PCR-SSCP快速检测耐多药结核分枝杆菌

目的:了解本地区结核病耐药基因突变情况,探讨PCR-SSCP作为新的分子药敏试验方法在临床的应用价值。方法:通过提取耐INH、RFP、SM的肺结核患者痰中结核分枝杆菌DNA,进行PCR-SSCP分析,检测结核分枝杆菌rpoB、katG、rpsL基因是否存在突变,并与传统L-J药敏实验对照。结果:30株耐多药株中,耐RPF、INH、SM基因突变阳性率为90%(27/30)、63%(19/30)、53%(16/30)。3个基因联合突变共8株(26.7%),2个基因联合突变共18株(60%),即26株(86.7%)。单基因突变共2株,2株无基因突变。结论:通过PCR-SSCP方法可检测出绝大部分耐多药结核病的耐药基因,rpoB、katG、rpsL基因突变与本地区结核杆菌对RFP、INH、SM耐药性有关。与传统L-J药敏实验对比,PCR-SSCP是一种敏感、快速的指导临床用药的先进检测方法。     

反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌3种耐药相关基因

目的:观察膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌(MTB)对异烟肼(INH)、利福平(RFP)、链霉素(SM)耐药性的效果.方法:用ropB、katG、inhA、rpsL基因的寡核苷酸探针与结核分枝杆菌PCR产物进行反向斑点杂交,并将结果与绝对浓度法药敏试验结果进行比较.结果:INH、RFP和SM的耐药基因检测灵敏度分...     

耐多药结核分枝杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的:探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制,应用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐SM和RFP耐药性测定中的应用价值。方法:采用PCR-SSCP技术对168株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测。即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因,然后进行SSCP分析。结果:以结核分枝杆菌H37RV为对照,82株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100%。86株同时耐SM和RFP的耐药株中,68株(79.1%)有rpsL基因图谱异常;81株(94.2%)有rpoB基因图谱异常。结论:rpoB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐RFP和SM的主要分子机制。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌SM和RFP耐药性。     

PCR-SSCP检测耐多药结核菌基因与细菌培养结果对比分析

目的应用PCR-SSCP检测常规及BACTEC培养耐INH、RFP、SM的耐多药结核分枝杆菌临床分离株KatG、rpoB、rpsL基因突变,分析其敏感性和特异性,评价其在检测结核分枝杆菌耐药性方面的价值和临床实用性。方法22株常规培养和8株BACTEC培养检出的高浓度及低浓度耐INH、RFP、SM耐多药结核分枝杆菌分离株,分别用PCR-SSCP检测KatG、rpoB、rpsL基因,观察其电泳条带,并与结核菌标准株H37RV对比。结果22株常规培养耐INH、RFP、SM的耐多药结核分枝杆菌分离株中,KatG、rpoB、rpsLPCR扩增产物,用SSCP分别检出KatG基因16株(72.7%)、rpoB基因19株(86.4%)和rpsL基因14株(63.6%)。8株BACTEC培养耐INH、RFP、SM的耐多药结核分枝杆菌分离株中分别检出KatG基因5株(62.5%),rpoB基因6株(75%)、rpsL基因5株(62.5%)。综合两者KatG、rpoB和rpsL基因检出率分别为70.0%(21/30)、83.3%(25/30)和63.3%(19/30)。高浓度耐药与低浓度耐药分离株中的检出率有显著差异(P<0.05),常规培养与BACTEC培养分离株中的检出率无显著差异(P>0.05),与结核菌标准株H37RV电泳条带对比,特异性为100%,敏感性97%。结论PCR-SSCP敏感、特异,可快速检测结核分枝杆菌的KatG、rpoB和rpsL基因,可用于耐多药结核分枝杆菌的临床检测。     

基因芯片检测结核分枝杆菌耐药突变基因的结果分析

目的:用基因芯片检测临床痰液标本中的结核分枝杆菌对异烟肼(INH)、利福平(RIF)、链霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)的耐药性,并评价其临床应用价值。方法:本基因芯片采用聚合酶链反应(PCR)和反向点杂交相结合的技术,快速完成异烟肼、利福平、链霉素和乙胺丁醇四个结核分枝杆菌耐药基因(katG、inhA、rpoB、rpsL、embB)突变位点的检测。同时以传统药敏试验法作对照。结果:基因芯片法对结核分枝杆菌INH耐药性检测符合率、特异性分别为82.1%、100%;对RFP耐药性检测符合率、特异性分别为94.9%、100%;对SM耐药性检测符合率、特异性分别为76.5%、100%;对EMB耐药性检测符合率、特异性分别为82.6%、100%。结论:基因芯片检测结核分枝杆菌的耐药性能满足临床的快速需要,但基因芯片法检测的抗结核药数量有限,并不能完全取代常规药物敏感性试验,因此基因芯片法可作为快速筛选有效抗结核药的补充。     

