可行性。方法 取3周龄兔关节软骨的表层软骨，经酶消化获得大量的软骨细胞，用离心管技术构建软骨组织，对培养3周的组织工程软骨进行组织学，免疫组织化学，透射电镜，^3H-TdR掺入量等检查。结果 组织学显示软骨细胞位于陷窝，基质异染，Ⅱ型胶原免疫组化阳性，细胞内富含高尔基体，分泌囊泡和糖原颗粒，^3H-TdR掺入量显示软骨细胞DNA较正常软骨细胞明显增强。结论 离心管内软骨细胞的增殖较正常关节软骨增强，离心管技术可用于组织工程软骨的构建。     

同种异体骨髓基质细胞移植修复兔膝关节骨软骨缺损

目的 探讨同种异体骨髓基质细胞(BMSCs)作为种子细胞在软骨组织工程中的应用.方法 同种异体BMSCs与丝素蛋白-异体松质骨共培养构建组织工程化骨软骨复合体,移植修复兔膝关节骨软骨缺损,术后2、4、12周取材,行组织学观察及Ⅱ型胶原、Brdu免疫组化染色.结果 BMSCs能在丝素蛋白和松质骨支架上较好的黏附、生长,共培养后成功地构建了组织工程化骨软骨复合体;体内移植后生成透明软骨样组织并修复了骨软骨缺损.结论 同种异体BMSCs可作为软骨组织工程的种子细胞,丝素蛋白-松质骨双相支架负载同种异体BMSCs可用于骨软骨缺损的修复.     

SV40LTAg基因永生化软骨细胞体外培养的生物学特性

目的探讨永生化关节软骨细胞体外培养的生物学特性。方法用SV40LTAg(类人猿40病毒大T抗原)基因转染原代培养的关节软骨细胞,构建永生化关节软骨细胞系(immortalized cartilage chondrocytes)并体外培养,以正常关节软骨细胞(normal cartilage chondrocytes)作对照。倒置显微镜下观察永生化软骨细胞的形态学变化和增殖情况;应用甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察永生化软骨细胞在培养过程中酸性粘多糖(GAG)和胶原分泌情况。结果永生化关节软骨细胞体外培养呈贴壁单层生长,长期传代(50代)仍有很强的增殖能力,形态呈现多角形和三角形,GAG和胶原染色均呈阳性。结论构建的永生化关节软骨细胞在体外培养能长期维持软骨细胞的特征性表型。     

SV40LTAg基因永生化软骨细胞体外培养的生物学特性

目的 探讨永生化关节软骨细胞体外培养的生物学特性。方法 用SV40LTAg(类人猿40病毒大T抗原)基因转染原代培养的关节软骨细胞。构建永生化关节软骨细胞系(immortalized cartilage chondrocytes)并体外培养，以正常关节软骨细胞(normal cartilage chondrocytes)作对照。倒置显微镜下观察永生化软骨细胞的形态学变化和增殖情况；应用甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，观察永生化软骨细胞在培养过程中酸性粘多糖(GAG)和胶原分泌情况。结果 永生化关节软骨细胞体外培养呈贴壁单层生长，长期传代(50代)仍有很强的增殖能力，形态呈现多角形和三角形，GAG和胶原染色均呈阳性。结论 构建的永生化关节软骨细胞在体外培养能长期维持软骨细胞的特征性表型。     

胶原-纤维蛋白混合凝胶对关节软骨细胞合成Ⅱ型胶原的影响

目的：以胶原蛋白和人血纤维蛋白混合物为载体在体外进行关节软骨细胞三维立体培养,构建人工软骨组织,研究载体对软骨细胞在其中的表达及合成Ⅱ型胶原的影响。方法：取2周龄的新生兔关节软骨,经消化,将获得的软骨细胞与牛Ⅰ型胶原、人血冻干纤维蛋白原、凝血酶按一定比例混合,制成软骨培养物并在体外培养。培养第3周时,取材进行Masson染色、Ⅱ型胶原寡核苷酸探针原位杂交和Ⅱ型胶原的免疫组化观察。 结果：体外培养3周,培养物内细胞大部分存活, Masson染色形成软骨陷窝,同源性细胞簇出现,细胞周围有蓝色物质环绕存在,原位杂交证实其软骨细胞表达Ⅱ型胶原mRNA,免疫组化证实软骨细胞分泌Ⅱ型胶原。 结论：用胶原蛋白和人血纤维蛋白为载体支架体外培养软骨细胞,可促进关节软骨细胞合成分泌Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是软骨组织最主要的细胞外基质成分。     

软骨细胞与异体软骨微粒脱细胞基质体外相容性的研究

目的探索以异体软骨微粒脱细胞基质为支架构建组织工程化软骨。方法多步骤酶法将绵羊关节软骨制成微粒脱细胞基质,行大体、光镜(苏木素伊红、胶原、甲苯胺蓝染色)、扫描电镜观察,同时测定微粒的胶原、氨基葡聚糖、DNA含量。异体绵羊关节软骨细胞分离、体外扩增,并与软骨微粒脱细胞基质混合体外培养0～35d,倒置显微镜及扫描、透射电镜观察,同时测定羟脯氨酸,氨基葡聚糖,DNA含量及细胞黏附率。结果软骨微粒脱细胞基质只含有基质成分,直径0.100～0.154mm,胶原,氨基葡聚糖及DNA含量分别为204.4±3.1μg/mg,18.3±2.0μg/mg和0.042±0.013μg/mg。异体软骨细胞紧紧围绕于异体软骨微粒脱细胞基质四周,二者形成的复合物中胶原、氨基葡聚糖及DNA含量于第7d与0d相比具有统计学意义(P<0.05),分别与14d(胶原、DNA)和21d(氨基葡聚糖)达高峰,随后维持在高水平。细胞黏附率为92%。结论软骨细胞与异体软骨微粒脱细胞基质有良好的生物相容性,为组织工程方法再造软骨提供又一支架材料。