结核分枝杆菌耐药基因快速检测

目的 探讨结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)的耐药分子机制，采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)同时检测rpsL基因、rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐链霉素(SM)和利福平(RFP)耐药性测定中的应用价值。方法 采用PCR-SSCP技术对122株结核分枝杆菌临床分离株rpsL基因、rpoB基因突变同时进行检测，即首先用PCR方法同时扩增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因，然后进行SSCP分析。结果 以结核分枝杆菌H37RV为对照，48株药物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未见SSCP图谱异常。特异性为100.0％，74株同时耐链霉素和利福平的耐药株中，59株(79.7％)有rpsL基因图谱异常；69株(93.2％)有ropB基因图谱异常。结论 ropB基因突变和rpsL基因突变分别是结核分枝杆菌耐利福平和链霉素的主要分子机制。应用PCR-SSCP技术可同时快速检测结核分枝杆菌链霉素和利福平耐药性。     

耐多药结核分支杆菌基因突变在耐药性检测中的应用

目的：探讨耐多药结核病（MDR－TB）临床分离株rpoB,KatG,rpsL基因突变在耐药性检测中的应用价值。方法：采用聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）技术分析了同时耐异烟肼（INH），利福平（RFP），链霉素（SM）的多耐药临床分离株和35株药敏感株的rpoB,KatG,rpsL基因突变，结果：以结核分支杆菌H37RV为对照，35株药物敏感株的rpoB,rpsL基因SSCP图谱正常，其特异性为100％，KatG基因有2株图谱异常，特异性为94％，71株结核分支杆菌临床分离株均未发现rpoB,KatG,rps基因缺失，其PCR扩增产物SSCP分析结果表明，36株多耐药临床分离株中，32株rpoB基因图谱异常，21株KatG基因图谱异常，26株rpsL基因图谱异常，其敏感性分别为rpoB(89%),KatG(58%),rpsL(72%)，结论：结核分支杆菌耐RFP，INH，SM耐药性的产生主要是由于rpoB,KatG,rpsL基因突变所致，PCR－SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的方法之一。     

用PCR-SSCP技术检测结核分支杆菌rpoB, KatG, rpsL基因突变

目的：用PCR－SSCP技术检测肺结核患者痰及分离株结核分支杆菌rpoB,KatG,rpsL基因突变，了解耐药分子机制及探索痰标本结核分支杆菌耐RFP，INH，SM直接检测的可行性，方法：对32例耐INH，RFP，SM肺结核患者临床痰标本及30株耐INH，RFP，SM结核分支杆菌临床分离株行PCR－SSCP方法检测rpoB,KatC,rpsL基因突变，结果：32份耐多药临床痰标本中rpoB,KatG,rpsL基因扩增产物SSCP其电泳条带与结核分支杆菌标准株H37Rv电泳条带相比，基因突变阳性分别为28／32，19／32，23／32，30例结核分支杆菌临床分离株rpoB,KatG,rpsL基因突变阳性为28／30，18／30，22／30，结论：PCR－SSCP方法敏感，特异，可快速检测结核分支杆菌rpoB,KatG,rpsL基因突变，适合于临床肺结构患者痰标本耐药性的快速检测。     

广西百色地区结核分枝杆菌异烟肼耐药基因特征分析

目的：分析百色市地区结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因 KatG 、inhA 的突变特征。方法收集128例结核病患者痰液标本,采用改良罗氏培养基分离培养结核分枝杆菌,绝对浓度法检测异烟肼耐药性,提取耐药菌株 DNA ,PCR 扩增耐药结核分枝杆菌 katG 、inhA 基因序列并分析异烟肼耐药相关基因突变特征。结果分离培养出98例结核分枝杆菌,34株对异烟肼耐药,耐药率为36．7％,耐药菌株 KatG 基因突变率为44．1％（15／34）,其中315位点突变率为66．7％（10／15）,出现两个新的突变位点为279（4／15）和427（1／15）。 inhA 5位点突变率为13．3％（2／15）,inhA 16位点突变率为6．7％（1／15）,3株均为 katG 和inhA 联合突变。结论百色地区耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性产生与 katG 和 inhA 基因突变相关,检测本地区结核分枝杆菌katG 和 inhA 基因突变可预测结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性。     

浙东地区耐多药结核分枝杆菌耐药特性及分子机制研究

目的 对浙东地区耐多药结核分枝杆菌（MDR-TB）耐药性及分子机制进行研究,为治疗耐多药结核病提供理论依据。方法 收集2018 年1 月～2019 年12 月浙江东部9 家结核病定点医院临床分离的结核分枝杆菌。采用比例法检测异烟肼（INH）、利福平（RIF）、氧氟沙星（OFL）、链霉素（SM）、乙胺丁醇（EMB）、阿米卡星（AK）、对氨基水杨酸（PAS）、卷曲霉素（CM）和丙硫异烟胺（TH）对MDR-TB 的耐药性。通过基因芯片方法检测耐多药结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA 突变位点,PCR 扩增OFL 耐药的MDR-TB 的gyr 耐药基因并测序。结果 耐多药结核分枝杆菌对OFL、SM、EMB、AK、PSA、CM、TH、INH 和RIF 耐药率分别为38.1%、54.8%、28.6%、11.9%、8.3%、9.5%、13.1%、100.0%和100.0%。耐多药结核分枝杆菌的突变位点为rpoB 511（9 例）、rpoB 513（3 例）、rpoB 516（3 例）、rpoB 526（25 例）、rpoB 531（38 例）、rpoB 533（2 例）,KatG 315（71 例）,inhA-15(4 例),KatG 315 与inhA-15 同时突变（9 例）。检测到26 株gyrA 基因和2 株gyrB 基因发生突变,突变类型为Thr478Asn、Asn477Thr、Ala90Val、Ser91Pro、Asp94Ala、Asp94His、Asp94Asn 和Asp94Gly。结论 耐多药结核分枝杆菌利福平耐药以rpoB 基因531位点突变为主;异烟肼耐药以KatG 基因315 位点突变为主;MDR-TB 对喹诺酮类药物的耐药机制以gyrA 基因Ala90Val、Ser91Pro、Asp94Gly 突变类型为主。     

Molecular mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｍ）ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ,ｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｖａｌｕｅｏｆｔｈｅβｓｕｂｕｎｉｔｏｆＲＮＡｐｏｌ...     

Molecular Characterization of Drug-Resistant Beijing Family Isolates of Mycobacterium Tuberculosis from Tianjin,China

Objective Tuberculosis remains a severe public health issue, and the Beijing family of mycobacterium tuberculosis （M. tuberculosis） is widespread in East Asia, especially in some areas in China, like Beijing and Tianjin. This study aimed at determining the mutation patterns of drug-resistant Beijing strains of M. tuberculosis isolated from Tianjin, China. Methods A total of 822 M. tuberculosis isolates were screened for drug resistance by an absolute concentration method and the genotype was identified by PCR. 169 drug-resistant isolates of the Beijing family were analyzed for the potential mutations in the rpoB, katG, inhA promoter region and in rpsL, rrs and embB genes, which are associated with resistance to rifampin （RFP）, isoniazid （INH）, streptomycin （SM） and ethambutol （EMB） respectively by PCR and DNA sequencing. Results Fifty-eight out of 63 RFP-resistant isolates were found to carry the mutations within the 81-bp RFP resistance determining region （RRDR） of the rpoB gene and the most frequent mutations occurred at codon 531 （44.4%）, 526 （28.6%）, and 516 （7.9%） respectively. 16 mutation pattems affecting 12 different codons around the RRDR of rpoB were found. Of 116 INH-resistant isolates, 56 （48.3%） had the mutation of katG 315 （AGC→ACC） （Ser→Thr）, 3 （2.6%） carried S315N （AGC→AAC） and 27 （16.0%） had the mutation of inhA-15A→T. 84 out of 122 SM-resistant isolates （68.9%） displayed mutations at the codons 43 or 88 with AAG→AGG （Lys→Arg） of the rpsL gene and 22 （18.0%） with the mutations at positions 513A→C, 516C→T or 905 A→G in the rrs gene. Of 34 EMB-resistant isolates, 6 had mutation with M306V （ATG→GTG）, 3 with M306I （ATG→ATT）, 1 with M306I （ATG→ATA）, 1 with D328Y （GAT→TAT）, 1 with V348L （GTC→CTC）, and 1 with G406S （GGC→AGC） in the embB gene. Conelusion These novel findings extended our understanding of resistance-related mutations in the Beijing strains of M. tuberculosis and may provide a scientific basis for development of new strategies for diagnosis and control of tuberculosis in China and other countries where Beijing strains are prevalent.     

云南省异烟肼耐药结核分枝杆菌katG和inhA基因突变特征

目的 分析云南省异烟肼耐药结核分枝杆菌katG和inhA基因突变特征。方法 采用PCR方法对云南省异烟肼耐药结核分枝杆菌进行katG和inhA基因扩增,并将扩增产物进行基因测序后比对分析。结果 88株异烟肼耐药菌株中,耐药基因与表型药敏结果的符合率为82.95%(73/88),katG和inhA基因突变率分别为75.00%(66/88)和9.09%(8/88)。最为常见的基因突变位点为katG315(67.05%)和inhA-15(7.95%),katG315位点基因突变主要表现为Ser315Thr(59.09%,52/88)。耐多药与单耐异烟肼菌株中katG基因突变比例,差异有统计学意义(χ²=4.190,P=0.041),而inhA基因及katG315、inhA-15位点基因突变比例,差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 云南省异烟肼耐药以katG315和inhA-15基因突变为主,MDR菌株中katG基因突变率高于异烟肼单耐,目前基于基因突变的分子检测技术是检测异烟肼耐药的有效手段。     

分子线性探针技术分析四川地区结核分枝杆菌耐药情况

摘要：目的应用分子线性探针GenoType®MTBDRplus Assay（GTplus）试剂盒检测四川地区耐多药结核分枝杆菌（MTB）
株的基因型特征,并初步了解耐药结核病的流行情况。方法选取结核确诊患者105份临床标本和68株临床分离株,应
用GTplus 试剂盒检测MTB耐利福平和异烟肼相关的rpoB、katG、inhA 基因的突变,推测其对利福平和异烟肼的耐药
性。结果151例样本的GTplus结果有效,总耐药率和耐多药率分别为29.14%（44/151）和17.22%（26/151）;耐利福平和
高、低水平耐异烟肼的突变菌株分别为21.85%（33/151）、21.19% (32/151）和3.31%（5/151）;突变型以rpoB S531L、katG
S315T1和inhA C-15T为主。痰标本组的耐多药菌株比率明显高于肺外标本组。结论四川地区MTB耐药形势严峻,尤
以耐多药结核病的情况严重,耐药菌株以rpoB S531L和katG S315T1突变型为主,应推广快速分子药敏试剂盒的临床应
用,快速并提高对耐药结核病的诊断。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变与多重耐药及利福平耐药程度的相关性

目的 研究结核分枝杆菌，rpoB基因突变与多重耐药及利福平耐药程度强弱之间的关系。方法应用绝对浓度法测定58株结核分枝杆菌对4种－线抗结核药物的药敏特性，对耐利福平结核分枝杆菌的耐药谱进行分析。同时对含有核心突变区的结核分枝杆菌，rpoB基因片段进行PCR扩增和DNA测序，分析rpoB基因突变与多重耐药的关系，以及突变位点和突变性质与利福平耐药强弱的相关性。结果58株结核分枝杆菌中，利福平耐药株36株，敏感株22株。36株耐药株均存在，rpoB基因突变，其中88．9％(32／36)至少对利福平和异烟肼同时耐药。90．O％的利福平高度耐药株(18/20)与rpoB基因531位和526位密码子突变相关。密码子531位和526位各有1株双碱基突变，且均为多重耐药株。结论结核分枝杆菌，rpoB基因突变所致的利福平耐药株大部分对异烟肼耐药，因此单独检测rpoB基因突变即可初步筛选多重耐药的结核分枝杆菌；而rpoB基因的突变位点与利福平耐药程度之间具有一定的相关性。     

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌耐药性

目的：探讨耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变与耐药性的关系以及聚合酶链反应-单链构象多态性分析(poly merase chain reaction-single strand cinfomlation polymorphism，PCR-SSCP)方法的临床应用价值。方法：用PCR-SSCP方法检测58株结核分枝杆菌临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变并与常规药敏试验检测结果进行对比。结果：经常规药敏试验检测，58株结核分枝杆菌临床分离株中共有41株耐药，其中，耐异烟肼(INH)为35株，高耐药株27株；耐利福平(RFP)为31株，高耐药株24株；耐链霉素(SM)有31株，高耐药株26株。同时耐3种药物的有21株(51．2％)，耐2种药物的14株(34．1％)，单耐药株6株(14．6％)．PCR-SSCP方法对58株临床分离株katG，rpoB，rpsL基因突变的检测率为40％(23／58)，45％(26／58)，38％(22／58)，其中检出3个基因同时突变的有13株(32％)，2种基因突变的12株(29％)，1种基因突变的有10株(23．8％)．常规药敏试验与PCR-SSCP法检出结核分枝杆菌同时耐3种药物的符合率为61．9％(13／21)，检出耐2种药物的符合率为85．70k，(12／14)，检出耐1种药物的符合率为50％(3／6)．高耐药株中突变率为80．5％(62／77)，低耐药株中突变率为60％(12／20)．结论：PCR-SS-CP方法对耐2种以上药物的结核杆菌检出率较高，且耐药基因突变率随着耐药浓度增高而增高。将PCR-SSCP法与药敏试验联合应用可互相弥补，已成为临床指导用药的好方法。     

结核分枝杆菌耐异烟肼katG基因LiPA检测研究

目的利用LiPA技术检测结核分枝杆菌耐异烟肼katG基因,评价LiPA技术临床应用的可行性。方法应用比例法确定80株结核分枝杆菌临床分离株其耐药性,用katG基因PCR扩增产物进行DNA测序,然后用LiPA检测技术检测结核分枝杆菌katG基因的突变,对比3种方法的检测结果,评估LiPA检测技术的准确性。结果在80株结核分枝杆菌中,35株为异烟肼敏感株,45株为异烟肼耐药株。敏感株katG基因扩增阳性率为100％,耐药株为91．1％（41／45）。耐异烟肼茵株katG的缺失率为8．9％。41株扩增阳性耐药株中有26株检测到315位密码子的突变,分别为ACC（60．97％,25／41）,ATC（2．44％,1／41）,无突变（36．58％,15／41）。LiPA技术检测、药物敏感性试验和基因测序的结果基本一致。结论结核分枝杆菌katG基因突变的LiPA技术敏感性高,特异性强,可用于结核分枝杆菌的快速药物敏感性试验评价。     

线性探针杂交技术在广西百色地区耐药结核病检测中的应用

目的 了解广西百色地区利福平、异烟肼耐药基因的分布情况。评价线性探针杂交技术(LPA)检测耐药结核分枝杆菌的应用价值。方法 利用LPA技术与传统比例药敏试验分别检测496例结核分枝杆菌感染患者痰标本,统计出利福平、异烟肼各个耐药基因的分布情况并与传统比例药敏试验作比较。结果 LPA技术对结核病患者耐多药的检出率和传统比例药敏试验相比较差异无统计学意义(P>0.05) 。LPA技术检测耐利福平和异烟肼的灵敏度、特异度分别为97.0%、99.1%和77.8%、 99.5%,耐多药结核病的灵敏度和特异度分别为82.8%和99.8%。本地区利福平耐药基因突变频率最高的是rpoB WT8 占32.4%,其次是ropB MUT3占29.7%;异烟肼耐药基因最常见的突变是 katG WT 占46.8%,其次是katG MUT1 占43.6%。kappa一致性检验评价两种药物耐药性检测方法的kappa值分别为0.965和0.904。结论 广西百色地区结核分枝杆菌利福平的耐药基因以rpoB WT8和ropB MUT3两个位点突变为主,而结核分枝杆菌异烟肼的耐药基因则以katG WT和katG MUT1位点突变多见。LPA技术能快速、准确诊断结核分枝杆菌利福平、异烟肼的耐药性及多药耐药性,LPA技术检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性与传统比例药敏试验具有高度的一致性,LPA检测技术可以大大地缩短检测的时限,辅助临床快速诊断出多耐药的结核菌。